PROTEÍNAS: Reações de coloração e precipitação

UNESP FACULDADE DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA FCT – Campus de Presidente PrudenteUnesp Relatório de Bioquímica PROTEÍNAS: REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO Discentes: Gabriela Bitto de Oliveira José Carlos de Oliveira Junior Tamara Murisugi de Oliveira Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva Disciplina: Bioquímica Curso: Engenharia Ambiental 2° ano Presidente Prudente, 24 de março de 2010 Índice Introdução ..............................................................................................................................2 Objetivos .................................................................................................................................5 Matérias Utilizados e Metodologias .....................................................................................6 Resultados e Discussões .........................................................................................................8 Conclusão ..............................................................................................................................11 Bibliografia ..........................................................................................................................12 Presidente Prudente, 24 de março de 2010 1 1. INTRODUÇÃO As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas. Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. São os constituintes básicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as proteínas correspondem a cerca de 80% do peso dos músculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas estão presentes. A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas e capacitam aos organismos a construção de outras moléculas - proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que são necessárias para a vida. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto, torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. A purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas. Reações de Coloração de Proteínas Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos. Algumas reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na composição das proteínas, por exemplo: reação xantoproteíca (tirosina, triptofano e fenilalamina), reação de Millon (tirosina), reação de HopkinsCole (triptofano), reação de Sakaguchi (arginina), etc. Estas reações, são importantes tanto na detecção como na dosagem de aminoácidos e proteínas. Outras reações, mais importantes, são aquelas chamadas de gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, ou seja, grupo amino e ligações peptídicas. Teste com a Ninhidrina A reação da ninhidrina é usada na detecção de aminoácidos por ser característica da função Presidente Prudente, 24 de março de 2010 2 amina primária. A ninidrina é um poderoso agente oxidante que reage com -aminoácidos, entre pH 4 e 8, originando um composto de cor púrpura, que não apresenta sempre a mesma intensidade de coloração. Os aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções, pois apresentam coloração amarela. Reação do Bureto A reação do biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Este é o caso do biureto que dá reação positiva e de onde provém o nome da mesma. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão uma coloração violeta característica. Precipitação de Proteínas com Desnaturação As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a conseqüente alteração de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária. A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc. A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caraterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos biológicos para análise de componentes não protéicos. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 3 Precipitação por Ação do Calor A estrutura terciária de uma proteína é mantida por interações hidrofóbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glóbulo protéico, pelas atrações iônicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas ou ainda pelas Forças de Van der Waals. Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo proteínas, atrações entre os radicais são desfeitas e a proteína é "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto é que leva à desnaturação. Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides Determinados agentes, como os reagentes para alcalóides podem ser usados na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion. Precipitação por Reação com Sais de Metais Pesados A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre e zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os aminoácidos ácidos e estes metais. A proteína precipita porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Precipitação por Ação de Solventes Orgânicos A adição de solventes orgânicos, como o etanol, éter etílico e acetona, às soluções aquosas de proteínas pode levar à precipitação das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. Solventes orgânicos em baixas temperaturas (0º C ou menos) são úteis para a separação de misturas protéicas, porque as proteínas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturação. Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgânicos podem levar à desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica. A água tem uma alta constante dielétrica, assim a força de atração entre moléculas protéicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a interação proteína-água em vez da interação proteína-proteína. A adição de solventes, pode inverter esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas protéicas. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 4 Solubilização (Salting In) Efeito da Força Iônica sobre a Solubilidade das Proteínas A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas, é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como na valência de cátions e ânions que formam o sal. Em concentração reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado “salting-in”, provavelmente devido à interação da proteína com os sais causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto, aumentando a solubilidade. Precipitação (Salting Out) Reações de Precipitação sem Desnaturação As proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por ação de solventes orgânicos, como foi explicado anteriormente, variação do pH e por alterações da força iônica do meio. A variação do pH pode ser usada para precipitar proteínas no seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima. Este efeito é denominado de “saltingout”. As proteínas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas características estruturais nativas por uma variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico. 2. OBJETIVOS • Caracterizar a presença de proteínas em material biológico. • Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação. • Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de proteínas. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 5 3. MATERIAIS UTILIZADOS E METODOLOGIAS Experimento 01 - Reações de Coloração de Proteínas Reação da ninhidrina Inicialmente, numerou-se dois tubos de ensaio, acrescentando-se no primeiro 2ml de solução de ninhidrina com 5 gotas de proteínas. Enquanto que no segundo tubo, foram colocadas 2ml de solução de ninhidrina com 5 gotas de glicina. Ambos os tubos foram aquecidos na chama do bico de bunsen por dois minutos com agitação contínua. Reação do biureto Foram numerados três tubos de ensaio, sendo que no primeiro colocou-se 1ml de solução de proteínas, 5 gotas de NaOH, 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Enquanto que no segundo acrescentou-se 1ml de solução de glicina com 5 gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Já no terceiro tubo, misturou-se água destilada com 5 gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Em todos os tubos foi observada a mudança de coloração das soluções. Experimento 02 – Reações de precipitação de proteínas com desnaturação Reação de precipitação por aquecimento Colocou-se 2ml de solução de proteínas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Reação de precipitação com reagentes para alcalóides Em um tubo de ensaio, colocou-se 1ml de solução de proteínas e de ácido tricloroacético a 10% (TCA). Reação de precipitação com sais de metais pesados Adicionou-se 1ml de solução de proteínas e 1ml de acetato de chumbo a 5%. Reação de precipitação por ação de solventes orgânicos Em um tubo de ensaio acrescentou-se 1mL de solução de proteína e 2mL de álcool etílico. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 6 Experimento 03 – Reações de precipitação sem desnaturação Efeito da força iônica sobre a solubilidade da ovoglobulina “Salting – in” Colocou-se 3mL de clara de ovo juntamente com 2mL de água destilada em um béquer pequeno. Tal solução foi agitada com um bastão de vidro até o aparecimento de um precipitado . Em seguida, adicionou – se solução de cloreto de sódio – cerca de 30 gotas - até redissolução do precipitado. “Salting – out” Com o auxílio de uma pipeta adicionou-se 2mL da solução anterior (“salting – in”) em um tubo de ensaio. Posteriormente, acrescentou-se 2mL de solução saturada de sulfato de amônio até a percepção de um precipitado de proteínas. Então, juntou-se 4 a 6mL de água destilada. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 7 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES Experimento 01 – Reações de coloração de proteínas Reação da ninhidrina Após o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que as soluções adquiriram coloração violeta, sendo esta mais intensa no segundo tubo. Tendo em vista que tanto a glicina quanto a proteína foram utilizadas com o mesmo volume, a diferença na intensidade da coloração de ambas as amostras deve-se a maior superfície de contato do aminoácido (glicina) que contém uma maior quantidade de grupamentos amina disponíveis para reação. Porém, isso não ocorre com a proteína em função da presença de ligações peptídicas entre seus aminoácidos, diminuindo assim, sua superfície de contato. É importante ressaltar que houve erro grosseiro no fornecimento de calor aos tubos o que possivelmente influenciou a intensidade da