1I PARCIAL DE BACTERIOLOGIA PRACTICO VALIDO PARA LA EVALUACIÓN TRIMESTRAL COLABORACION DE LA CATEDRA DE BACTERIOLOGIA PRACTICA PARA LOS ESTUDIANTES SIN COSTO ALGUNO. ESTE DOCUMENTO PUEDE SER REPRODUCIDO SIN NINGUN PROBLEMA LEGAL “DIGALE NO A LA CORRUPCIÓN Y NO A LA COMPRA DE FOLLETOS A CAMBIO DE PUNTOS.” Nota: Cada Presidente de grupo acercarse a la secretaria para sacar copia y distribuir entre sus compañeros. 1 2 INDICE • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • INTRODUCCION. BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA. INSTRUMNETOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA PRACTICA. TOMA DE MUESTRAS. ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES SUPURATIVAS. MUESTRAS ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO. TECNICAS EN PREPARACION DE FROTIS Y SU FIJACION. METODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACION BACTERIANA. TECNICAS DE COLORACION DE LAS BACTERIAS. MEDIOS DE CULTIVOS DE USOS FRECUENTES EN BACTERIOLOGIA. FAMILIA MICROCOCACEAE. AUTOVACUNAS. FAMILIA ESTREPTOCOCACEAE. FAMILIA NEISERIACEAE. ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL (E.T.S.) CHLAMYDIAS. BACTERIAS BACILARES. COPROCULTIVO. FAMILIA VIBRIOCEAE. UROCULTIVO. HEMOCULTIVO. ANTIBIOGRAMA. REACCIONES INMUNOLOGICAS BACTERIANAS REACCIONES BIOQUIMICAS DE LA ENTEROBACTERIAS. DIAGNOSTICO DE BACTERIAS ANAEROBIAS. CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGIA. • ESPIROQUETAS (TREPONEMAS,LEPTOPIRAS Y BORRELIAS) 2 3 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS “GUIA PRACTICA DE BACTERIOLOGIA” AUTORES: DR. MIGUEL VARGAS DR. JUAN MORENO DR. ERNESTO RONQUILLO DR. EDMUNDO BUÑAY DR. CARLOS MOSQUERA DR. EDUARDO FLORENCIA DR. ROBERTO VILLACIS. DRA. JOSEFINA RAMIREZ DRA. HILDA ROSADO DRA. MARTHA GUEVARA( +) DRA. JANETT RECALDE DR. JULIO ROMERO DR. JULIO GUZMAN DR. GONZALO ZAVALA DR: EDUARDO CHANCAY LOPEZ "COORDINADOR DE LA CATEDRA" GUAYAQUIL NOVIEMBRE 1995 REVISADO Y ACTUALIZADO EN JULIO 2002 POR EL DR : EDUARDO CHANCAY L . PROFESOR PRINCIPAL DE LA CATEDRA. INTRODUCCION 3 4 Esta guía de trabajos prácticos de la Cátedra de Bacteriología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Estatal de Guayaquil, nace como una alternativa didáctica científica, a la propuesta del Rectorado de la referida Universidad de realizar un trabajo monográfico para el ascenso de Profesores Auxiliares a Profesores Agregados, y la misma se propone los siguientes objetivos: OBJETIVOS GENERALES: 1. - Aplicar los conocimientos teóricos-prácticos de la Asignatura. 2. - Ampliar los conocimientos actuales acerca de las Bacterias, y los variados métodos para su diagnóstico. 3. - Profundizar en las técnicas de Diagnóstico Bacteriológico. 4. - Describir algunos procedimientos fundamentales de la microscopía Bacteriana. 5. - Utilizar adecuadamente los métodos de aislamiento de los Cultivos Bacterianos. 6. - Demostrar técnicas específicas de tinción General y especial de las Bacterias. 7. - Usar los instrumentos adecuados en Bacteriología. 8. - Estudiar la estructura y función de las células bacterianas. 9. - Dar instrucciones específicas sobre Bioseguridad. 10. - Seleccionar Material adecuado como: Audiovisuales, Gráficos y variadas preguntas de evaluación. 11. - Describir técnicas actuales sobre Inmunología Bacteriana. 12. - Conocer e identificar los Diferentes Medios de Cultivos Utilizados en Bacteriología. La referida guía contiene varios procedimientos y técnicas comunes. Además se ha incluido gráficos, dibujos y varias preguntas para evaluación formativa. Así mismo, al final de cada capítulo se ha incluido una pequeña bibliografía para el estudiante que desee obtener una información adicional sobre los principios y fenómenos descritos. Pretendemos al mismo tiempo la ambición de aplicarlo a nuestra Facultad, aún en las crisis económica que incide en la adquisición de los recursos materiales que se necesitan para desarrollar nuestro trabajo. Intentamos por lo tanto clarificar y difundir un nuevo enfoque paradigmático en los procesos de Enseñanza-Aprendizaje en forma sencilla, pero apoyados en el avance de la ciencia y la tecnología Educativa Superior. Dr. Eduardo Chancay López COORDINADOR DE LA CATEDRA DE BACTERIOLOGIA AUTOR:DR EDUARDO CHANCAY L 4 5 BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA La Facultad de CC.MM. No tiene ningún estudio acerca de las enfermedades ocasionadas por las prácticas que nuestros estudiantes y docentes realizan a diario en las diferentes cátedras en las que utilizamos materiales de alto riesgo, sea éste: Químico, Físico, Biológico, Humano e infeccioso. Es por esta razón que nuestra Cátedra incorporará desde la presente guía, éste capítulo de Bioseguridad en Microbiología, con el objetivo de: 1. - Conocer y Aplicar el concepto y los principios de BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA. 2. - Dar una serie de normas para la manipulación correcta de agentes infecciosos, que los Profesores Auxiliares y estudiantes realizaremos durante todo el año lectivo. DEFINICION.La Bioseguridad es la disciplina que se ocupa de la Prevención de Riesgo Biológico en personas, directa o indirectamente expuestos al mismo, producto de un trabajo de manipulación de agentes infecciosos. Las medidas de Bioseguridad recomendada para los que trabajan con gérmenes patógenos están encomendadas a la Seguridad General y a la Particular de nuestros estudiantes y docentes. PRINCIPIOS DE LA BIOSEGURIDAD.La Bioseguridad consta de tres principios básicos, para garantizar el aislamiento o contención adecuada de los agentes infecciosos (Bacterias en nuestro caso). Las mismas son: a.- Técnicas y Prácticas correctas en el laboratorio. b.- Equipos de Seguridad. C.- Diseño adecuado de las instalaciones del Laboratorio. a.- TECNICAS Y PRACTICAS.Es el elemento más importante para la Bioseguridad y tiene el mayor peso en la Prevención Eficiente del Riesgo Biológico y recoge los procedimientos básicos del trabajo prácticas de Higiene Personal y la conducta que deben observar los docentes y dicentes b.- EQUIPOS DE BIOSEGURIDAD.A los equipos de seguridad se los denomina también “Barreras primarias”, ya que constituyen la barrera directa entre el personal y el material infeccioso. Por ej. : - Instrumento de pipeteo, 5 6 - Copas de seguridad para centrífugas, - Guantes - Mandil - Máscara respiratorias o faciales - etc. c.- DISEÑO ADECUADO DE LAS INSTALACIONES.A las instalaciones se las denomina “Barreras Secundarias”, ya que garantiza la protección del personal que trabaja en el edificio y fuera del laboratorio así como de la comunidad, del posible escape accidental de agentes infecciosos del laboratorio de Microbiología. NORMAS PARA LA BIOSEGURIDAD. 1. - Usar mandil largo adecuado durante las prácticas y quitárselo antes de abandonar el laboratorio. 2. - No sacar jamás equipos, medios de cultivos con Bacterias fuera del laboratorio. 3. - No pipetear con la boca. 4. - No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosméticos en el laboratorio. 5. - Lavarse las manos después de manipular el material infeccioso así como antes de abandonar el laboratorio. 6. - Mantener el laboratorio limpio, aseado y desinfectado. 7. - Todos los procedimientos y técnicas se practicarán de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles. 8. - Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales, potencialmente de material infeccioso se notificarán de inmediato al instructor - jefe. 9. - Cada práctica los materiales del vidrio contaminados deben ser colocados en recipientes adecuados. 10. - Al comenzar las prácticas el instructor dará las pautas en forma oral de la bioseguridad. AUTOR :DR GONZALO ZABALA VILLACIS 6 7 INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA PRACTICA OBJETIVOS ESPECIFICOS DE LA CLASE. 1. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de seleccionar los instrumentos de acuerdo al examen bacteriológico a realizar. 2. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de utilizar correctamente cada instrumento con la técnica apropiada. 3. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de demostrar todos los materiales de vidrio que se utilizan en los diferentes exámenes. 4. - Diferenciar cada instrumento en las diferentes técnicas bacteriológicas. MATERIALES Y METODOS: Entre los principales instrumentos usados en Bacteriología lo podemos clasificar en: Materiales de vidrio, Instrumentos y Aparatos Entre los APARATOS tenemos: Autoclave, Horno, Estufa, Centrífuga, Microscopio Fluorescente, Microscopio Electrónico, Baño María, Contador de Colonias, Balanza, Peachímetro, Destilador de Agua. Entre los INSTRUMENTOS tenemos: Pinza portaláminas, Aguja de inoculación, Asa de inoculación, Bajalengua, Aplicadores de madera, Espátula, Pinzas, Gradillas, Canastillas, Cinta indicadora de esterilización. MATERIALES DE VIDRIO. : Pipetas, Tubos de ensayo, Caja de petri, Láminas porta objeto y Cubre objeto, Matraz Erlenmeyer de cuello estrecho y cuello ancho, Matraz fondo plano, Matraz aforado, Densímetro, Probeta, Termómetro, Cubeta para tinción, Vaso de Coplín, Vaso de precipitación, Agitador, Frascos goteros, Mecheros. PIPETAS.Es un utensilio de vidrio cilíndrico de gran utilidad que ofrecen un máximo nivel de exactitud y sirven para transferir de un recipiente a otro, cantidades específicas de líquido. Las pipetas son calibradas en 0.1, 0.2, 1, 2, 5, 10, 20 cc. etc. Las pipetas graduadas a partir de 5ml. tienen una boca de aspiración conformada, que es adecuada para alojar un tapón de algodón. Los tapones de algodón pueden prolongar el tiempo de vertido y por lo tanto influir en la exactitud de la medición. 7 8 ¡El pipeteado a boca está prohibido! Debido al alto riesgo de infección. Resulta por lo tanto imprescindible utilizar un auxiliar de pipeteado, que son excelentes en forma y función. Él más sencillo y frecuente son las Peras de Goma que son de caucho natural y se adaptan bien a la mano. PIPETAS AUTOMATICAS.Con el advenimiento de la precisión, exactitud y además con el objeto de romper la comunicación con la boca del operador se crearon estas pipetas que ya las tenemos en el mercado y que van de pequeñas cantidades hasta cantidades mayores, las tenemos de: 1, 5, 20, 25, 50, 100, 200, 250, 500, 1.000 ul. TUBOS DE ENSAYOS.Los tubos de ensayo para cultivo son de vidrio. Hay con bordes rectos y con roscas resistentes a la esterilización por vapor (121 °C). Existen en diversas longitudes y diámetros. Los tubos con bordes rectos deben ser protegidos por un tapón estéril de algodón revestidos de gasa, cuando contienen en su interior sustancias que se desean mantener estériles tales como solución salina, agua destilada, etc. o en su defecto medios de cultivo (sólidos, semisólidos, líquidos). El tapón que los protege permite el paso del aire necesario para el crecimiento de las Bacterias, pero impide el paso de las impurezas del medio ambiente, de tal forma que ejercen una función filtrante. CAJAS DE PETRI.Las hay de vidrio y de polietileno. Las cajas de petri de vidrio borosilicato ó vidrio de soda. Elevada calidad de vidrio y de acabado. Fondo y tapa planos tanto en el interior como el exterior. Las cajas de petri sirven para envasar los medios de cultivo sólidos, sobre los cuales se efectúan siembras en estrías para permitir una mejor individualización de las colonias. LAMINAS PORTA OBJETO.Son de vidrio óptico y sirven para realizar el frotis a observarse microscópicamente, ya sean estas preparaciones fijados y teñidos o en frescos, deben ser con bordes pulidos y antes de su uso deben estar completamente limpios, excepto de polvo y grasa. También hay porta objeto con cavidades, llamadas láminas excavadas. LAMINILLAS CUBRE OBJETO.Se emplean para cubrir las preparaciones en fresco a ser observadas microscópicamente. Las laminillas tienen por finalidad evitar cualquier contaminación del manipulador, evitar que la preparación se mueva con la corriente de aire exterior y nos da también una mayor superficie de observación al microscopio. MATRACES.Los hay de cuello ancho y cuello estrecho de fondo plano y matraces aforados. 