QBQ 2454 – Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e MetabolismoRelatório II – Proteínas: Eletroforese, Dosagem pelo método do biureto e Fracionamento Carolina Domeniche Romagna Pedro Lazzarin Marani Thiago Carita Correra N° USP: 5122141 N° USP: 5122238 N° USP: 5122026 notando-se que nem num nem noutra há citocromo c (proteína presente no interior das mitocôndrias). do Citocromo C: 10. 2) Vendo o resultado da eletroforese (anexo). e uma quantidade apreciável manteve-se sem mover-se. esta é a mancha do padrão que . A solução utilizada estava tamponada em pH 8. Houve formação de uma banda mais intensa na mesma região que há uma banda na amostra e uma banda da mistura padrão. e também a albumina. espera-se que tenha três bandas. uma que migrou para o pólo positivo (a mesma da amostra). Resultado e discussão A fita de acetato de celulose com a revelação da eletroforese onde foram aplicados da esquerda para a direita.QBQ – 2454: Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e Metabolismo IV – ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE Objetivo Executar uma eletroforese em fita de acetato de celulose e a partir dela determinar as proteínas do soro bovino. Hemoglobina e Citocromo C e sabendo seus pI’s.6. da Hemoglobina: 7. coincidente com uma da mistura padrão. choveram formações de três bandas distintas. espera-se que todas as proteínas do soro encontrassem-se migradas para o pólo positivo umas mais que outras. e a hemoglobina. poucas para o negativos. amostra. Na faixa onde foi adicionada amostra houve formação de uma única banda.9.4.1. uma que migrou bastante para o pólo positivo (albumina). Foi usada a eletroforese em folha de acetato de celulose embebida numa solução tamponada em pH 8. 1) Sabendo que todas as globulinas tem pH menor que o do tampão. Onde foi aplicado soro. Proteínas com mesma carga líquida e estruturas diferentes podem não formar bandas iguais.6. As proteínas com carga líquida positiva no pH do tampão migram para o pólo negativo. Sabendo que a mistura padrão contem albumina de soro bovino. para o positivo. da γ -Globulina é: 6. Notou-se que nem na amostra nem no soro apareceu a banda que migrou para o pólo negativo na mistura padrão. pode-se notar que há uma banda da mistura padrão que é muito parecida com a da amostra. Na faixa de onde foi adicionada mistura padrão. uma que migrou muito pouco para o pólo positivo. em teoria. já que têm carga líquida negativa no pH do tampão. houve formação de uma nuvem de proteína. umas migradas para o pólo positivo. uma que migrou um pouco para o pólo positivo (hemoglobina) e uma que migrou para o pólo negativo (citocromo c). com o corte na parte superior esquerda.4. A migração depende também da mobilidade do composto sobre o suporte. Na o se pode prever o comportamento da amostra. e uma que migrou para o pólo negativo. Introdução Esta técnica de separação e identificação de proteínas (e outros compostos) consiste na migração de íons num campo elétrico. O ponto isoelétrico da albumina é: 4. padrão e soro está em anexo. as com carga líquida negativa. temos A = K.mais migrou para o pólo positivo (albumina). b é o caminho ótico atravessada pela luz e c é a concentração molar. impedindo o uso do método. Pode-se então adotar que na amostra havia albumina de soro bovino. Como o caminho ótico depende da cubeta utilizada no espectrofotômetro e a absortividade molar será a mesma para o composto estudado3. usando um tampão com pH adequado. . o que possibilita o uso da fotometria para determinar a absorbância da amostra de proteínas simples. 