VAL REF_6

1 VALORES DE REFERENCIA Notas Índice 1. REFERENCIAS HISTÓRICAS ........................................................................................2 2. INTRODUCCIÓN.............................................................................................................2 3. DEFINICIONES ...............................................................................................................3 4. CONCEPTO DE VALORES DE REFERENCIA...............................................................3 5. DETERMINACIÓN DE VALORES DE REFERENCIA.....................................................4 6. PREPARACIÓN DE LOS INDIVIDUOS DE REFERENCIA.............................................6 6.1. Preparación para la obtención de especímenes........................................................................................ 6 6.2. Extracción................................................................................................................................................... 7 6.3. Preparación del espécimen........................................................................................................................ 7 6.4. Almacenamiento del espécimen................................................................................................................. 7 6.5. Recomendaciones especiales.................................................................................................................... 7 7. CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA ......7 8. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE REFERENCIA....................................................8 8.1. Descripción gráfica de una muestra de referencia..................................................................................... 8 8.2. Pruebas de gaussianidad........................................................................................................................... 8 8.3. Transformaciones....................................................................................................................................... 8 8.4. Detección y tratamiento de valores aberrantes.......................................................................................... 9 9. DETERMINACIÓN DE INTERVALOS DE REFERENCIA.............................................11 9.1. Diferentes tipos de intervalos de referencia............................................................................................. 11 9.2. Cálculo paramétrico del intervalo de referencia....................................................................................... 11 9.3. Determinación no paramétrica del intervalo de referencia....................................................................... 12 9.4. Tamaño de muestra para la determinación de los valores de referencia ................................................ 13 9.5. Determinación del intervalo de referencia en muestras “censuradas”..................................................... 13 10. CRITERIOS PARA EL CÁLCULO DE INTERVALOS DE REFERENCIA SEPARADOS (CRITERIOS DE PARTICIÓN) ..........................................................................................16 10.1. Criterio de Harris y Boyd (12) ................................................................................................................. 16 10.2. Criterio de Lathi (13-15).......................................................................................................................... 16 10.3. Criterio de Linton .................................................................................................................................... 16 10.4. Consideraciones no estadísticas............................................................................................................ 17 11. VALORES DE REFERENCIA INTRAINDIVIDUALES .................................................17 11.1. Variabilidad intraindividual ...................................................................................................................... 17 11.2. Valores de referencia intraindividuales .................................................................................................. 19 11.3. Fundamentos teóricos............................................................................................................................ 19 12. UTILIZACIÓN DE LOS VALORES DE REFERENCIA.................................................22 12.1. Comparación de poblaciones................................................................................................................. 22 12.2. Comparación de un valor observado con los valores de referencia ...................................................... 23 13. VALORES DE REFERENCIA UNIVARIANTES FRENTE A MULTIVARIANTES........25 13.1. Región de referencia multivariada.......................................................................................................... 25 13.2. Paradojas de la interpretación multivariada ........................................................................................... 27 14. TRANSFERIBILIDAD DE VALORES DE REFERENCIA.............................................28 14.1. Introducción ............................................................................................................................................ 28 14.2. Cálculo del intervalo de referencia......................................................................................................... 28 14.3. Procedimiento general............................................................................................................................ 29 15. COMPARACIÓN DE INTERVALOS DE REFERENCIA CALCULADOS DE FORMA PARAMÉTRICA.................................................................................................................29 15.1. Parámetros de centralización: comparación de medias ........................................................................ 29 2 15.2. Parámetros de dispersión: comparación de dos varianzas ................................................................... 31 15.3. Conclusiones .......................................................................................................................................... 