8 9 MATRACES AFORADOS.Los matraces aforados son recipientes de vidrio, ofrecen un máximo nivel de exactitud. Los matraces aforados se suministran con tapón de PP. , Parte superior cuadrado, con punta de goteo. Este tapón reduce notablemente el peligro de rotura en caso de vuelco y evita que el matraz aforado se caiga al rodar por la mesa del Laboratorio. MATRAZ ERLENMEYER cuello estrecho.Son recipientes de vidrio con reborde y graduación MATRAZ ERLENMEYER cuello ancho.Al igual que el anterior sino con la particularidad como su nombre lo indica es de cuello ancho. Ambos sirven para lectura del volumen aproximado y depositar medios de cultivo, fundir medios de cultivo en el autoclave. DENSIMETROS.Los densímetros son instrumentos de precisión imprescindible para determinar la densidad de líquidos o la concentración de sustancias disueltas. PROBETA.Son recipientes de vidrio graduados y rotulados con pico y pie hexagonal que ofrecen un máximo nivel de exactitud. TERMOMETRO.Es un instrumento de vidrio imprescindible para la medición de la temperatura en el laboratorio. La alta duración de éstos instrumentos de calidad se obtienen de su característica de construcción “de una sola pieza”. CUBETA PARA TINCION, VASO DE COPLIN.Recipientes de vidrio sirven para mantener en posición vertical u horizontal las láminas porta objetos, ya sea para someterlos a la acción tintorial de los colorantes ó también para eliminar el aceite de inmersión del frotis teñidos después de haber sido observados. VASO DE PRECIPITACION.Son recipientes de vidrio de forma baja y de forma alta con graduaciones, reborde y pico sirven para mezclar y preparar soluciones. AGITADOR DE VIDRIO.Los agitadores de vidrio son varillas que vienen con bordes redondeados que sirven para agitar y mezclar las soluciones usadas en el laboratorio y en las preparaciones de los medios de cultivos. FRASCOS GOTEROS.Sirven para almacenar diversas sustancias colorantes a ser utilizadas en los distintos métodos de tinción, como su nombre lo indica permiten vaciar su contenido gota a gota para lo cual debe hacerse coincidir la ranura que existe tanto en la tapa del frasco como la que existe en el cuello del mismo. MECHEROS.9 10 Existen de alcohol y de gas; éstos últimos producen una llama mas firme y potente. Los mecheros en general alrededor de la llama dan una área dentro de la cual el material con el que se trabaja está libre de toda contaminación con las Bacterias del medio ambiente. La llama del mechero sirve también para fijar el frotis a ser teñidos y esterilizar el asa de alambre como la aguja del alambre antes y después de ser usadas, representando éstos una aplicación directa del calor seco (incineración). Debe recordarse que el máximo poder de la llama se encuentra en la punta de la misma. INSTRUMENTOS PINZAS.Las hay con extremos en puntas, redondeados y con extremos cuadrangulares de extraordinaria resistencia química y térmica, muy manejables. En Bacteriología las utilizamos para los antibiogramas con los discos de sensibilidad y en las tinciones de frotis; Que hay unas pinzas llamadas portaláminas que sirven para sujetar las láminas porta objeto en el momento que efectuamos la tinción de frotis ASA DE INOCULACION.El asa de inoculación consiste de un alambre cuyo extremo distal termina en un aro de diámetro variable, dicho alambre está unido por su extremo proximal a un mango metálico. Tienen innumerables usos pero en general sirven para tomar el material con el que vamos a trabajar, ya sea éste una colonia a ser estudiada, gotas de diferentes sustancias líquidas o especímenes tales como heces, sedimento urinario, etc. AGUJA DE INOCULACION. Instrumento igual al anterior con la salvedad, de que el alambre en vez de terminar el aro termina en punta. Sirve para efectuar inoculaciones en la profundidad de los medios de cultivo o también cuando queremos individualizar colonia rodeada estrechamente de otras no deseables. Actualmente existen asas y agujas descartables de material de polietileno, la elevada flexibilidad del material permite una siembra suave sin dañar la superficie del medio de cultivo, además no es necesario flamear y enfriar tras cada proceso de trabajo. Por lo tanto ya no existe formación de aerosoles. BAJALENGUAS.Sirven para deprimir la lengua y facilitar la toma de una muestra de exudado faríngeo. Los hay de madera y metálicos, rectos y ligeramente curvos con extremos redondeados. APLICADORES DE MADERA ESTERILES.- 10 11 Sirven para efectuar hisopados faríngeos, vaginales, rectales, ópticos y desde cualquier lesión productiva o supurativa ESPATULAS.Sirven para coger sustancias y pesarlas, terminan en extremo redondeado o en un extremo en forma de cuchara. CINTA INDICADORA DE ESTERILIZACION.Papel crepado, con colorantes sensibles al calor para esterilización al vapor. APARATOS AUTOCLAVE.Es un aparato que consiste de un caldero cilíndrico de paredes resistentes, cerrado superiormente por una tapa que cierra herméticamente gracias a la interposición de un empaque apropiado y a la presión ejercida por una serie de tornillos que la apretan. En el interior del cilindro existe un soporte sobre el cual se coloca una cesta metálica conteniendo el material a esterilizar; entre el fondo de la cesta y el caldero queda un espacio que se llena de agua. De modo general se puede considerar que el vapor saturado bajo presión de 15 libras por pulgada cuadrada con una temperatura de 120 °C, es suficiente para esterilizar cualquier medio o instrumento de 15 a 30 minutos. HORNO O ESTERILIZADOR.Es un aparato que está constituido por un recipiente que puede ser rectangular o cuadrado de paredes dobles, revestido exteriormente de amianto y calentado por quemadores que pueden ser eléctricos, gas, gasolina, Kérex, etc. En el interior del horno existen repisas móviles y en la parte superior orificios o chimeneas de ventilación y un orificio donde se coloca el termómetro graduado hasta 200 °C. Generalmente se requiere para lograr la esterilización someter los materiales a una temperatura de 180 °C por una o dos horas. En los laboratorios se utiliza el horno para esterilizar el material de vidrio tales como pipetas, fiolas, cajas de petri, etc. CONTADOR DE COLONIAS.Es un aparato eléctrico que registra la cantidad de colonias que se encuentra en una muestra de cultivo de orina. MICROPLATOS.Son planos de polivinil, que se las utiliza especialmente en pruebas serológicas: se usan en Pruebas de Fijación del Complemento, Inhibición de 11 12 Hemoglutinacón, etc. estas placas están constituidas por 96 hoyos divididos en filas 8 x12. BALANZAS BALANZA ABIERTA DE DOS PLATILLOS.Esta balanza cuenta con dos platillos que reposan en sendas columnas. Puede estar constituida para usarse con pesos separados, o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza. Se emplea para pesar cantidades grandes. Su sensibilidad es 0.5gr. (500mg). BALANZA ANALITICA.Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de una astil dentro de un estuche de vidrio. Se emplea para pesar cantidades pequeñas, cuando se requiere gran precisión. Su sensibilidad es de 0.5mg - 0.1mg. PEACHIMETRO.Es un aparato eléctrico que sirve para medir el pH de las soluciones, medios de cultivo, etc. ESTUFA O INCUBADORA.Es un aparato metálico y eléctrico suministra la temperatura ideal para el desarrollo de las Bacterias (generalmente de 35 a 37 grados) sembrados en los medios de cultivo. CENTRIFUGA.Es un aparato metálico que sirve para separar en sedimento de la porción líquida de una sustancia. Se utiliza en los Urocultivos para centrifugar a una velocidad de 2500 r.p.m. durante 5 minutos. MICROSCOPIO ELECTRONICO.Es aquel que proporciona resoluciones (aumentos) de 700 mil diámetros (700 mm) o más en el cual un campo magnético permite enfocar los rayos característicos (electrones) y obtener una imagen en la pantalla fluorescente. Existen dos tipos de microscopio electrónico: el de Barrido (Scanning) y el de Transmisión. El de Barrido permite observar pedazos de tejido de mayor tamaño y nos da una imagen tridimensional. El de Transmisión permite observar cortes ultrafinos o tinciones negativas. MICROSCOPIO FLUORESCENTE.- 12 13 Es aquel que esté provisto de filtros que permiten observar con luz ultravioleta, sustancias teñidas con colorantes fluorescentes. Con éste aparato se puede realizar dos tipos de pruebas: Fluorescencia Directa e Indirecta. BAÑO MARIA.Es un aparato eléctrico que se usa con frecuencia en los laboratorios, el mismo que contiene agua y un termómetro para regular la temperatura. Sirve para incubar (inactivar) diferentes muestras: suero, autovacunas, una temperatura constante de 37 - 56 °C. RESTRICCIONES DE LA TECNICA.No se puede emplear los instrumentos modernos ejemplo: pipetas automáticas, densímetros por falta de materiales en la facultad que esperamos que se vayan obviando paulatinamente. DR ERNESTO RONQUILLO 13 14 CLASIFICACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS.Según la posibilidad de que las muestras clínicas para el cultivo bacteriológico, estén contaminadas con la FLORA NORMAL se pueden dividir en tres áreas. Hay distintos procedimiento en cada caso para ACCEDER al PATOGENO. A.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS Y CERRADAS DEL CUERPO (DIRECTAS). La muestra recogida contendrá solo el germen patógeno. Debe atravesarse la piel para llegar al patógeno utilizando medios quirúrgicos o POR ASPIRACION CON AGUJA. Asepsia previa. Ej. Sangre. B.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS QUE COMUNICAN CON EL EXTERIOR (INDIRECTAS). La muestra seguramente contendrá AMBOS TIPOS DE GERMENES: Patógenos y de la Flora normal, pues estos últimos están en "el paso" para acceder al patógeno. Ej. Orina por micción. C.- MUESTRAS DE AREAS SUPERFICIALES DEL CUERPO. La flora patógena y la no-patógena están ASOCIADAS en el lugar de la infección; ambos tipos son recogidos en la muestra. Los gérmenes no patógenos no deben tomarse en cuenta al interpretar los resultados del cultivo. El instrumento mas útil en la recolección de estos especímenes es la TORUNDA, un aplicador con la punta envuelta en algodón, fibra de poliester, alginato de calcio, o dacrón. Ej. : Piel y membranas mucosas. OBTENCION DE LAS MUESTRAS. ORINA. MATERIAL. - Frasco de vidrio o de plastico estéril PROCEDIMIENTO. 1. - En la MUJER puede hacérselo en posición sentada o en cuclillas. a.- Apartar los labios uretrales con los dedos índice y anular, desde arriba. b.- Lavar cuidadosamente la vulva con una esponja mojada con una solución jabonosa no bactericida. Un buen agente de limpieza es el jabón de lavar común. Repetir 3 veces. Se eliminan los restos del lavado con una gasa estéril. c.- La micción se efectúa manteniendo los labios separados, recogiendo una muestra del chorro medio, en un recipiente estéril. 2. - En el HOMBRE. a.- Retraer el prepucio y lavar el glande de igual forma. 3. - En el INFANTE. 14 15 a.- Lavar los genitales de la misma manera. b.- Utilizar el Reflejo de Pérez. c.