Curso de BiologiaBioquímica 2012/2013 Polifenoloxidase Turma 10 ...........5 Tabela 7 ...........................................8 Reação F – Efeito da temperatura (Ver Tabela 6 dos Resultados)....................6 Reação C – Especificidade para o substrato (Ver Tabela 3 dos Resultados)...............................................Reação C – Especificidade para o substrato..........8 Reação G – Efeito do pH (Ver Tabela 7 dos Resultados)........................................................................................................................Reação A – Ação da polifenoloxidase..........................Reação G – Efeito do pH..................4 Tabela 3 ................. 11 2 .....................................................4 Tabela 4 .........................................5 Discussão/Conclusão.........................................................................................................................................................7 Reação E – Efeito da concentração do enzima (Ver Tabela 5 dos Resultados).. 3 Resultados...4 Tabela 6 ....................................4 Tabela 2 ..........................................................Reação F – Efeito da temperatura................................. 4 Tabela 1 ........................Índice Índice........... 6 Reação A – Ação da polifenoloxidase (Ver Tabela 1 dos Resultados).........................................................................Reação B – Natureza química da polifenoloxidase..................................7 Reação D – Efeito da concentração do substrato (Ver Tabela 4 dos Resultados)..................9 Bibliografia....................................Reação E – Efeito da concentração do enzima..................................................................6 Reação B – Natureza química da polifenoloxidase (Ver Tabela 2 dos Resultados)...............4 Tabela 5 ............................Reação D – Efeito da concentração do substrato......................................................................... 2 Resumo................................................. entre outros fatores. Neste trabalho experimental. realizaram-se vários ensaios com a principal finalidade de observar.Resumo As polifenoloxidases vegetais são as enzimas responsáveis pelo escurecimento de certos produtos vegetais. a ação destas enzimas sobre um substrato o catecol (um difenol) e verificar a influência de alguns fatores na atividade das mesmas. 3 . o facto de um enzima ter um pH e uma temperatura ideal de funcionamento e sempre que as condições são diferentes das condições ideais o enzima reduz a sua atividade ou desnatura. por exemplo. o que nos permitiu chegar a diferentes conclusões a cada ensaio realizado como. Resultados Após a realização do procedimento experimental podemos observar várias alterações no aspeto e cor das soluções contidas nos tubos de ensaio.Reação E – Efeito da concentração do enzima Tubo de Ensaio E1 E2 Composição Extrato + Catecol Extrato + Água + Catecol Inicial Laranja escuro Laranja claro Cor Depois da incubação Vermelho tijolo escuro Laranja escuro 4 .Reação B – Natureza química da polifenoloxidase Cor Adição de catecol Tubo de Ensaio Composição B1 Extrato + Catecol Laranja escuro ________ B2 Extrato + TCA Branco opaco Branco opaco Branco opaco B3 Extrato + Cristais de Feniltioureia Branco opaco Branco opaco Branco mais opaco Inicial Depois da incubação Vermelho tijolo escuro Tabela 3 . alterações essas que se encontram registadas nas tabelas seguintes: Tabela 1 .Reação C – Especificidade para o substrato Tubo de Ensaio C1 C2 C3 Cor Composição Extrato + Catecol Extrato + Fenol Extrato + Hidroquinona Inicial Laranja escuro Creme Depois da incubação Vermelho tijolo escuro Laranja Creme Laranja Tabela 4 .Reação D – Efeito da concentração do substrato Tubo de Ensaio D1 D2 D3 Composição Catecol + Água Catecol + Água Catecol + Água Inicial Incolor Incolor Incolor Cor Adição de Extrato Creme claro Creme Creme escuro Depois da incubação Vermelho tijolo claro Vermelho tijolo Vermelho tijolo escuro Tabela 5 .Reação A – Ação da polifenoloxidase Tubo de Ensaio A1 A2 A3 Cor Composição Inicial Laranja escuro Creme Incolor Extrato + Catecol Extrato + Água Água + Catecol Depois da incubação Vermelho tijolo escuro Creme Incolor Tabela 2 . Reação G – Efeito do pH Tubo de Ensaio G1 G2 G3 G4 Composição HCl Tampão acetato Tampão de fosfatos Tampão Tris Incolor Incolor Cor Adição de catecol e extrato Esbranquiçado Creme Incolor Laranja escuro Vermelho tijolo escuro Incolor Vermelho tijolo Castanho Inicial Depois da incubação Esbranquiçado Creme escuro 5 .Tabela 6 .Reação F – Efeito da temperatura Cor Adição de catecol à mesma temperatura Tubo de Ensaio