3) A fim de separar as proteínas do soro sangüíneo poderia-se usar uma coluna de troca iônica. Pela lei de Lambert e Beer2. já que neste pH a grande maioria das proteínas estão com carga liquida negativa. entre outros.b. como o ensaio de fixação do verde de bromocresol e o teste de biureto. é necessário saber se a desejada. onde a é a absortividade molar do composto. haveria uma separação. mas ressalta-se que poderia haver uma outra proteína com razão carga liquida/fricção molecular semelhante. V – DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO Objetivos Esta etapa do experimento tem como objetivo a determinação da concentração de proteínas em amostras desconhecidas. Introdução Existem diversos métodos para dosagem de proteínas. que funciona como estabilizante). gerando a espécie abaixo: O R O R C C C N H N H H 2+ H Cu H H H N H N C C C C R O R O 1 C Tal reação dos íons Cu2+ em meio alcalino com os nitrogênios das proteínas produz uma coloração púrpura (absorve em 540nm). ainda que não se tenha informação acerca do tamanho das proteínas.html 3 Como a e b são constantes no experimento. Neste experimento foi utilizado o método do biureto (solução básica de sulfato de cobre e tartarato.c. Poderia-se usar também a coluna de gel.c.sherwood-scientific. seria interessante usar um gradiente para retirar frações de proteínas. que consiste numa reação colorimétrica. basta construir uma curva 1 2 Adaptado do roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp http://www. a absorbância de uma amostra será dada por: A = a. Ambos os testes estão baseados na absorbância das espécies formadas da reação dos corantes com as proteínas da solução.com/chroma/chromaoperation. já que as soluções de proteínas conjugadas possuem coloração. 2 0. Após o banho e as amostras terem voltado à temperatura ambiente (já que a absorbância também depende da temperatura) as absorbâncias foram medidas.ml .8 0.2 1. Após as amostras serem preparadas estas foram colocadas em banho-maria á 37ºC por 15 minutos para que ocorra a reação. Uma amostra sem proteína foi utilizada como branco. O coeficiente angular da regressão linear desta curva padrão será uma relação entre concentração e absorbância.20 0.4 0.0 -1 1.1842 0. Experimento Para dosar a quantidade de albumina foi construído uma curva padrão.3361 1.1427 0.25 Y = 0.05 0. o que possibilitara a dosagem de amostras uma vez que suas absorbâncias tenham sido medidas.0586 0.35 0.8 1.30 0.99837 Absorbância 0. Essa amostra tem a função de corrigir a absorbância correspondente a todas as espécies presentes na solução que não a proteína que reagiu com os íons cobre II. dando origem aos dados abaixo: Absorbância (A) C/mg.6 0.2 0.15 0.4 C/mg.23815*X R = 0. utilizando para isso diversas amostras de concentração conhecida previamente preparadas. Caso isso não tivesse sido feito.padrão de absorbância por concentração.10 0.mL-1 0.0933 0.4 0.6 0. e para tanto cinco soluções de concentração conhecida tiveram sua absorbância medida no espectrofotômetro previamente calibrado.4 0. assim obtemos somente a absorbância relativa às proteínas que desejamos quantificar. seria necessário descontar de todos os dados um b que seria: A = C*k + b O espectrofotômetro desconta o valor de absorbância obtido dessa amostra dos valores obtidos nas amostras que continham proteínas. . simplesmente comparando as concentrações obtidas com os valores obtidos de pacientes saudáveis. mas ocasionalmente poderia não passar pela origem devido aos erros experimentais ocorridos.Versão 3.mL-1 Adultos 18-60anos 35-50 >60anos 34-48 Crianças 14-18anos 32-45 4dias-14 38-54 Recém-nascidos 0-4dias 28-44 Variações na taxa de albumina no soro humano são dados importantes já que esta proteína representa 55 a 65% de todas as proteínas plasmáticas5. et al. 1990:26-29. Portanto a concentração da albumina será: C = A/K. de concentração de proteína 0 mg/mL. A absorbância da amostra desconhecida foi medida sendo 0. onde K foi obtido do gráfico anterior.mL-1 Este experimento tem sua importância na medida que através da dosagem de albumina no soro humano pode-se diagnosticar diversos quadros patológicos.0.C) e sabemos que esta é uma equação de uma reta que passa pela origem. uma curva não deve ser usada.23815 = 1. Mesmo assim. Philadelphia: WB Saunders. 2nd ed. proteinúria devida à síndrome nefrótica.2726. perda de proteínas nas fezes (doença neoplásica). 5 Manual do kit de reagentes COBAS® INTEGRA Albumin.14*4/1 = 4.2726/0. 