- Si fracasa esta maniobra, colocar una bolsita esterilizada sobre los genitales, para recoger espontáneamente la orina. En estos casos deberá recogerse la primera muestra de la mañana. En los dos primeros casos recoger la parte intermedia de la micción. HECES Las heces deberán ser frescas, y si tienen sangre o pus, éstas deberán seleccionarse para cultivo, pues es allí donde abundan los microorganismos patógenos. PROCEDIMIENTO.- Se debe utilizar para la toma de muestra un bajalenguas, cuchillo o cucharilla estériles para transferir al recipiente adecuado estéril, una porción del excremento. - El material fecal deberá ser recién emitido. - De heces formadas se transfiere un pedazo del tamaño de una nuez, de heces pastosas o líquidos: 1 - 2 ml (una cucharilla cafetera). FARINGE Y NASOFARINGE. PROCEDIMIENTO.- Se deberá tomar solo con una visión clara de la faringe, buena luz y utilizando un bajalengua. Se evitará rozar otras estructuras. Prevenir al paciente concurrir en ayunas sin lavarse los dientes con pasta dental. - Se dispondrá de dos hisopos, preferentemente humedecidos en tripticasa de soja. - Con los hisopos se tocará el fondo de la garganta, amígdalas, fosas tonsilares y cualquier otro lugar donde exista inflamación, exudado o ulceración. El frote debe ser enérgico, de lo contrario será un espécimen deficiente para el cultivo. - Uno de los hisopos se usará para hacer tinciones, y el otro para hacer cultivo. El estreptococo del grupo A es la única causa bacteriana común de faringitis, por ello la estrategia diagnóstica en cultivos de garganta tiene por finalidad identificar en forma selectiva este agente. ESPUTO. PROCEDIMIENTO. - El material se recogerá en un frasco estéril de boca ancha. - Que la expectoración se efectúe, si el paciente está en condiciones de hacerlo después de cepillarse los dientes y enjuagarse concienzudamente. - Se recogerá una expectoración de la primera hora de la mañana, que está mas limpia, inmediatamente después de una tos profunda en que se expectoren secreciones de los pulmones. - La muestra se procesará enseguida. En LACTANTES, el esputo se obtiene haciendo un frotis de la garganta o mejor aún por lavado gástrico ya que los niños generalmente degluten su expectoración. HEMOCULTIVOS. El hemocultivo consiste en cultivar una cierta cantidad de sangre de un paciente. Como la sangre es líquida orgánico estéril, el hallazgo de microorganismos en ella 15 16 indicará infección, generalmente de carácter grave. Es esencial un cumplimiento escrupuloso de las normas para la recogida aséptica de las muestras. PROCEDIMIENTO. - La toma de la muestra se realiza en la vena superficial de la parte interna de la flexura del codo. Se limpia previamente la zona desinfectándola con yodo y alcohol. Se repite el mismo procedimiento en el tapón de goma del frasco del hemocultivo, manteniendo su contacto por un minuto. - No palpar el sitio de punción luego de desinfectada la zona. La punción puede efectuarse con aguja y jeringa, o con los instrumentos de doble aguja que existen especialmente para este fin. - Inocular la sangre directamente en medio de cultivo a la cabecera de la cama. - Ante una bacteremia de origen desconocido es conveniente tomar dos muestras e incubarlas aeróbica y anaerobicamente. - Después de la extracción de sangre se taponará la herida con algodón y alcohol 70. La cantidad de muestra y el número a tomar dependerá de la edad y circunstancias del paciente. EXUDADO OTICO Las infecciones externas del oído frecuentemente son secundarias a heridas al rascarse las partes externas, con algún objeto punzante, infecciones por virus que se infectan secundariamente, alergias, prácticas de natación. - La toma se realiza después de haber limpiado y desinfectado concienzudamente el pabellón auricular. - Si hay supuración la toma se realiza con hisopo. Si existe forúnculo, se efectúa con aguja y jeringa. Se realizan las preparaciones microscópicas y se siembra en los medios adecuados. EXUDADOS VAGINAL Y URETRAL. Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) pueden causar con Exudado Vaginal o con Ulceras y/o tumoraciones. PROCEDIMIENTO. - Cuando hay sospecha de infección vaginal o uterina, se introducirá él especuló con el mínimo de lubricante que permita la comodidad de la paciente (a veces basta el agua tibia), ya que la mayor parte de los lubricantes son bacteriostáticos. - Es útil el empleo y envío de dos hisopos con muestra del exudado vaginal, uno seco y otro introducido en un medio de transporte (Stuart, A o Cary-Blair). El primero se utilizará para el examen en fresco y tinciones, y el segundo para los cultivos. - Para investigar la presencia de Gonococo, nunca se tomarán muestras de vulva ni de vagina, pues difícilmente son positivas. La muestra se tomará con ayuda de un especuló, después de haber extraído el tapón mucoso que recubre el cérvix, de endocérvix, introduciendo la punta en un hisopo a través de un catéter de luz estrecha colocado en la abertura cervical. De este modo se evita tocar la mucosa cervical reduciendo la posibilidad de contaminación. 16 17 En el caso de las niñas en la pubertad que presentan epitelio vaginal apto para el desarrollo del gonococo, se tomará la muestra de dicho sitio. - Casi la mitad de las mujeres afectadas de gonorrea alojan gonococos en el conducto anal; por lo tanto se hará un cultivo rectal. En el caso de las infecciones genitales en el hombre: Una suave presión del pene permite obtener una muestra útil para el cultivo y el frotis coloreado con el Gram. TECNICAS DE SIEMBRA BACTERIANA. CONTENIDO Siembra o inoculación es extender una pequeña cantidad de muestra sobre la superficie de la placa con agar, con un sistema de actuación preestablecido y con la ayuda de una asa de alambre fino o de plástico desechable. Este sistema de separación recibe el nombre de SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN SUPERFICIE. Las bacterias bien aisladas unas de otras crecerán como pequeñas masas de microorganismos, alcanzando unos 2 a 3 mm de diámetro al cabo de una incubación de 18 a 24 horas, denominadas COLONIAS, que a simple vista pueden verse en la superficie del agar. Cada colonia está formada por billones de gérmenes y constituyen todos los descendientes de un solo microorganismo que fue a parar a dicho lugar. MATERIAL A UTILIZAR: - Mechero de alcohol. - Tubo de ensayo con él inoculó o muestra. - Caja de petri con el medio de cultivo estéril. - Asa de inoculación INOCULACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS. Los medios se pueden distribuir en tubos ya sea como caldos o en forma de agar. El agar puede ser semisólido o sólido, generalmente formando un plano inclinado. Para la inoculación de especímenes se emplea generalmente el asa; para la transferencia de cultivos puros de placas a tubos, la aguja es, habitualmente el instrumento elegido. PROCEDIMIENTO. - Flamee el asa como se ha descrito anteriormente y déjela enfriar. - Quite el tapón de rosca (o el algodón) del tubo y tome con el asa una porción del espécimen. - Vuelva a poner el tapón de rosca (o el algodón) en el tubo que contiene el espécimen. Quite el tapón del tubo que se va a inocular RESIEMBRA BACTERIANA . Es la TRANSFERENCIA de colonias bacterianas de la caja de petri a tubos u otra caja que contienen medios de cultivo esterilizados. Con éste método las cepas que interesan se aíslan en CULTIVO PURO. Para ello tocamos la colonia seleccionada 17 18 con el extremo de una aguja esterilizada y transferimos los microorganismos adheridos a la aguja, al medio de cultivo deseado para su mejor proliferación. MATERIAL. - Asa y aguja de inoculación - Caja de Petri con colonias a transferir. - Mechero de alcohol - Caja de Petri o tubo (según el caso) con medio de cultivo estéril. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS COLONIAS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO Los microbiólogos utilizan diversas características de las colonias bacterianas que se desarrollan en la superficie de los medios de cultivo de agar con dos finalidades: - Efectuar la IDENTIFICACION PRESUNTIVA BACTERIANA PRELIMINAR. - COMO GUIA EN LA SELECCION DE PRUEBAS a fin de determinar las características diferenciales para la identificación final. CRITERIOS UTLIZADOS. 1. - Tamaño (diámetro en mm.) 2. - Forma. 3. - Consistencia. 4. - Elevación. 7. - Superficie. 5. - Borde (margen). 8. - Densidad. 6. - Color. 9. - Olor. FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. BORDE de las colonias: Plano, elevado, convexa, acojinada, umbiliforme, umbilicada. COLOR: Blanco, amarillo, negro, naranja, . SUPERFICIE: Brillante, mate, etc. DENSIDAD: Opaca, translúcidas, transparentes, etc. CONSISTENCIA: Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, mucoide. MATERIAL. - Medios de cultivo con las distintas siembras bacterianas. - Fuente de luz. - Lupa. RESTRICCIONES. La interpretación de cultivos primarios es una habilidad especial que se debe adquirir trabajando con un microbiólogo bien capacitado y generalmente se logra dominar sólo luego de muchos meses o años de experiencia. Como ejemplo podemos cita las características de las colonias en placas de agar de 3 bacilos Gram negativos distintos. Cada una de ellas es típica de su especie aunque son frecuentes las variaciones: - Las colonias E. Coli son planas con un borde recortado. - Las colonias de Klebsiella pneumoniae tienen un borde completamente liso y una superficie elevada y mucoide. 18 19 - Las colonias de P. Aeruginosa presentan una superficie irregular que recuerda una superficie metálica golpeada repetidamente con un martillo. Colonias en agar sangre que muestran zonas evidentes de hemólisis. El gran tamaño de las colonias comparado con las zonas de hemólisis sugiere una especie hemolítica de Staphylococcus. Colonias puntiformes B - hemolíticas: sugieren especies de Streptococcus. El reducido tamaño de las colonias bacterianas comparado con el gran tamaño de la zona de hemólisis B, es altamente sugestivo de esta especie. Colonias lisas diseminadas con pigmentación verde definida, sugieren la presencia de pseudomonas aeruginosa. El desarrollo colonial profuso y en ondas de dispersión, es característico de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis. MUESTRAS IMPORTANTES DE VARIAS ZONAS Y TIPOS DE INFECCIÓN Zona/tipo de infección tipo de muestra Líquido Tejido Torunda otros 19 20 Tracto urinario Vejiga Riñón Tracto gastrointestinal Intestino Boca Hígado Tracto biliar Abdomen Tracto respiratorio Nariz Nasofaringe Faringe Pulmón Espacio pleural Oído Ojo Orina orina Lavados Biopsia renal Torunda rectal Biopsia hepática heces Bilis Pus Aspirado peritoneal Líquido ascítico Torunda nasal Torunda pernasal Torunda faríngea Biopsia pulmonar Torunda auricular Torunda ocular “placa de tos”: el paciente tose directamente en una placa de agar inoculación directa de placas de cultivo a la cabecera de la cama Lavados (V) Esputo Lavado alveolar Líquido pleural Sistema nervioso central Meninges Encefalitis (herpes) Absceso cerebral Líquido cefalorra quídeo(L CR) Pus, LCR Biopsia cerebral Tracto genital Uretra Vagina Cerviz endometrio Piel y tejidos blandos Piel Herida Hueso y articulación Osteomielitis articulación Septicemia Fiebre de origen desconocido Endocarditis *recogido en la operación microbacterias Torunda uretral Torunda vaginal alta Torunda cervical Biopsia endometrial Líquido vesicular (V) Pus Pus aspirado Sangre Sangre Sangre Válvula cardíaca* (V) muestras para virología (H)muestras para hongos Biopsia cutánea(M) Raspados(H) Hueso* Torunda cutánea (portador) torunda de herida Microscopia directa y cultivo en la clínica Placas de impresión Extensión de sangre para parásitos palúdicos (M)muestras para CLASIFICACIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS 20 21 A. A.