cor. Reação do biureto Todos os tubos tiveram sua coloração inicial alterada após a adição de sulfato de cobre (CuSO4). O primeiro tubo adquiriu coloração púrpura; o segundo, azul claro e o terceiro adquiriu um tom levemente azulado. Uma vez que a reação do biureto é caracterizada por identificar a presença de proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos, no qual uma substância adicionada, o sulfato de cobre, interage com as ligações peptídicas ,pode-se concluir que a primeira amostra adquire coloração púrpura, devido a presença de proteínas. Já a segunda amostra, por conter somente aminoácidos, não adquire coloração roxa, indicando assim a ausência de ligações peptídicas nessa, a qual apresenta coloração azulada semelhante à terceira amostra que continha água destilada. Experimento 02 – Reações de precipitação de proteínas com desnaturação Reação de precipitação por aquecimento Colocou-se 2ml de solução de proteínas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Nesse experimento, a formação do coágulo branco ocorre graças ao calor que, ao provocar a Presidente Prudente, 24 de março de 2010 8 agitação térmica da molécula protéica, rompe as interações entre os átomos, afetando sua estrutura tridimensional e consequentemente, diminui a solubilidade da proteína. Reação de precipitação com reagentes para alcalóides Foi possível identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na parede do tubo logo que se adicionou o ácido tricloroacético (TCA). Nesse experimento, o sal serve como ‘ponte’/interage entre a proteína e o meio, auxiliando assim, as interações proteína-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético solução de proteínas, reduz o ph do meio, tornando positiva a carga da proteína, o que contribui para a formação de um complexo insolúvel – o tricloroacetato de proteína. Além disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a proteína e o meio. Adicionando-se o ácido, diminui a concentração de sal e a interação proteína-água. Reação de precipitação com sais de metais pesados Observou-se pequenos precipitados semelhantes a fios brancos na solução. O acetato de chumbo ,na solução protéica, dissocia-se, liberando seus cátions e torna o meio alcalino. Essa característica do meio – pH situado no lado alcalino do ponto isoelétrico das proteínas - é favorável à combinação de algumas proteínas com os cátions do sal, formando proteinatos insolúveis. Reação de precipitação por ação de solventes orgânicos Formou-se uma mistura esbranquiçada. A interação proteína-água é maior que a interação proteína-proteina devido à baixa força de atração entre as moléculas protéicas, fazendo com que a proteína se solubilize na água. Com a adição do álcool etílico (solvente orgânico) na água, ocorre sua solubilização, rompendo as interaçoes proteína-água, proporcionando a interação proteína-proteína; o fato de a temperatura estar elevada (temperatura ambiente) leva à sua desnaturação devido à quebra das pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da estrutura protéica. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 9 Experimento 03 – Reações de precipitação sem desnaturação Efeito da força iônica sobre a solubilidade da ovoglobulina “Salting – in”: Após agitação da solução de água destilada e clara de ovo, formou-se um precipitado (globulinas) semelhantes a pontos brancos na solução. Com a adição de 30 gotas de solução de cloreto de sódio, houve a redissoluçao desse precipitado. “Salting – out”: Formou-se duas fases: a de baixo era esbranquiçada e a de cima, transparente. Então, após o acréscimo de 4 a 6mL de água destilada houve a redissolução desse precipitado Tais fenômenos estão relacionados à precipitação da proteína sem que ocorra a sua desnaturação. O “salting – in” dá-se pela solubilização do precipitado elevando-se a concentração de sais no meio e também as interações proteína-água. Enquanto o “salting – out” corresponde à precipitação da proteína através da adição de sais com alta força iônica (sais higroscópicos) que ligam-se a água, havendo a predominância da interação proteína-proteína. Nesse caso, analisando-se as duas fases formadas, a primeira – esbranquiçada – corresponde às primeiras proteínas a se precipitarem, as globulinas. Já a porção transparente refere-se à água. É importante ressaltar que a precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitar diferentes proteínas é variável. 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Apesar de alguns erros grosseiros quanto à manipulação dos aparelhos, todos os resultados atingiram as características pré-estabelecidas pelos conceitos teóricos. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 11 6. BIBLIOGRAFIA Fuly , André Lopes. Roteiros de Aulas Práticas. Universidade Federal Fluminense. Rio de Janeiro, 2007. Kehl, Anderson & Langbeck, Carmem. Caracterização de Proteínas. Centro Federal de Educação Tecnológica do Amazonas. Manaus, 2008. Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006. Moreira, Ana Beatriz & Gonçalvez, Joaquim. Processos de desnaturação protéica. Universidade do Porto, 2008. Presidente Prudente, 24 de março de 2010 12