4 Tietz NW. Por esse motivos e muitos outros a hipoalbuminemia é freqüente em muitas doenças. como a solução de concentração desconhecida foi diluída antes de ser colocada no espectrofotômetro. pois pela lei de Lambert e Beer a absorbância será linearmente proporcional a concentração (A = k. devido à amostra branco. VI – FRACIONAMENTO DE PROTEÍNAS Introdução A fim de separar proteínas um dos métodos usados é o fracionamento por “salting out”. a concentração real da solução será: C = (Cf.Resultados e discussão A curva padrão encontrada é uma reta que passa pela origem. Uma solução contendo uma mistura de proteínas tem sua força iônica alterada a fim de precipitar uma delas. o que explica sua importância farmacocinética.56 mg.mL-1 Porém. transportando e armazenando uma série de ligantes. possibilitando que tais doenças sejam diagnosticados. Clinical Guide to Laboratory Tests. retira-la e posteriormente precipitar mais uma. ed. Logo C = 0. como má-absorção de aminoácidos (doença de Crohn).14 mg. Da literatura4 temos que os valores esperados são: Idade C/mg. 05/1998.Vf)/Vi C = 1. ligando-se e solubilizando compostos e fármacos. 3602. page 138.5 ml.618 mg/ml.0 ml. .Concentração do analito: 0. devido às alterações que o meio causa nas interações da solvente proteína e proteína .Concentração do analito: 1.Volume de precipitado: 3. E 1.35 mg/ml (ver contas). usando a curva padrão feita no experimento 5.2001.5 ml. third ediction. E 0. 6 Voet. adicionou-se cinco mililitros de solução saturada de sulfato de amônio a fim de obter uma solução 50% do sal. 2.5 ml.Volume de precipitado + solução de NaCl 2%: 7.202 mg/ml.202 = m/4 m = 4.2864. E 0.1510. Isto ocorre pois diferentes proteínas respondem ao aumento da força iônica de formas diferentes. A γ -globulina tem massa próxima à do dímero de albumina de soro6. O sal usado geralmente é o sulfato de amônia devido à sua capacidade de formar soluções de alta força iônica.Concentração da solução 2: 9.Volume de precipitado + Solução de NaCl 2%: 8. E 3. 5. 3. 2004.76 mg de globulina. Daí obteve-se uma concentração de proteína no precipitado centrifugado de 16.0714 mg/ml.0 ml.5/0.Absorbância excetuando-se o branco: 0. 3.proteína. 7. A solução final tem 4 ml. e portanto numero de resíduos comparável com a albumina. foram adicionados outros seis e meio mililitros de solução saturada de sulfato de amônia.76 / 5 C = 16. 2. 6.5 ml. C = m/V C = 81.2382*C.concentração da solução 2: 5. Wiley international edition.Absorbâncias excetuando-se o branco: 0. Aos demais seis e meio mililitros de sobrenadante.35 mg/ml Notar que para que a consideração de que a absorbância desta solução pode se referir à concentração conforme a curva padrão feita no experimento 5 seja valida é necessário considerar que esta tem numero de ligações peptídicas comparável.8400 mg/ml.etc. Experimento Aos cinco mililitros de soro que foram disponibilizados. 6.0 ml. Cálculo: Da concentração de analito: C = m/V 1. Donald.809 mg de globulina. Biochemistry.35 mg/ml. Figure 6-10.Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0. Ajuste do volume: Os 8. Após a segunda centrifugação o precipitado foi solubilizado em cinco mililitros de solução 2% de NaCl e foi analisado com o mesmo método a quantidade de albumina.5)*4.809 m = 81. Esta era a massa de globulina presente nos 5ml de soro iniciais. 1. A solução final tem 4 ml.Volume de precipitado: 2.Equação do experimento V: A=0.5 mL têm a mesma concentração: m = (8. Após a primeira centrifugação o precipitado foi diluído em cinco mililitros de solução de NaCl 2% com esta solução foi feita a analise quantitativa por meio do método do biureto considerando que no precipitado havia apenas uma proteína com o numero de resíduos similar ao da albumina.Volume de solução usada para preparar a solução de biureto para analise: 0. 4.Concentração de globulina na solução: 16.Equação do experimento V: A=0. Esta precipitação depende também da temperatura. 5. 7.2382*C. 4. 8.6339 mg/ml. 1. 