- MUESTRAS OBTENIDAS DIRECTAMENTE Sitios profundos sin comunicación: Tejidos u órganos Líquidos orgánicos: Sangre, linfa, pleural Peritoneal, articular Pericárdico, etc. Absceso profundo TÉCNICAS PARA ADECUADA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS: Asepsia de la piel Aspiración con aguja Biopsia quirúrgica VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TÉCNICA: Normalmente estériles Los resultados (+): Son diagnósticos Los resultados (-) Excluyen la infección. Pueden entrañar cierto riesgo para el paciente. B. B. MUESTRAS OBTENIDAS INDIRECTAMENTE: SITIOS PROFUNDOS CON COMUNICACIÓN -Exudados inflamatorios -Esputo, orina. TÉCNICAS PARA RECOLECCIÓN ADECUADA DE MUESTRAS: -Eludir las áreas Contaminantes -Pruebas cuantitativas -Aspiración: 21 VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TÉCNICA: -Pueden estar contaminadas con F.N -Más cómodas de obtener. 22 -Endocervix, vesícula -Fístulas. Suprapúbica, transtraqueal. -Correlación de hallazgos clínicos y microbiológicos. C. C. MUESTRAS DE ZONAS DE PIEL Y MUCOSAS: -Piel: Lesiones, heridas, absesos. -Membranas mucosas: Orificios del cuerpo (faringe, intestino), uretas, oído, etc. -Material de colostomia TÉCNICAS PARA RECOLECCIÓN ADECUADA DE MUESTRAS: -Utilizar medios de cultivos selectivos -Investigar agentes etiológicos específicos. Ej: estreptococo B.H GA.(Faringe) Tifoidea (heces) conocido (exud.uretal) -Ignorar la F.N. VENTAJAS Y RESTRICCIONES DE LA TEORÍA -Zonas usualmente contaminadas. -Restringir la búsqueda a gérmenes patógenos que no se hallan en el sitio infectado. -No apropiado para cultivos anoeróbicos. 1. Flamear el asa y tomar con ella una porción delgada de la muestra. Colocarla en el agar y distribuirla en el 1/4 superior. 22 2. Luego de flamear el asa, se repite el procedimiento previo, giro de 90° a la izq en el 1/4 siguiente, partiendo 23 de la zona última anteriormente sembrada. 3. El proceso se repite por tercera vez como en 2 hasta cubrir la superficie de la placa. TRANSFERENCIAS DE UN CULTIVO PURO 23 24 INOCULACIÓN DE MEDIOS EN TUBO MEDIOS LÍQUIDOS Caldo de Tioglocolato MEDIOS INCLINADOS Agar de Soya, Trypticase O en agar nutritivo base inclinada 24 25 MEDIOS ESPECIALES INCLINADOS Agar TSI MEDIOS SEMISÓLIDOS Medio CTA 25 26 D 26 27 AUTOR:DRA JOSEFINA RAMIREZ ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES SUPURATIVAS OBJETIVO: Al finalizar la clase práctica el alumno será capaz de: 1. - Seleccionar que medio de cultivo se necesita para el estudio de las colecciones supurativas. 2. - Escoger el medio de cultivo para realizar el estudio de las colecciones supurativas. 3. - Interpretar los resultados. MATERIALES. - Muestra del material supurativo a estudiarse. - Medio de transporte, el cual se escogerá dependiendo de la cepa que se va a estudiar. - Lámina porta objeto. - Asa de inoculación - Mechero. - Solución salina o agua destilada. - Colorantes. - Microscopio. - Medios de Cultivo, uno sólido (agar Sangre) y otro líquido (caldo de Thioglicolato). CONTENIDOS: OBTENCION DE LA MUESTRA: Este párrafo está indicado en el capitulo de toma de muestra MEDIO DE TRANSPORTE.Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, o hay que mandarla a un laboratorio distante , esta debe colocársela en un medio de transporte como el de Staurt o el de Amies, así como también si se sospecha de la presencia de anaerobios sería mejor utilizar el medio de Cary Blair. METODOLOGIA OBSERVACION MACROSCOPICA:.Al llegar la muestra al laboratorio, se observa macroscópicamente, pues esto nos sirve para orientarnos en el diagnóstico. Así un pus común compuesto por gránulos blancos-grisáceos es sugestivo de actinomyces; 27 28 una coloración verde azulada recuerda a pseudomonas, y un olor fétido se relacionaría con anaerobios o coliformes. OBSERVACION MICROSCOPICA:.Es indispensable para realizar una extensión fina y homogénea del pus y teñirla con el método de Gram o de Ziehl-Neelsen, pues su observación microscópica nos dirá los pasos a seguir y los medios de cultivo a utilizar. SIEMBRA DE LAS MUESTRAS: .Los principales productores de pus son los microorganismos que crecen bien en casi todos los medios ordinarios; por lo tanto , el plan sintetizador bastará con sembrar el producto patológico en dos medios de cultivo, uno sólido (que puede ser agar sangre, el mismo que permite aislar la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias o el medio de Lowenstein- Jensen si se sospecha una Etiología tuberculosa), y uno líquido como es el caldo de tioglicolato que tiene funciones de enriquecer el crecimiento de anaerobios estrictos y facultativos. A las 24 horas de incubación a 35 °C se efectuaran las oportunas resiembras en medios sólidos. VENTAJAS Este examen es el que nos permite en poco tiempo y con una simple observación obtener una orientación diagnóstica DESVENTAJAS La de contar con todo el material requerido. como por ejemplo: un medio de transporte. INTERPRETACION DE RESULTADOS: OBSERVACION DE LAS COLONIAS:.Colonias gamma hemolíticas de 4,5 mm. Blancas, opacas de bordes rizados en agar sangre (Bacillus antracis). Colonias gamma hemolíticas de 1 a 2 mm. En agar sangre (streptococos no hemolíticos)) Colonias gamma hemolíticas pequeñas transparentes, relucientes de margen ondulado en agar sangre (yersinia pestis) Colonias puntiformes (24 horas) En el medio de Francis (Francisella talurensis) Colonias rugosas pálidas (Aspecto cerebroide) en agar de LowesteinJensen (Mycobacterium tuberculosis) AUTOR:DR CARLOS MOSQUERA 28 29 MUESTRAS ESPECIALES PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO INTRODUCCION: El establecimiento del diagnóstico en las enfermedades infecciosas dependen en gran parte de la selección de la muestra, del tiempo en que se colecta y del cuidado que en ello se pone. Estos factores son con frecuencia de importancia para el éxito en el diagnóstico etiológico de las enfermedades infecciosas. OBJETIVOS: Al finalizar la clase el alumno estará en capacidad de: 1.- Demostrar como se toman correctamente las muestras para su estudio bacteriológico. 2.- Identificar las características morfológicas de las Bacterias. Predecir cómo y cuándo solicitar un examen para su estudio bacteriano. 3.- Demostrar la acción patógena de las Bacterias sobre el organismo. 4.- Explicar las condiciones de como preservar y enviar las muestras para su estudio bacteriológico. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR). Los principales agentes etiológicos que podemos encontrar en un LCR son los siguientes: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Estreptococos neumoniae, Estafilococos áureas, Enterobacterias, Mycobacterium tuberculosis. MATERIALES: Se requiere el siguiente material: - Tubos de ensayo estériles. - Equipo para punción lumbar. - Asa de inoculación. PROCEDIMIENTO: La muestra se obtiene por punción lumbar previa desinfección del área y debe ser enviada inmediatamente al laboratorio , la muestra no debe ser refrigerada , si ni se la procesa en el momento debe ser incubada o dejada a temperatura ambiente . El LCR para su estudio bacteriológico se centrifuga a 2500 r.p.m. x 10! con el sedimento obtenido se hace un frotis para teñir con Gram que sirve para orientar hacia el tipo de tratamiento a establecer e indica los medios de cultivo a utilizar si se busca bacilo tuberculoso se realiza tinción Ziehl Neelsen y se siembra en medio de Lowenstein Jensen . 29 30 En el caso de Neisseria meningitidis, se siembra en agar Chocolate o Tayer Martin a 35 °C en atmósfera de 5 a 10% de CO2, para luego realizar la reacción bioquímica en agar CTA (Cisteína trípticasa) adicionado de los respectivos carbohidratos. LIQUIDO SINOVIAL El estafilococo aureus es el agente etiológico más común de la artritis séptica, sin embargo pueden aislarse otros agentes como el Haemophilus influenzae, Estreptococos viridans, etc. MATERIALES: - Jeringa estéril. - Tubo de ensayo estéril. PROCEDIMIENTO: La muestra se obtiene por aspiración con una jeringa estéril, la muestra debe ser colocada en frascos para transporte en anaerobios para preservar la viabilidad de los anaerobios. Puede ser útil inocular un frasco para hemocultivo con parte de la muestra , sobre todo si el especimen no puede ser llevado inmediatamente al laboratorio. Las muestra muy purulentas se inoculan directamente en diversas placas de agar, incluyendo alguno que permita el desarrollo de microorganismos exigentes como: A. Chocolate, A. Sangre, y en un medio enriquecido como el caldo de thioglicolato. Si se sospecha de tuberculosis se inoculará en el medio de Lowenstein Jensen. LIQUIDO ASCITICO La E. coli es la bacteria que se encuentra con mayor frecuencia seguida por el Estreptococo neumoniae y otros Estreptococos del grupo A. Aunque también pueden aislarse Enterobacterias, Estafilococos, etc. MATERIALES - Equipo para paracentesis. - Tubos de ensayo estériles. - Asa de Inoculación. PROCEDIMIENTO La muestra se obtiene por aspiración percutánea (paracentesis) o en el momento de una cirugía y se envía al laboratorio para examen directo y cultivo. El transporte debe realizarse en un frasco para anaerobiosis, por lo general de 1 - 5 ml de líquido son suficientes para el diagnóstico de una peritonitis. Como en todo material que se presume que contiene anaerobios, éstas muestras deben ser inoculadas lo más rápido posible. LIQUIDO PLEURAL 30 31 Las Bacterias que pueden ser aisladas del líquido pleural incluyen aquellas relacionadas con neumonías, como Estreptococos neumoniae, Estafilococos aureus. H. influenzae, Enterobacterias, bacilo tuberculosos y anaerobios. MATERIALES - Tubos de ensayo estériles. - Jeringuilla estéril. - Equipo para toraconcentesis. - Asa de inoculación. PROCEDIMIENTO La muestra se recoge por aspiración (toraconcentesis) y transportada al laboratorio lo mas pronto posible. Para el aislamiento de la mayoría de las Bacterias es suficiente una muestra de 1 - 5 ml, pero cuanto sea mayor el volumen habrá mejores probabilidades de aislamiento de algunos patógenos como el Mycobacterium tuberculosis. Las muestras que se reciben en frascos para transportes de anaerobios o jeringas deben ser inoculadas tan pronto como sea posible en los medios de cultivo para aerobios y anaerobios de rutina. Además deben examinarse frotis teñidos con Gram y Ziehl Neelsen LAVADO GASTRICO (HELICOBACTER PYLORI) MATERIALES - Tubos de ensayo estériles. - Asa de inoculación. - Colorantes para tinción de Gram. PROCEDIMIENTO La muestra se obtendrá a través de endoscopía digestiva para obtener la secreción gástrica , una vez obtenida la muestra debe ser enviada al laboratorio inmediatamente para poder neutralizar la acidez. De la secreción se hará frotis directo para ser teñidos con Gram a fin de identificar bacilos Gram negativos curvos, para posteriormente realizar la prueba de la ureasa. LAVADO BRONQUIAL Las bacterias que con mayor frecuencia podemos encontrar en el lavado bronquial tenemos: Mycobacterium tuberculoso, H. influenzae, Estreptococo neumoniae. MATERIALES Tubos de ensayo estériles. 