Composição F1 Extrato a 0ºC Creme Creme escuro F2 Extrato a 37ºC Creme Vermelho tijolo F3 Extrato a 70ºC Creme claro Creme escuro turvo Inicial Depois da incubação Vermelho tijolo escuro Vermelho tijolo escuro Creme escuro turvo Tabela 7 . semelhante ao que havia acontecido em A2. mesmo após a incubação. de certa forma. foi possível inferir a ação básica do polifenoloxidase sobre o catecol. uma vez que estávamos perante uma diluição do extrato em água. a reação que ocorreu no tubo A3 resultou na permanência da cor que era visível inicialmente. A cor era assim oriunda do extrato. o facto de o extrato ter permanecido num banho de gelo (aproximadamente 0ºC) durante toda a atividade laboratorial teve como objetivo a inibição do polifenoloxidase. Quanto ao tubo A2. Os tubos A2 e A3. a incubação a 37ºC provocou a intensificação da atividade enzimática. A atividade permitiu tirar conclusões relativas ao comportamento do polifenoloxidase em diversas situações: Reação A – Ação da polifenoloxidase (Ver Tabela 1 dos Resultados) Relativamente ao tubo A1. Outro ponto a salientar é o facto de a incubação ter sido a 37ºC. No entanto. Além disto. o que se traduziu num aumento da formação de quinonas e na intensificação da cor para um tom vermelho tijolo escuro. este tubo apenas continha catecol e água. contendo polifenoloxidase ao catecol permitiu que a reação tivesse início de imediato. portanto. Resumindo. o que.Discussão/Conclusão Antes de apresentarmos as conclusões acerca das reações e dos resultados. quer o catecol. teve como resultado a formação de quinonas e a consequente aquisição de uma cor laranja escura da solução. a junção do extrato enzimático (de tom creme). cujo tom em condições normais era creme. consideramos oportuno esclarecer o procedimento levado a cabo para a preparação do extrato enzimático. pois é precisamente a esta temperatura que a atividade da enzima em estudo é máxima. apesar de se encontrar à temperatura ambiente. funcionaram como controlo já que permitiram observar a não ocorrência de uma reação quando quer o extrato enzimático. na reação A. 6 . A adição do fluoreto de sódio ao extrato visou ajudar a retirar o enzima do mesmo. Por fim. a cor inicial pouco se alterou com a incubação. eram adicionados à água e incubados a 37ºC. visto que. Este resultado já era esperado. na medida em que a reação só se deu com este substrato e os resultados na presença de água foram negativos. O erlenmeyer também permaneceu durante toda a atividade coberto com papel de alumínio para evitar a desnaturação da proteína pela luz. o que assegurou de certa forma a viabilidade e aceitação ou não dos nossos resultados. observou-se que a reação entre o extrato e o ácido tricloroacético (TCA) determinou a mudança da solução para uma cor branca opaca. um tom vermelho tijolo escuro. De seguida. Isto permite assim considerar a feniltioureia como uma substância inibidora da atividade enzimática. um resultado positivo. quando inicialmente era creme revela. Além do que foi anteriormente dito. como controlo positivo. a ação do enzima (polifenoloxidase. embora tenha sido pouco visível. Servindo então. A incubação a 37ºC apenas intensificou a inibição referida. analogamente ao que se verificou no tubo B2. e depois da incubação. uma vez que a desnaturação é irreversível. Este acontecimento foi provocado pela desnaturação dos enzimas do extrato como consequência do seu contacto com o TCA. Além disto. Servindo.Reação B – Natureza química da polifenoloxidase (Ver Tabela 2 dos Resultados) No tubo B1. já que a cor se tornou mais opaca. Relativamente ao tubo C3. Em relação ao tubo B2. presente no extrato) sobre o seu substrato (catecol) e o aumento da sua eficiência a 37ºC. este tubo. era de esperar que os resultados fossem iguais. Assim. confirmou mais uma vez os resultados obtidos nos tubos A1 e B1. no tubo B3. como era esperado. No entanto. cessando a sua atividade catalítica. de novo. a reação entre o extrato e os cristais de feniltioureia originou um precipitado em suspensão que concedeu uma cor branca opaca à solução. o polifenoloxidase não catalisa apenas a oxidação aeróbia de difenóis. seria de esperar a ocorrência de uma reação. sabendo que tinha na sua composição o mesmo que o tubo A1. a visualização de um tom laranja após a incubação. ou seja. a intensificação da cor também se poderá ter dado devido ao espaço de tempo e à agitação que permitiram uma ação mais eficiente por parte dos cristais. isto é. De qualquer forma este resultado é considerado positivo. verificar que é de facto uma enzima que desnatura na presença de um ácido (como é o caso do ácido tricloroacético) e que reage como seria de esperar com uma substância inibidora da atividade enzimática (cristais de feniltioureia). a sua incubação a 37ºC não alterou este resultado. Concluindo. Finalmente. novamente como controlo positivo. Daqui se depreende que o polifenoloxidase desempenha a sua 7 . a reação B permitiu verificar a natureza química do polifenoloxidase. Deste modo. que de facto aconteceu. refletindo assim a presença de partículas em suspensão. no tubo C2. foi notada a alteração da cor creme inicial – resultante da junção do extrato enzimático com o fenol – para um laranja depois da incubação. este tubo. mas também a hidroxilação de vários monofenóis. Reação C – Especificidade para o substrato (Ver Tabela 3 dos Resultados) O tubo C1. isto mesmo foi verificado e a reação entre o extrato enzimático e o catecol originou uma cor laranja escura inicialmente. Isto pode ser explicado pelo aumento da quantidade de extrato (o dobro em relação ao catecol) que provocou uma reação mais eficiente do que as outras. Todavia. não só sobre difenóis e monofenóis. averiguou-se. por um lado. por outro lado. tubo D3: 2mL de catecol. Esta 8 . Resumindo. uma crescente concentração de catecol (substrato) originou um gradiente de escurecimento das soluções como consequência de uma formação mais eficiente de quinonas. tubo D2: 1mL de catecol. No tubo E2. por último o tubo D3 foi o que produziu maior número que quinonas o que era esperado visto que era o tubo que possuía maior quantidade de substrato. diluições) e. como já era esperado. novamente.atividade enzimática. o procedimento seguido e o consequente aumento da quantidade de catecol e decréscimo da quantidade de água de D1 para D3 (tubo D1: ≈ 0. O tubo D1 visto que era o que possuía menos quantidade de substrato formou claramente menos quantidade de quinonas. ou seja. a temperatura ótima para o funcionamento do polifenoloxidase. além de ter sido colocada uma quantidade menor de extrato. O tubo D2 já produziu maior quantidade em relação ao anterior devido ao aumento da quantidade de substrato. a cor inicial não era tão forte quanto à do tubo E1. podemos observar não uma divergência quanto à coloração das soluções mas sim em relação à sua intensidade de cor. Reação E – Efeito da concentração do enzima (Ver Tabela 5 dos Resultados) Quanto ao tubo E1. Reação D – Efeito da concentração do substrato (Ver Tabela 4 dos Resultados) Nesta reação. mesmo à temperatura ambiente. Aquando da incubação do tubo a 37ºC. a existência de reação entre o extrato e o catecol e a passagem de laranja escuro para vermelho tijolo escuro. resultante da junção do extrato e do catecol é invulgar. decorreu normalmente: a atividade enzimática aumentou e surgiu uma cor vermelho tijolo escura.05mL de catecol. a solução foi ainda mais diluída graças à adição de água. mas também sobre outras espécies químicas. tendo em conta. comparativamente aos outros tubos que continham apenas estas duas componentes. o objetivo encerrado nesta reação foi cumprido e foi possível observar-se o efeito da concentração do enzima. uma cor tão escura inicialmente. a persistência de 4mL de solução em cada tubo. a reação. Relativamente à reação E. em relação à reação D. Assim. Concluiu-se então que uma maior concentração provoca uma catálise enzimática mais eficiente e portanto uma maior velocidade na formação dos metabolitos. tendo passado de um laranja claro para um laranja escuro que marcava a presença de quinonas numa concentração bastante inferior ao que havia acontecido anteriormente. o tubo F3 foi colocado durante um curto espaço de tempo numa incubação a 70ºC. ficando grande parte dos enzimas inibidos até que a temperatura aumente. no início. 9 . o enzima voltou a um estado ativo e transformou o substrato em quinonas que concederam à solução o tom vermelho tijolo escuro característico. na reação F. como já havia sido descrito anteriormente. consequência de uma reação muito pouco eficiente entre o polifenoloxidase e o catecol. Quando o catecol foi adicionado ao extrato. Quando se juntou o catecol a cor ficou ligeiramente mais escura e turva. conduziu à alteração da primeira cor para um creme escuro. foi possível concluir que aos 0ºC e a temperaturas baixas a atividade enzimática diminui drasticamente. se a temperatura aumentar demasiado. à temperatura ambiente a reação foi mais rápida de E2 (mais diluído). Assim. como foi o caso. A inibição parcial causada pela baixa temperatura foi eliminada a partir do momento em que o tubo foi incubado e à medida que se foi dando o aquecimento até aos 37ºC. produziu igualmente um resultado positivo. passando por A1. tendo a reação findado com uma solução de tom creme escuro turvo. Por fim. Aos 37ºC a atividade enzimática é máxima. Segundo os nossos dados. A permanência da solução a esta temperatura de