5 ml: C = m/V 0. Resultados e Discussão 1) a. Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais.902 mg/ml. mas os resultados foram diferentes.6339 = m/4 m = 2.8.536 m = 35. uma com 0.10 mg/mL e a segunda.10 + 4. vemos que numa solução de força iônica igual a 8.10 mg/ml Da concentração de analito para 1 mL: C = m/V 0.5 mL) forneceu concentração inicial de 7. a solubilidade de mioglobina é aproximadamente igual a 7.Concentração da albumina no soro: 5.0/1)*3.5 ml de solução e uma de 1 mL já que não era sabido qual delas seria compatível com a curva padrão feita no experimento 5.536 mg de albumina. log s ~ 0. (media) Calculo: Da concentração de analito para 0. portanto. portanto a curva padrão se aplica sem aproximações.70)/2 C = 5. Em não se sabendo qual é o dado correto fez-se uma media entre eles. C = m/V C = 23.09 mg/ml Notar que este precipitado continha albumina.5)*2.3602 m = 23. de 4.08 g/ml.3602 mg de albumina. No entanto as duas forneceram pontos na curva.52 mg de albumina. C = m/V C = 35.0/0.70 mg/mL. Esta era a massa de albumina presente nos 5mL de soro iniciais. a primeira (0. Ajuste do volume: Os 7 mL têm a mesma concentração: m = (7. Ver figura: bAnalisando o gráfico. não pode ter . A fim de facilitar foram feitas duas soluções de biureto com o precipitado da centrifugação.52 / 5 C = 4.50 mg de albumina.8400 = m/4 m = 3. shemoglobina ~ 1. Ajuste do volume: Os 7 mL têm a mesma concentração: m = (7.Segundo o gráfico.70 mg/ml Media: C = (7.1 portanto.26 g/ml.50 / 5 C = 7. Tietz NW.8 pH aHá um mínimo das curvas num pH entre 5. 2000. Biochemistry.5 1. 2) O gráfico abaixo foi construído com os dados do roteiro: NaCl 1mM NaCl 5mM NaCl 10mM NaCl 20mM 3. O efeito da diminuição da solubilidade da proteína com a variação do pH havendo um mínimo de solubilidade é chamado de precipitação isoelétrica. 2004.4 (aproximadamente 5. bEste pH é o ponto isoelétrico onde a solubilidade de proteínas em meios com sais tem um mínimo pois em pH’s acima e abaixo dele elas têm carga liquida diferente de zero mas neste ponto sua carga liquida é zero. a solubilidade da proteína aumenta com o aumento da concentração de sal. Principles of Biochemistry. pois o pI da β -lactoglobulina é 5. já que uma solução com esta concentração foi diluída para obter aquela.0 2. 5. menos solúvel em solução de solvente polar e soluto iônico ela será. Third Edition. Voet. que solvatariam um maior número de moléculas de proteína. Lehninger.8 5.5 0. Table 5-6. cNum mesmo pH.0. um mínimo de solubilidade. O que já era esperado.0 0. 05/1998. pois quanto mais próximo o pH está do pI menos carregada estará a proteína.0 5.Roteiro experimental da disciplina DB-105 (Bioquímica) Unicamp 2. Principles of Biochemistry. Manual do kit de reagentes COBAS® INTEGRA Albumin. Third Edition. page 135 . Bibliografia 1.sherwood-scientific. pois a concentração de mioglobina é necessariamente menor que 3.2 e 5.0 4. e. http://www.27. 1990:26-29.html 3. portanto. et al.0 1. portanto. Third Ediction. 2nd ed.5 g/ml. Clinical Guide to Laboratory Tests.26). 4.Versão 3. O fenômeno observado poderia ser diferente se fossem estudadas concentrações menores.5 -1 Solubilidade/mg. Donald.4 5. 2000.2 5.havido precipitação.com/chroma/chromaoperation. aumentando a sua solubilidade. Wiley international edition.mL 2. Worth Plublishers. 6. Essa interação entre as duas substâncias faz com que hajam mais moléculas de solvente livres. dO efeito em que em soluções mais ricas em sal a solubilidade de proteínas é maior é chamado “salting in” e consiste em aumentar a solubilidade de uma proteína pela adição de um composto iônico devido à interação entre a proteína e o composto iônico. Representando um mínimo de interação com o sal e. Philadelphia: WB Saunders. ed.6 5. Worth Plublishers 7 Lehninger. Quím. p. Nova. Nov. ZAIA. vol. Determination of total protein by spectrophotometry: advantages and disadvantages of proposed methods. ZAIA..787-793 . Dimas A. no. and LICHTIG.6. Jaim. M.21. 1998. V./Dec.7. Cássia Thaïs B.