31 32 Asa calibrada. Cepillo bronquial PROCEDIMIENTO La muestra se obtiene a través de un cepillo bronquial protegido por un catéter. Se coloca dentro de una cánula doble un cepillo pequeño que recoge 0.01 a 0.001mg de secreciones. El extremo de la cánula exterior se obtura con un tapón de polietilenglicol, una vez que la cánula se ha insertado en el área apropiada, se empuja la cánula interior que desaloja al tapón a medida que es extraída, luego se extiende el cepillo hacia el exterior de la cánula interna. La muestra obtenida se suspende en 1 ml de caldo agitando en un vortex y luego se inocula en los medios de cultivo usando una asa calibrada de 0.01 ml. TEJIDOS Entre las Bacterias que podemos aislar de material de biopsia o de tejido tenemos: Mycobacterium tuberculoso, Brucella, Listeria monocytogenes. MATERIALES - Frasco plástico con boca ancha y tapa de rosca. - Solución salina estéril. PROCEDIMIENTO Las muestras del tejido deben ser obtenidas luego de una cuidadosa preparación de la piel, ya que es importante que las biopsias se extraigan en condiciones asépticas. Se recomienda un envase plástico de boca ancha y tapa de rosca. Los microorganismos anaerobios sobrevivirán en los tejidos el tiempo suficiente para ser recuperados luego en el cultivo. Para mantener la humedad de la muestra conviene agregar un pequeño volumen de solución salina, no usar formol en las muestras para estudio bacteriológico. AUTOR: DR JUAN MORENO PINCAY 32 33 TECNICAS DE PREPARACION DEL FROTIS Y SU FIJACION OBJETIVOS: - Elaborar el frotis. - Reconocer los pasos ordenados para la realización de un frotis. - Utilizar adecuadamente el asa de inoculación. - Aprender a flamear el asa de inoculación y la lamina portaobjeto. - Usar adecuadamente los dedos de la mano para coger el asa y par a taponar el tubo de ensayo. - Sostener adecuadamente el tubo de ensayo en el momento de tomar la muestra bacteriana. CONTENIDO.Antes de realizar cualquier tipo de tinción bacteriana previamente debemos realizar un frotis . Pero -Qué es un frotis?, No es otra cosa que el extendido de una suspensión bacteriana en una lámina portaobjeto limpia de tal forma que se forme una película uniforme y fina en el tercio medio de la placa. Los frotis preferentemente deben realizarse tomando muestras de cultivos frescos o directamente de los focos infecciosos. El frotis se lo puede realizar con el asa de inoculación o con un hisopo, para realizar un frotis es necesario que el estudiante tenga conocimientos previos de los materiales utilizados en bacteriología, este frotis dejaría de ser importante sino se continúa con el procedimiento de tinción. Es importante recordar que para efectuar un buen frotis este debe quedar del mas fino espesor posible para poder individualizar microscópicamente una célula bacteriana de otra. MATERIALES A UTILIZAR. -Cultivos, caldos y agares - Asa de inoculación - Hisopos - Mechero - Solución salina o fisiológica - Una tubera o gradilla - Papel filtro -Pinza porta lámina- Lámina portaobjeto TECNICA 1.- Limpiar un portaobjeto aplicando la llama a una de las superficies, colocarlo sobre la mesa con el lado tratado hacia arriba. 33 34 2.- Tomar el asa de transferencia o de inoculación como si fuera un lápiz con el pulgar y el índice. 3.- Insertar el asa de inoculación en un ángulo de 60° en la punta de llama del mechero de Bunsen o del alcohol, calentar al rojo toda el asa. 4.- Tomar el tubo de ensayo que contiene solución salina con la mano libre, quitar el tapón de algodón ó tapa con los dedos de la mano que sujeta el asa de inocular y que está libre. 5.- Calentar el borde del tubo haciéndolo pasar por el cono superior de la llama. 6.- Insertar el asa esterilizada dentro de la solución salina y extraer 2 o 3 asadas y llevarlas al centro de la lámina porta objeto. 7.- Esterilizar el asa nuevamente y tomar una muestra de colonias bacteriana siguiendo el procedimiento anterior tratando en lo posible coger el tubo de ensayo del fondo. 8.- Llevar las muestras de colonias bacterianas al centro de la lámina donde previamente estaba la solución salina ,sin olvidar de tapar los tubos de ensayo. 9.- Hacer un extendido con el asa de inoculación realizando movimientos circulares que abarquen el tercio medio de la placa, dejar que el frotis seque al aire. 10.- Pasar varias veces el frotis por el mechero para fijarlo. 11.- Esterilizar el asa de inoculación antes y después de utilizarla. 12.- El frotis también se puede fijar con fijador de Schaudinn de 5 minutos a 50°C o una hora a temperatura ambiente sin sufrir daños el frotis. El estudiante durante la ejecución de la técnica utilizará correctamente los cinco dedos de la mano; el meñique y el anular para el tapón, el índice y pulgar para el asa y el dedo medio de apoyo. VENTAJAS Y DESVENTAJAS La realización de un frotis tiene la ventaja de favorecer a las técnicas de tinción para ellos es importante que el espesor sea lo mas fino posible. Una de las desventajas es que al fijar la placa ciertas proteínas plasmáticas se coagula y se adhiere al porta objeto. Cuando la fijación se hace con alcohol metílico; en 2o3 minutos está lista la placa. Cuando se fija con el alcohol es cuando el extendido es generalmente rico en materiales hísticos. La realización de un frotis tiene importancia si se realiza la tinción; cuando se observa al microscopio las Bacterias están muertas ya sea por la fijación o por los mismos colorantes que se vayan a utilizar. 34 35 Si el medio de cultivo donde se toma la muestra es líquido la extensión que se consigue es fina y homogénea, si la muestra es tomada de un medio de cultivo sólido la calidad del frotis dependerá mucho de la habilidad del estudiante al realizar la suspensión y posteriormente el frotis. RESTRICCIONES DEL METODO En realidad la única restricción que tiene el método en la clase de práctica de Bacteriología es cuando se quiere utilizar fijadores como el de Schaudinn o alcohol metílico que no hay en stock de nuestro laboratorio, pero la fijación la hacemos a fuego lento con el mechero METODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACIONDE LA MOTILIDAD BACTERIANA BACTERIANA OBJETIVOS: 1.- Discriminar el movimiento bacteriano del Browmiano mediante la observación microscópica . 2.- Reconocer la motilidad bacteriana producido en un medio de cultivo. 3.- Realizar una suspensión bacteriana . 4.- Ejecutar la técnica de lámina y laminilla, gota pendiente y en tubo capilar cerrado. CONTENIDO: La motilidad o movilidad bacteriana es una de las propiedades o características de muchas especies bacterianas de avanzar mediante propulsión por flagelos (filamento, gancho y complejo basal de la compleja estructura de un flagelo). El filamento helicoidal lo tenemos como una hélice, el gancho como una unión , y el cuerpo basal como un cilindro o anillo de un motor. Las Bacterias mótiles se mueven en pequeñas carreras interrumpidas sobre periodos de rotación sobre sí mismo. A diferencia del movimiento Browmiano que son movimientos de partículas de polvo suspendida en agua que tiene un movimiento irregular en zig-zag y refleja los impactos recibidos constantemente al chocar las partículas de polvo con las moléculas de agua y aire que se mueve constantemente, este movimiento se lo puede comparar como el de migas de pan en una pecera producida por el mordisco de los peces. La motilidad bacteriana es una prueba presuncial de que las Bacterias poseen flagelos aunque no indica número ni disposición de los mismos. Estos movimientos flagelares son en látigos, circular y en rotación a un promedio de 40 revoluciones por segundo. 35 36 El examen directo de los organismos vivos (Bacterias) pueden tener gran utilidad para determinar relaciones de tamaño, forma, movilidad y reacciones. TIPOS DE MOTILIDAD BACTERIANA Tenemos la que se realiza en fresco para una observación microscópica y la que se observa en medios de cultivos macroscópicamente. En fresco tenemos tres métodos: a) El de lamina y laminilla. b) El de gota pendiente. c) En tubo capilar cerrado. En medios de cultivos tenemos: a) En agar Motilidad. b) En agar Mac Conkey. y agar sangre c) En agar Edwars-Ewing. MATERIALES: - 4 Láminas porta objeto excavada. - 4 Láminas porta objeto. - 4 Laminillas cubre objeto. - 1 Recipiente con vaselina . - 1 Recipiente con xilol. - Plastilina . - 1 Tubo de ensayo con solución salina. - Aplicadores de madera. - Asa y aguja de inoculación. - 2 Tubos capilares. - Mechero. - Medios de cultivo sembrado y estériles. - Microscopio. TECNICA: OBSERVACION MICROSCOPICA: ENTRE LAMINA Y LAMINILLA.- (entre porta y cubre objeto) Depositar una gota de cultivo líquido, o la suspensión de una colonia en solución salina o en suero fisiológico sobre el centro de la lámina porta objeto, colocar una laminilla cubriendo la suspensión, a continuación observar en el microscopio utilizando objetivos secos de gran aumento como (10X) o (40X). Esta técnica puede ser utilizada para observación microscópica de anaerobios siempre y cuando se observe con rapidez la parte central del montaje. GOTA PENDIENTE.36 37 Untar una capa débil de vaselina en los bordes de la concavidad de la lámina excavada, colocar una gota de suspensión bacteriana en el centro de la laminilla cubre objeto, luego invertir cuidadosamente la lámina porta objeto excavada sobre la laminilla de tal modo que en el centro de la concavidad corresponda a l de la gota . Luego observar con objetivo seco el borde de la gota y a continuación todo el campo. EN TUBO CAPILAR CERRADO.Con ésta técnica podemos observar Bacterias mótiles anaerobias principalmente. Se llena un tubo capilar con una suspensión bacteriana, cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina, luego se observa al microscopio con el objetivo de 40X OBSERVACION MACROSCOPICA MOTILIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO: EN AGAR MOTILIDAD.Técnica.- Se siembra con la aguja de inoculación en medio de cultivo semisólido tanto en picadura como en profundidad, tratando en lo posible que la aguja no penetre mas de 1 cm del fondo del tubo. Incubar por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C, luego se realiza la interpretación de los resultados. La motilidad es positiva cuando hay crecimiento de Bacterias mótiles lo que permite que el sitio de picadura se ensanche y se deforme y el medio de cultivo se torna turbio. La motilidad es negativa cuando el medio de cultivo está claro y el sitio de la picadura no ha sufrido transformación. EN AGAR MAC CONKEY, O AGAR SANGRE(FENOMENO DE SWARMING) Técnica.- Sembramos punteando la parte central del agar Mac Conkey, incubamos por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C. Hacemos la lectura y observamos si ha habido o no crecimiento de Bacterias (Proteus)con gran motilidad en la superficie del medio. Si hay crecimiento bacteriano con estas características las colonias en la superficie del medio no permanecen compactas y separadas por el contrario el desarrollo bacteriano se difunde rápidamente sobre toda la superficie formando anillos concéntricos de dispersión con ondulaciones características en el medio(fenómeno conocido como el de Swarming). 