incubação durante algum tempo originou um tom igual ao que havia aparecido no tubo F1 após esta etapa da reação. por exemplo. ainda a esta temperatura. A coloração creme oriunda do extrato. a atividade do polifenoloxidase a esta temperatura. a colocação do extrato no banho de gelo. grande parte dos enzimas desnaturam e nunca mais retornam à sua conformação funcional. deu-se uma pequena reação que.afirmação baseia-se na comparação não só dos resultados obtidos nos tubos E1 e E2. Trata-se portanto de uma inibição reversível. até aos 70ºC ou mais. até E1 (solução com uma maior concentração de extrato enzimático). contudo. o efeito da temperatura foi facilmente determinado com base nos resultados que foram obtidos. Ao fim deste tempo. e portanto a aproximadamente 0ºC. verifica-se que. um pouco inesperadamente. A incubação a 37ºC não surtiu qualquer efeito positivo ao nível da formação de quinonas. o tubo F2 que foi mantido a uma temperatura constante de 37ºC. por exemplo. Concluindo. mas também no tubo A1. revelando. verificámos que a cor creme natural do extrato havia dado lugar a um creme mais claro (devido à desnaturação de alguns enzimas). de um tom creme do extrato enzimático. sendo esta temperatura a mais favorável para a catálise. rapidamente deu origem a um vermelho tijolo quando foi adicionado o catecol. levou à visualização. De seguida. É portanto uma inibição irreversível. Reação F – Efeito da temperatura (Ver Tabela 6 dos Resultados) Em relação ao tubo F1. No entanto. já que a solução adquiriu um tom creme escuro. surgiu um tom castanho que demonstra a formação de quinonas e que confirma os efeitos quer do pH. tal com em G2. a formação de quinonas mas. Os resultados obtidos foram bastante positivos e comprovaram que a atividade enzimática é favorecida por níveis de pH mais básicos. continha uma solução incolor de HCl. desta vez. tampão acetato (pH ≈ 5). à temperatura ambiente o pH favoreceu mais a atividade do polifenoloxidase. Da incubação que se seguiu. tampão de fosfatos (pH ≈ 7) e tampão Tris (pH ≈ 9). O tubo G1. Findando as conclusões que inferimos acerca desta atividade laboratorial encontra-se a reação G que tinha o intuito verificar o efeito do pH sobre os enzimas e a sua atividade. todos os seguintes tubos possuem igualmente. Numa ordem crescente de pH. O aquecimento a 37ºC alterou de forma visível o resultado inicial. No tubo G2. à temperatura ambiente. isto deve-se à desnaturação irreversível que o enzima sofreu devido ao pH ácido da solução de HCl. deu lugar a um tom vermelho tijolo escuro no exato momento em que foram acrescentados o extrato e o catecol. de novo. A surgida cor laranja escuro revela. Finalmente. que também se verificou com o tampão Tris. e do tubo G4: com as mesmas concentrações de enzima e substrato. o constante tom incolor dos tampões usados. permite concluir que estes últimos desempenham uma papel mais positivo e determinante na atividade enzimática. que esta temperatura torna a reação mais extensa e mais eficiente na catalise enzimática do polifenoloxidase. Esta dedução advém da comparação dos resultados do tubo A1. por exemplo. sendo bastante prejudicada por níveis fortemente ácidos. o tom incolor do tampão de fosfatos foi modificado pela adição do catecol e do extrato. De seguida. seguiu-se a incubação à temperatura habitual. as mesmas proporções de extrato e catecol foram sujeitas a quatro diferentes reações com quatro reagentes distintos nas mesmas quantidades (2mL): solução de HCl (pH ≈ 1). além das quantidades equivalentes de extrato enzimático e catecol que. A reação inicial entre estes três reagentes conduziu à observação de uma cor esbranquiçada na solução. No fim do espaço de tempo destinado a esta etapa. aliás. quer da temperatura na catálise enzimática. mais uma vez. uma comparação entre a temperatura ótima de funcionamento dos enzimas e os níveis de pH mais favoráveis.Reação G – Efeito do pH (Ver Tabela 7 dos Resultados) As reações finais visavam a observação dos diferentes acontecimentos nas soluções consoante ocorria a variação do pH. verificou-se que a cor se mantinha. Relativamente ao tubo G3. Além disto. 10 . A última cor vermelha tijolo escura que apareceu após a incubação a 37ºC provou. Daqui se infere que a reação foi bastante positiva e que o tampão Tris tornou a catalise enzimática extremamente eficiente mesmo à temperatura ambiente. o tom incolor inicial do tampão acetato passou a creme aquando da junção do catecol e do extrato. revelando uma reação muito fraca entre a enzima e o seu respetivo substrato. 11 . Bibliografia M. Acta Biol. Gulewicz. Lieberei. T. Aniszewskl. C. K. Webb. 2008. Crac. Longman: London. Enzymes. E. 1979. R. Bot. 3rd ed. 7–18. Ser. Dixon. 12 . 50..