37 38 VENTAJAS Y DESVENTAJAS VENTAJAS DE LA OBSERVACION EN FRESCO.Se observa la bacteria viva y en movimiento, la forma y posibles alteraciones morfológicas ocurridas al moverse la bacteria; no se expone a observar deformaciones causadas por la fijación y los colorantes. DESVENTAJAS DE LA OBSERVACION EN FRESCOS.La rápida desecación nos impide una observación prolongada, también nos impide ver ciertas estructuras como cápsulas, flagelos esporas que solo es posible observarlos con métodos de tinción especial. En cuanto a la observación en medios de cultivo si bien es cierto que podemos observar las distintas reacciones que se producen en el medio lo que nos hace sospechar de acuerdo a las características que hay motilidad bacteriana tiene la desventaja que no podemos observar directamente la bacteria. RESTRICCIONES DEL METODO En un tubo capilar aunque es un método sencillo de realizar no disponemos de stock en el laboratorio lo mismo que sucede con el medio de Edwars-Ewing probablemente en un futuro no muy lejano estaremos en condiciones de realizar éstos métodos y técnicas para un mejor conocimiento. AUTOR JUAN MORENO 38 39 TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS OBJETIVOS: Elaborar diferentes tinciones correctamente. Reconocer los pasos ordenados para la realización de cualquier método de tinción enseñado. Seleccionar una técnica específica para la tinción de esporas cápsulas. Identificar Bacterias ácido resistentes y no ácido resistentes. CONTENIDO: Las Bacterias poseen la propiedad de fijar ciertas sustancias colorantes, de ahí que cuando éstas se tiñen podemos observar algunas de las estructuras bacterianas que no se observaban en fresco, como por ejemplo cápsulas, esporas, flagelos, membranas, etc. Hay algunos tipos de colorantes químicos como: los ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos tienen carga iónica negativa no tiñen a la célula bacteriana y son usados para impartir el fondo de contraste al frotis, por ejemplo: la eosina. Los colorantes básicos tienen ión de carga positiva y tiñen las células bacterianas uniformemente, por ejemplo: violeta de genciana, azul de metileno. Los colorantes neutros son sales complejas que poseen ambas cargas iónicas como el eosinato de azul de metileno. Todo procedimiento de tinción parte de un frotis las sustancias químicas que se usan para teñir Bacterias se la conoce como colorante. Se cree que la bacteria se tiñe debido a un intercambio iónico entre colorantes y elementos activos de la superficie o del interior de la célula bacteriana. Hay algunas hipótesis que sugieren que las Bacterias Gram positivas contienen un complejo proteínico ribonucleasa-Mg en su pared y que el mismo forma un complejo insoluble con el cristal violeta yodo que no es decolorado con el alcohol. Otros autores refiriéndose a la tinción de Gram que es universalmente conocida, sugiere que los organismos Gram positivos tienen un punto isoeléctrico (pH) más bajo y por lo tanto se combina más firmemente con los colorantes básicos y, finalmente, otra explicación más reciente y quizás la más acertada se fundamenta en que las paredes de las Bacterias Gram negativas son muy ricas en contenido graso, el mismo que es extraído al ser tratada con alcohol aumentando de ésta forma la porosidad de la pared celular y por lo tanto la salida fácil del complejo cristal violeta-yodo. En cambio las Bacterias Gram positivas por la composición química propia de su pared al ser tratada con el alcohol se deshidrata reduciendo por lo tanto la permeabilidad y por ende el complejo cristal violeta-yodo no es extraído. 39 40 Todas las bacterias Gram negativas son constantes en su reacción: las Gram positivas son variables, dependiendo de algunos factores (Cultivos jóvenes, Cultivos viejos, y técnicas). CLASIFICACION DE LOS METODOS DE TINCION. Se clasifican en simples, compuestos y especiales . Los métodos de tinción simples son aquellos en los que se utiliza un solo colorante. Métodos de tinción compuestos son aquellos en los que se utilizan más de un colorante. Los métodos de tinción especiales son aquellos donde se utilizan colorantes o reactivos para estudiar ciertas estructuras específicas de las Bacterias como por ejemplo gránulos metacromáticos, flagelos, cápsulas, esporas, membranas. METODOS DE TINCION SIMPLE: Tenemos el método de Violeta de Genciana, el de Azul de Metileno, el de Fucsina fenicada básica, y el Azul de Metileno alcalino de Loeffler. METODOS DE TINCION COMPUESTA: Tenemos el método de Gram, el método de Preston-Morrel, el método de ZiehlNeelsen, el método de Kinyoun, método Albert. METODOS DE TINCIONES ESPECIALES: Método de Wirtz-Conklin, método de Tinta China, método de Hiss, método de tinción de Fontana tribondeau, método de Fleming-modificado, método de Leifson ;rojo congo para leptopiras. MATERIALES - Colorantes. - Láminas porta objetos. - Laminillas cubre objetos. - Medios de cultivos con colonias bacterianas. - Papel filtro. - Vaso de Coplín. - Pinza porta lámina. - Asa de inoculación. - Tubo de ensayo con solución salina. - Tinta china. - Mechero - Reactivos. - Microscopio. - Tubera. METODO DE VIOLETA DE GENCIANA: TECNICA: 40 41 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana por un minuto, lavar con agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con objetivo de inmersión. Las Bacterias con este método se van a observar en el microscopio de color violeta o morada. METODO DE AZUL DE METILENO: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión. Las Bacterias con éste método se van a observar de color azul. METODO DE FUCSINA FENICADA BASICA: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con fucsina fenicada basica durante un minuto lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión. Las Bacterias con éste método se van a observar de color rosado METODO DE AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFLER: TECNICA: 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno alcalino de Loffler durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión. Las Bacterias con éste método se van a teñir de color azul, es importante señalar que con éste método se tiñe bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciomnes metacromáticas del bacilo se observan en el microscopio de una coloración azul oscuro y el cuerpo del bacilo en un azul pálido. METODO DE GRAM. 1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana durante un minuto luego lavar con agua. 2.- Cubrir la preparación con Licor de Gram que actúa como mordiente, durante un minuto, luego lavar con agua. 3.- Decolorar la preparación con alcohol 70° ó alcohol cetona hasta eliminar el exceso de violeta genciana, luego lavar. 4.- Cubrir el frotis con fuscina fenicada o safranina; si se usa fuscina fenicada diez segundos es suficiente, si se utiliza safranina de 30 a 60 segundos. Luego lavamos con agua secamos con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión . Las Bacterias que aparecen teñidas de un color MORADO se denominan GRAM POSITIVAS, es decir han captado el colorante de violeta de genciana y no han sido 41 42 decoloradas por el alcohol. Las Bacterias que aparecen teñidas de color ROSADO se denominan GRAM NEGATIVAS, es decir que no han fijado el violeta de genciana, siendo decoloradas por el alcohol y en cambio han captado la safranina o la fucsina fenicada dependiendo del colorante que se haya utilizado. METODO DE ZIEHL-NEELSEN: TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrirlo con papel filtro y luego colocar fucsina. Calentar en el mechero la lámina portaobjeto durante 5 minutos, separándola cada vez que emita vapores, luego lavar con agua. 2.- Decolorar el frotis hasta eliminar el exceso de fuscina fenicada con alcohol ácido unos segundos lavar con agua luego. Cubrir elfrotis con azul de metileno un minuto. Lavar con agua, secar con papel filtro y queda listo para observar con el lente de inmersión. Los bacilos tuberculosos y leprosos denominados alcohol-ácidoresistente (por resistir la decoloración con el alcohol y el ácido), se tiñen de color rojo , es decir han captado la fuscina fenicada. Estos bacilos resaltan su coloración roja sobre el fondo azul oscuro el azul metileno; ambos bacilos aparecen como bastones finos rectos y ligeramente curvos. En conclusión, las Bacterias que se observan de color rojo se denominarán alcohol ácidos resistentes y las que se observan de color azul no ácido resistentes. METODO DE ALBERT. TECNICA: 1.- Realizar un frotis, cubrir la preparación con colorante de Albert durante cuatro minutos luego lavar con agua. 2.- Cubrir el frotis con lugol durante dos minutos, luego lavar con agua, secar con papel filtro y queda lista para la observación con el objetivo de inmersión. Si bien es cierto este método es compuesto por haberse utilizado mas de un colorante no es menos cierto que también podrían encasillarse dentro de los métodos de tinciones especiales ya que con este método podemos observar las granulaciones metacromáticas del bacilo diftérico las mismas que se observa de una coloración verde oscura y su cuerpo de una coloración verde pálida. Cuando la bacteria teñida no es el diftérico no se observará estas granulaciones y únicamente nos limitaremos a ver las Bacterias teñidas de color verde. METODO DE PRESTON-MORREL. 42 43 TECNICA: 1.- Cubrir la preparación con oxalato de cristal violeta 30 segundos lavar con yodo lugol durante 30 segundos. 2.- Lavar yodo acetona durante 30 segundos. 3.- Lavar con agua unos segundos. 4.- Cubrir la preparación con carbolfucsina diluida 30 segundos se lava con agua y se seca queda lista para la observación con objetivo de inmersión. Este método es una variante de la tinción de Gram, nos da un mejor contraste para la placa de control. TINCION DE KINYOUN. TECNICA: 1.- Extraer y secar la preparación 2.- Fijar con alcohol metílico de 99° hasta la evaporación del mismo. 3.- Cubrir la preparación con la solución de fucsina y dejar actuar 2 minutos. No es necesario calentar. 4.- Lavar con agua. 5.- Decolorar con la mezcla ácido-alcohol hasta que no se desprenda mas colorante. 6.- Lavar con agua. 7.- Cubrir la preparación con azul de metileno y dejar actuar de 20a 30 segundos. 8.- Lavar con agua. 9.- Secar y observar con el objetivo de inmersión. Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se colorean de rosa los que no, se observan de color azul. METODOS DE TINCIONES ESPECIALES METODO DE WIRTZ CONKLIN: (ESPORAS). TECNICA: 1.- Haga una suspensión de los organismos en 0,25 ml. de agua destilada. 2.- Haga un frotis delgado con esta suspensión y fíjelo a la llama. 3.- Cubra el frotis con una solución acuosa con el 5% de verde malaquita y calientelo hasta emitir vapores de 3 a 6 minutos. 4.- Lave con agua destilada. 5.- Tiña con una solución acuosa al 5% de safranina por 1 minuto 6.- Lave con agua destilada. 7.- Seque y examine. Las esporas se tiñe de verde, el cuerpo de la bacteria es rosado. METODO DE TINTA CHINA (CAPSULAS). TECNICA: 1.- Realizar un frotis y fijarlo. 43 44 2.-Depositar sobre el frotis seco y fijado una gota de tinta china y extenderlo con laminilla. 3.- Dejar secar. 4.- Colocar safranina durante 1 minuto. 5.- Lavar con agua y observar con el lente inmersión. La cápsula aparece como espacio claro alrededor del cuerpo bacteriano que se tiñe de rojo pálido sobre un fondo negro dado por la tinta china. METODO DE HISS (CAPSULAS): TECNICA: 1.- Mezcle el material a ser teñido con igual cantidad de suero. Haga un frotis delgado. 2.- Déjelo secar al aire. 3.- Fíjelo ya sea a la llama o en formalina comercial diluida al 10% (1:10). 4.- Cubra el frotis con el colorante de Hiss o con solución acuosa al 1% de cristal violeta hasta emitir vapores por unos pocos segundos. 5.- Lave el colorante con una solución acuosa al 20% de sulfato de cobre. 6.- Seque al aire y examine. El cuerpo bacteriano,células y fondo de la preparación se tiñen de púrpura. Las cápsulas son incoloras o lavanda pálida. TINCION DE PARED CELULAR. 1.- Se utiliza cultivos jóvenes de 18 a 20 horas de B. subtilis. 2.- Realizar un frotis grueso, con el frotis húmedo se coloca el ácido fosfomolíbdico 1% por 4 minutos. 3.- Escurrir el ácido fosfomolíbdico y agregar verde de metilo 1% por 5 minutos. 4.- Lavar. Este método se fundamenta en que el ácido fosfomolíbdico hidroliza el citoplasma, pero respeta la pared que aparece de color verde. METODO DE FLEMING MODIFICADO. (ESPORAS): 1.- Carbol fucsina de Ziehl - 5 minutos calentando. 2.- Lavar. 3.- Decolorar con etanol 30 segundos. 4.- Lavar. 5.- Extendido de una gota de tinta china y dejar secar. Es importante reconocer que cuando no se usa métodos especiales de tinción de esporas y se utiliza el método de Gram las esporas aparecen como un espacio claro no teñido y el cuerpo de la bacteria de color violeta. TINCION DE FONTANA TRIBAONDEAU. (FLAGELOS): 44 45 Es una coloración de impregnación argéntica que permite la observación de ciertos microorganismos (espiroquetas) o de estructuras muy finas (flagelos). TECNICA: 1.- Extraer y secar a temperatura ambiente. 2.- - Cubrir la preparación con el fijador y dejar actuar 90 segundos. 3.- Lavar con alcohol etílico de 95°. 4.- Cubrir la preparación con el mordiente, calentando hasta el desprendimiento de vapores y dejar actuar durante 30 segundos. 5.-- Lavar con agua. 6.- Cubrir la preparación con solución de nitrato de plata, calentando hasta el desprendimiento de vapores . Mantenerlo de 15 a 20 segundos. 7.-- Lavar con agua. 8.-- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión. Las espiroquetas se observan de color castaño. TINCION DE LEIFSON: (FLAGELOS): Para realizar la tinción de flagelos se debe partir de un cultivo líquido adecuado de 18 a 24 horas, incubado a temperatura ambiente. REACTIVOS: Preparar tres soluciones por separado. a.- Cloruro sódico: 1,5g. Agua destilada 10ml. b.- Acido tánico 10g. Agua destilada 100ml. c.- Acetato de p-rosanilina 0,9g. p-rosanilina ClH: 0,3 g. Alcohol etílico de 95 °: 100ml. Dejar en reposo 12 horas a temperatura ambiente. Tomar volúmenes iguales de A, B, C, agitar y dejar 2 horas en reposo. TECNICA: 1.- Sobre 4 ml de cultivo añadir 0,25 ml de formol al 5%. 2.- Dejar reposar 15 minutos. 3.- Añadir agua destilada mezcla y centrifugar retirando el sobrenadante. Repetir 2 veces.. 4.- Resuspender en 1-2 ml. de agua destilada debe quedar suspensión bacteriana ligeramente turbia. 5.- Flamear un portaobjeto limpio y dejar enfriar. 6.- Depositar unas gotas de la suspensión , con asa o pipeta, en un extremo del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal. 45 46 7.- Dejar secar a temperatura ambiente y no fijar por el calor. 8.- Cubrir la preparación con 1 ml. de colorante. 9.- Dejar de 5 a 15 minutos hasta que el alcohol se evapore. 10- Una vez formado el precipitado lavar con agua. 11.- Secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de inmersión. Los flagelos se tiñen de color rojo oscuro o azul negro. Además de este método, tenemos el método de Gray que también sirve para teñir flagelos. VENTAJAS Y DESVENTAJAS. Las ventajas de los métodos de tinción escriba en que podemos observar algunas estructuras de las Bacterias que no podían ser observadas en la observación en fresco, es así como un método universal de Gram podemos determinar rápidamente si una bacteria es Gram positiva o Gram negativa. Con el método de Zielh-Neelsen podíamos determinar si una bacteria era ácido resistente o no y si queremos ir más adelante nos hemos dado cuenta que con los métodos de tinciones especiales podemos observar en el microscopio estructuras como cápsulas, esporas, pared, flagelos gránulos . Las desventajas serían que no observamos a la bacteria viva y que con los colorantes las Bacterias podrían sufrir una discreta deformación de sus estructuras. RESTRICCIONES La mayoría de los métodos de tinción aquí estudiados, año a año se han venido realizando en la práctica de bacteriología. Lo ideal sería que todos los métodos sean estudiados, pero ésto no ha sido posible debido a la carencia de colorantes y reactivos en el departamento de bacteriología. En otros casos, como en el de la tinción de flagelos que se necesita de un mayor tiempo para la preparación de la tinción. Pero ésto no sería inconveniente si nosotros con antelación a la práctica llevamos preparado parte del material. AUTOR:DR GONZALO ZABALA VILLACIS 46 47 MEDIOS DE CULTIVO DE USO FRECUENTE EN BACTERIOLOGIA OBJETIVO ESPECIFICO DE LA CLASE 1.- Al final de la clase el alumno estará en la capacidad de DISTINGUIR los diferentes medios de cultivos por sus nombres. 2.- Estará en capacidad de EXPLICAR los usos de los medios de cultivo. 3.- Estará en capacidad de SELECCIONAR el medio de cultivo de acuerdo a la especie bacteriana a cultivarse. 4.- Estará en capacidad de VALORAR la importancia de los medios de cultivo y su utilidad en la industria o fabricación de antibióticos, vacunas, etc. CONCEPTO DE MEDIOS DE CULTIVOS.Se denomina medios de cultivos a las sustancias o mezcla de sustancias que proporcionan en forma asimilable todo los elementos necesarios para que las Bacterias puedan crecer y multiplicarse dando lugar a la formación de colonias. CONDICIONES O FACTORES QUE DEBEN REUNIR UN MEDIO DE CULTIVO.El desarrollo de una bacteria en un medio de cultivo depende de una serie de factores o condiciones, las principales son: a.-CONTENIDO NUTRITIVO ADECUADO (Composición).Es decir los elementos indispensables para que las Bacterias puedan desarrollar y multiplicarse. Al respecto las necesidades de las Bacterias son extremadamente variables. Como principales nutrientes se pueden mencionar los siguientes: - FUENTES DE CARBONO.Como los azúcares, ácido acético,de echo el Carbono es necesario para todas las Bacterias ( ninguna puede multiplicarse desprovista de CO2). - FUENTES DE NITROGENO.Como los nitratos y sales de amonio. - FUENTES DE AZUFRE.Prácticamente todos los microorganismos, utilizan el azufre de los sulfatos, sulfuros y tiosulfatos - FUENTES DE FOSFORO.Todas la Bacterias utilizan el fósforo de los fosfatos. - FUENTES DE OXIGENO E HIDROGENO.Procedentes del agua.- Minerales como Potasio, Magnesio, Calcio, Hierro, Zinc, Cobalto, Cobre,etc. 47 48 Otras sustancias importantes son las denominadas factores de crecimiento que están constituida por las vitaminas (A, B, C, D,) y principalmente los aminoácidos y las bases púricas y pirimidínicas. Son sustancias, que las Bacterias, por sí solas son incapaces de sintetizar. b.- pH.Las Bacterias se desarrollan habitualmente a pH próximo a la neutralidad (6.8 a 7.6) salvo excepciones, porque algunas Bacterias pueden crecer a pH muy ácidos o muy alcalinos. Para ajustar el pH de los medios se utiliza sobretodo sustancias indicadoras o bien en comparación con una serie de soluciones patrón de un indicador coloreado c.- PRESION OSMOTICA.Debido a la composición de la pared celular bacteriana los gérmenes se adaptan bien a las variaciones de la presión osmótica, sin embargo “in vitro”, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotonía. d.- EL POTENCIAL REDOX.Está en relación con el tipo respiratorio de cada bacteria, que puede ser anaerobia estricta, aerobia y anaerobia facultativa, aerobia estricta y microaerófila. e.- LA HIDRATACION.La presencia del agua es indispensable para el crecimiento bacteriano por lo que deberá estar presente en los medios de cultivo en cantidades suficientes. f.- LA TEMPERATURA.En caso de las Bacterias los medios de los cultivos se incuba de 35 -37 °C. g.- LA ATMOSFERA.Algunas Bacterias, especialmente aerobias y facultativas, necesitan para su óptimo desarrollo la presencia de ciertos ambientes gaseosos. El mas utilizado es el CO2 que varían del 3 - 10% h.- DEBEN SER DISTRIBUIDOS EN RECIPIENTES.Adecuados en los cuales son esterilizados y mantenidos al abrigo de contaminaciones externas tanto antes de sembrados como en lo posterior. PRINCIPALES OBJETIVOS DE UN MEDIO DE CULTIVO a.- Obtener cultivos puros para estudiar las Bacterias y mantenerla viva indefinidamente. Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriológico debe terminar con el cultivo del producto a examinar. Efectivamente, este cultivo es a 48 49 menudo necesario para la evidencia de Bacterias (siempre que su número sea demasiado pequeño para que podamos descubrirla por el simple examen microscópico). b.- Facilitar el hallazgo, aislamiento y separación de las distintas especies bacterianas presentes en un producto patológico. c.- Observar el aspecto de las colonias a simple vista o con pequeños aumentos (lupa) con diagnósticos. d.- Obtener cantidades apreciables de Bacterias para fines industriales, como en la elaboración de vacunas y autovacunas. e.- Estudiar la fisiología de la bacteria. f.- Estudiar la toxigénesis y las cualidades de las toxinas. g.- Es necesario para los estudios complementarios, como los de sensibilidad de las Bacterias a los distintos antibióticos (antibiogramas). CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Debido a la aparición de nuevos medios de cultivo, cada día se torna mas difícil encasillarlos dentro de las clasificaciones tradicionales, por lo tanto nos limitaremos a mencionar muy someramente las definiciones que se han dado a ciertos grupos de medios de cultivos. 1.- DE ACUERDO A SU PROCEDENCIA O PREPARACION.a.- MEDIOS NATURALES O EMPIRICOS.Son aquellos que están constituidos por sustancias o productos naturales ya sea de origen animal o vegetal, es decir que no han sido creados artificialmente por el hombre. Ejemplo: gelatina, huevo, leche, papa, levadura, sueros, líquido ascítico, pleural, sinovial, peritoneal. b.- MEDIOS ARTIFICALES.Son aquellos elaborados por el hombre, que contiene químicas de la naturaleza y proporciones conocidas, junto a productos de origen natural. Actualmente son los mas utilizados. En el comercio existen infinidad de medios de cultivo deshidratados que facilitan en gran manera la labor de los laboratorios de Microbiología y que garantizan una buena calidad de funcionamiento. 2.-DE ACUERDO A CONSISTENCIA O ESTADO FISICO.a.- MEDIOS LIQUIDOS,como los caldos:Nutritivo,tioglicolato etc. b.- MEDIOS SEMISOLIDOS.49 50 Son aquellos que cumplen poca cantidad de agar 5% y que generalmente se utilizan para estudiar la movilidad de los microorganismos o para estudios zimográficos, o para su conservación , Ejemplo: agar motilidad, Medio de Flecher, etc. c.- MEDIOS SOLIDOS.Son agares, ejemplo: agar citrato, agar urea, agar bismuto, etc. 3.- DE ACUERDO A SU CALIDAD O SU UTILIZACION.a.- MEDIOS SELECTIVOS O INHIBITORIOS.Son aquellos en los que se desarrolla una especie bacteriana o un grupo de ellas, porque contienen sustancias que inhiben el desarrollo de las demás y que están presentes en la muestra. La selectividad del medio se consigue por la adición de sustancias como las sales biliares, que inhiben a las formas cocáceas Gram+, o la Azida sódica, que solo permite el crecimiento de los cocos Gram+. Los antibióticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos. b.-MEDIOS DIFERENCIALES O DE DIFERENCIACION.Son aquellos que se utilizan para poner de manifiesto a las Bacterias que dan positiva alguna propiedad bioquímica y que están presentes en la mezcla. Pueden tener indicadores del ph, entre las cuales tenemos el rojo fenol y azul de bromo timol, los cuales confieren al medio de cultivo distintos colores según la reacción sea ácida o sea alcalina. La mayoría de los medios destinados a las reacciones bioquímicas de las Enterobacterias son medios diferenciales. Ejemplo.: agar urea de Christiansen, agar citrato de Simmons, etc. c.- MEDIOS ENRIQUECIDOS.Son aquellos que favorecen el crecimiento de algún tipo de Bacterias que se encuentran en forma minoritaria en una mezcla de varios grupos bacterianos. Son medios básales a los que se les ha agregado ciertos nutrientes como vitaminas, proteínas, sangre desfibrinada. Ejemplo.: agar sangre, agar chocolate, agar Thayer Martín, agar Muller Hinton, etc . d.- MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.Son aquellos medios de cultivo a los cuales se les ha añadido sustancias inhibitorias, lo que da como resultado medios de cultivo que permiten el desarrollo de Bacterias, pero dentro de un estrecho margen. Ejemplo.: Caldo de Tetrationato, Caldo Selenito, Thayer Martin modificado,etc. e.-MEDIOS DE IDENTIFICACION.50 51 Son aquellos que se utilizan para estudiar la acción de un solo tipo de Bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencia de los Medios Diferenciales, en que se siembran con Bacterias pertenecientes a un solo clon. Se utiliza para los estudios de identificación de las Bacterias. f.- MEDIOS DE CULTIVO BASICOS.Son aquellos medios cuya fórmula contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos no fastidiosos, entre estos nutrientes tenemos: Infusión de carne, peptona, agua, sal,etc. Ejemplo: Caldo nutritivo, Caldo de peptona, Caldo de triptona de soya, agar nutritivo inclinado, agar nutritivo en base profunda. g.- MEDIOS DE MULTIPLICACION.Son aquellos que poseen una composición determinada y óptima para el grupo de Bacterias a las que va destinado, y que permitirá un máximo de aumento celular bacteriano en un mínimo tiempo. Son medios utilizados en la industria, en la preparación de vacunas, de antibióticos, etc. h.- MEDIOS DE CONSERVACION.Son aquellos cuya composición favorecen el mantenimiento de los microorganismos que en él se siembran y que posteriormente se incuban a +2, +4 °C. Algunos medios de conservación incluyen glicerol y se guardan en congelador a -20 °C. Estos medios de conservación han sido prácticamente desplazados por la liofilización. Existe una variación de medios de conservación que son los MEDIOS DE TRANSPORTE, cuya finalidad es mantener en estado viable, aunque sin producción ( o mínimamente), microorganismos presentes en una muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que están minoritariamente presentes. Actualmente los medios de transporte utilizados son: el medio de Stuart, el de Amies y el medio de Cary-Blair. PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA. CALDO NUTRITIVO.Son medios de cultivo líquidos constituidos por agua, peptona y extracto de carne. Sirve para el cultivo de microorganismos de escasos requerimientos nutricionales; tales como la E.coli, estafilococos. 51 52 AGARES NUTRITIVOS.Son caldos nutritivos a los que se les ha agregado agar para su solidificación. Contiene cloruro de sodio. Pueden ser utilizados para el cultivo de microorganismos de escasos requerimientos nutritivos, para pruebas de hemólisis cuando se emplea adicionado de sangre, puede servir para el cultivo y recuento de microorganismos en las aguas, heces u orina y cualquier otro producto. Ejemplo.:Tenemos el agar nutritivo inclinado y el agar nutritivo profundo. AGAR SANGRE.El agar sangre es un medio enriquecido sólido que nos permite ver las propiedades hemolíticas de ciertas Bacterias tales como Estreptococos, Estafilococos, de diversos materiales. El agar sangre se puede preparar con sangre desfibrinada de conejo o de borrego adicionada a un agar que contenga infusión de carne. Este agar contiene de 5 al 10% de sangre estéril. AGAR T.S.I..- (KLIGER MODIFICADO).Es un medio sólido diferencial que se recomienda para la identificación de los bacilos entéricos Gram negativos en base a la fermentación de dextrosa, lactosa y sucrosa, y por la producción de Sulfuro de Hidrógeno que los utiliza en los coprocultivos. AGAR S. S. .El agar S. S. es un medio diferencial y selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella y Shigellas a partir de heces y otros materiales en que se sospeche su presencia, además inhibe el desarrollo de todas las Bacterias Gram(+) y algunas Gram (-) no deseables, las mismas que están inhibidas por el verde brillante de las sales biliares y las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato. AGAR CITRATO de SIMMONS.Es un medio diferencial empleado para la investigación de la utilización del citrato como única fuente de Carbono, produciendo alcalinidad. Este medio es una modificación del de Koser, al cual se le ha agregado agar y un indicador del pH azul de bromo timol. Se lo emplea en los test bioquímicos. AGAR UREA DE CHRISTIANSEN.Es un medio sólido diferencial empleado para la investigación de la Bacterias que utilizan urea como única fuente de Nitrógeno y particularmente para diferenciar algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Se lo emplea en los test bioquímicos. AGAR MAC CONKEY.52 53 Es un medio selectivo y diferencial utilizado para el cultivo de enterobacterias Gram (-) e impide el crecimiento de las bacterias Gram (+) que es inhibida por las sales biliares y por el cristal violeta que contiene. Se lo utiliza preferentemente en los urocultivos y coprocultivos donde abunda la flora Gram (-). AGAR BISMUTO SULFITO.Es un medio de cultivo sólido selectivo que sigue especialmente para el aislamiento de Salmonella tifosa a partir de heces, en agua servidas, alimentos, etc. Se recomienda, en particular después de un enriquecimiento preliminar del espécimen en caldo de tetrationato u otro caldo de enriquecimiento. El efecto selectivo de este medio de basa en su contenido de verde brillante e inhibe ante todo el enriquecimiento de la flora Gram (+) acompañante. CALDO DE THIOGLICOLATO.Es un medio de cultivo líquido que se emplea para la multiplicación y el aislamiento de Bacterias anaerobias estrictas, facultativas y de gérmenes microaerófilos. También se los emplean para los test de esterilidad de ciertos productos biológicos. CALDO DE TETRATIONATO.Es un medio enriquecido por la adición de bilis de buey, también es selectivo porque se utiliza para el crecimiento de Salmonellas. El verde brillante que entre en su composición inhibe la flora Gram (+). Se utiliza cuando la muestra es pobre en gérmenes tal como sucede en pacientes crónicos, convalecientes o portadores sanos. AGAR MOTILIDAD.Es un medio semisólido y se emplea para averiguar la motilidad de las Bacterias. Es un medio diferencial, se lo emplea en los test bioquímicos. AGAR CHOCOLATE.Es un medio sólido especial, utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes como las neisserias patógenas (gonococo y meningococo). En este medio pueden efectuarse las siembras del líquido cefalorraquídeo y pus. AGAR TELURITO.Es un medio de cultivo sólido selectivo utilizado para la diferenciación colonial de los tres tipos de bacilos diftérico: Mitis, Gravis e intermedius, a partir de exudados nasales y faringeos. Su contenido en telurito de potasio permite, en primera instancia inhibir el desarrollo de la flora contaminante. MEDIO DE HUEVO o de PAI.53 54 Es un medio de cultivo sólido selectivo empleado para el crecimiento del bacilo diftérico en general. AGAR CHAPMAN o MANITOL SALADO.Es un medio de cultivo sólido selectivo empleado en el aislamiento de estafilococos basado en la tolerancia que poseen a una alta concentración de cloruro de sodio que al mismo tiempo inhibe el desarrollo de otros microorganismos. MEDIO DE LOWENSTEIN - JENSEN.Es un medio de cultivo sólido selectivo empleado universalmente para el cultivo y el aislamiento de micobacterias, en especial M. tuberculosis. Este medio debe conservarse en tubos herméticamente cerrados y en refrigeración MEDIO DE THAYER MARTIN.Es un medio enriquecido que permite el crecimiento de cepas exigentes de Neisserias. AGUA O CALDO DE PEPTONA.Es un medio líquido diferencial; que se utiliza para el cultivo de enterobacterias para observar la producción de indol. se lo emplea en las reacciones bioquímicas . CALDO DE SELENITO F.Es un medio de cultivo selectivo recomendado para la detección e identificación de Salmonellas en heces (Coprocultivos), alimentos, productos lácteos y otros materiales de importancia sanitaria. AGAR MULLER - HINTON.Es un medio enriquecido recomendado para el aislamiento y cultivo, en especial de la familia Neisseriaceae. Constituye un excelente medio para el diagnóstico precoz de los portadores de microorganismos rinofaríngeos. También se lo utiliza para la interpretación del Test de sensibilidad de las Bacterias o los antibióticos. MEDIO DE LOEFLER.Es un medio altamente nutritivo recomendado universalmente para el cultivo y aislamiento de Corynebacterium diphterieae en exudado rinofaríngeos. MEDIO DE BORDET - GENGOU.Es un medio enriquecido con sangre que se utiliza para el diagnóstico bacteriológico de la Tosferina, es decir para el aislamiento de la Bordella pertusis. EUGON AGAR o EXUBERANTE AGAR.54 55 Es un medio enriquecido muy adecuado para obtener el desarrollo exuberante de distintas bacterias de difícil crecimiento, como Hemophilus, Neisseria, Pasteurella, Brucella y lactobacilos. Es muy utilizado en bacteriología alimenticia para el control de las carnes y alimentos. También para la preparación de antígeno y vacunas. AGAR SENSIBILIDAD.Es un medio de enriquecimiento especial, sólido que se envasa en las cajas de Petri y se lo utiliza en las pruebas de sensibilidad in vitro, de las Bacterias a los antibióticos (Antibiogramas). MEDIO DE STONBRINK.Medio recomendado para el aislamiento de especies de Mycobacterium bovis, que no se desarrollan normalmente en Lowenstein - Jensen. MEDIO DE TRANSPORTE DE STUART.El medio de transporte de Stuart, originalmente usado para facilitar el transporte de muestras tomadas con hisopos para cultivar gonococos, puede ser también usado para llevar muestra con otros microorganismos de distintos materiales (vías respiratorias, entéricos, etc.). Es un medio semisólido no nutritivo que contiene glicolato de sodio para suprimir cambios oxidativos y enzimáticos de las células. Este medio tiene la ventaja de mantener la vitalidad de todos los gérmenes aerobios o microaerófilos delicados. AGAR TCBS.- (Agar de Tiosulfato-citrato- bilis y sacarosa).El Agar TCBS es un medio selectivo que se utiliza para el cultivo y aislamiento del Vibrio cholereae y otro vibrio enteropatógeno. Las concentraciones de tiosulfato, citrato y alcalinidad del medio inhiben el crecimiento de otras enterobacterias presentes en las heces. La bilis y el citrato disminuye el desarrollo de Proteus y enterococos favoreciendo el de vibrio. MEDIO DE CLED.- (cisteina- lactosa- electrolito deficiente).El Agar CLED es un medio no inhibidor, que ha sido adoptado universalmente para efectuar recuento de colonias y aislamiento en bacteriología urinaria ya que permite el desarrollo de todos los patógenos urinarios y previene el desarrollo invasor (swarming) de Proteus sp. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de control antes de considerarlos aptos para utilizar: CONTROL DE ESTERILIDAD.55 56 Se efectúa incubando algunas placas, escogidas del lote al azar durante 2 días a 35 °C y 5 días a temperatura ambiente. El resto de las placas se guarda en refrigerador a 4 °C, y solo se utiliza del grupo control muestra ausencia de cualquier tipo de crecimiento después de los 7 días. CONTROL DE CALIDAD.Se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para las comprobaciones se utilizan por lo menos dos gérmenes distintos, uno que crece sobre el medio, o da positiva una determinada prueba, y otro que no crece, o da negativa. CONTROL DE CADUCIDAD.Para ponerlo en práctica es necesario que en el momento del empaque se rotule en algún lugar visible de la placa, la fecha de preparación, además el nombre del medio. De esta manera se podrá saber en todo momento el tiempo que falta para llegar al límite de su utilización. Hasta aquí el primer parcial. REVISADO Y ACTUALIZADO DR EDUARDO CHANCAY L. Jefe de la Cátedra de Bacteriología Junio/2012 56