31 16. COMPARACIÓN DE INTERVALOS NO PARÁMETRICOS........................................32 16.1. Prueba de comparación de fractiles....................................................................................................... 32 16.2. Conclusiones .......................................................................................................................................... 32 17. BIBLIOGRAFÍA CITADA..............................................................................................33 18. BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL........................................................................................33 1. Referencias históricas En 1969 con ocasión del XII Congreso de la Sociedad Escandinava de Química Clínica, R. Grasbeck y N.E. Sarispropusieronladenominacióndevaloresdereferenciaensustitucióndelohastaentoncesvalores normales. En1970laInternacionalFederationofClinicalChemistry(IFCC)designóunComitédeExpertosbajola presidencia del Dr. T. P. Whitehead para establecer recomendaciones en la teoría de valores de referencia, elScientificCommittee,ClinicalSection,ExpertPanelonTheoryofReferenteValue(EPTRV),presidido después por R. Gräsbeck (FI), y H. E. Solberg (NO), siendo miembros N. Montalbeti (IT), C. Petitclerc (CA), G.Siest(FR),P.Wilding(US),G.Z.Willians(US),P.Stamm(DE)yR.Dybkaer(D).Asuvezel International Committee for Standardization in Haematology (ICSH), designó en 1977 a Standing Committee on Reference Values (SCRV). El Comité de Expertos de la IFCC ha publicado seis documentos: •Part 1. The concept of reference values (1987) (1, 2). •Part 2. Selection of individuals for the production of reference values (1987) (3). •Part3.Preparationofindividualsandcollectionofspecimensfortheproductionofreferencevalues (1988) (4). •Part4.Controlofanalyticalvariationintheproduction,transferandapplicationofreferencevalues (1991) (5-7). •Part 5. Statistical treatment of collected reference values. Determination of reference limits (1987) (8). •Part 6. Presentation of observed values related to reference values (1987) (9). Hay que destacar la importancia que ha tenido para la elaboración de la teoría de los valores de referencia y las aplicaciones que de ella se derivaron los Congresos Internacionales de Química Clínica de Estocolmo y México;lasreunionesdelInternationalDataCommunicationGroupenMinneapolis,CancúnyGraz;ylos Symposiums de Biologie Clinique de Pont-à-Mousson. 2. Introducción El objetivo primordial del laboratorio clínico es la detección de las variaciones de los distintos constituyentes, tanto de origen endógeno como exógeno, que estudia en los seres vivos originadas por la propia actividad fisiológicaoporcircunstanciaspatológicas,aportandounaseriedevalorescuantitativos,confines preventivos, diagnósticos y de control de tratamiento. Estos valores deben ser interpretados en relación con valores similares obtenidos en condiciones fisiológicas. Los valores obtenidos en condiciones fisiológicas pueden estar sometidos a variaciones de origen genético, constitucionaloambiental,asícomoalasintroducidasporlaadministracióndemedicamentosuotros agentes terapéuticos. Alsercompetenciadellaboratorioclínicolaproduccióneinterpretacióndevaloresanalíticos,le correspondeelestablecimientodevaloresdereferenciaenfuncióndelapoblaciónalaqueprestasus servicios y de la metodología que utiliza. Es imprescindible para la correcta obtención e interpretación de los valores de referencia el conocimiento y la descripción meticulosa de todos los factores capaces de introducir variaciones. 3 3. Definiciones Individuodereferencia:esunindividuoseleccionadoconfinesdecomparaciónmedianteunoscriterios definidos en cada caso. Es importante que el criterio elegido sea el estado de salud, pero la definición no se limita a esto, sino que también puede incluir un cierto estadio de una enfermedad, o un determinado estadio fisiológico(porejemploelprimertrimestredelembarazo),uotracondiciónquesearelevantealosfines terapéuticos o pronósticos, o también se pueden tener intervalos de referencia hospitalarios. Población de referencia: es el conjunto de todos los posibles individuos de referencia. Muestra de referencia: es un subconjunto de la población de referencia constituido por el número adecuado de individuos para que sea representativo de dicha población de referencia. Valor de referencia: es el valor obtenido por la medición de una magnitud en el laboratorio en un individuo de referencia que forma parte de la muestra de referencia. Distribución de referencia: es la distribución de probabilidad de los valores de referencia. Las hipótesis y los parámetrosestadísticosdeladistribucióndeprobabilidaddelamuestradereferenciasecomprobarány calcularán a partir de la distribución de referencia con los métodos estadísticos apropiados. Límitesdereferencia:sonaquellosvaloresdeladistribucióndereferenciaqueexcluyen,conuna probabilidaddeterminada,unafraccióndedichadistribución.Seestablecendeladistribuciónyson descriptivos de los valores de referencia. Intervalodereferencia:eselintervalodeladistribucióndereferenciaquequedacomprendidoentrelos límites de referencia, incluyéndolos a ambos. Valores observados: son los valores obtenidos por medición de una magnitud en un individuo determinado, parasustentarunadecisiónmédica,pudiendosercomparadoconlosvalores,distribuciones,límiteso intervalos de referencia. 4. Concepto de valores de referencia Cualquierresultadodellaboratoriocarecedeinterésporsímismo.Unaprimeraaproximaciónadotarde contenidoelresultadodeladeterminacióndeunconstituyenteessucomparaciónconelvalordedicho constituyente en una población considerada como “sana”, es decir, compararlo con los llamados valores de referencia. ElconceptodevaloresdereferenciahasidoformuladoporelExpertPaneldelaIFCCyrecogido,en ocasiones,conalgunosmaticesdiferentes,porcomisionesnacionalesadhocconelpropósitodeunificar conceptos, métodos y terminología, habida cuenta de la importancia formal y conceptual de la comparación antes aludida (10, 11). Unvalordereferenciasedefinecomoelresultadoanalíticoobtenidoenunindividuodereferencia.Este individuo es una persona que pertenece a la comunidad a la que sirve el laboratorio en cuestión, y que se caracteriza fundamentalmente por disfrutar de un estado de salud definido por el propio investigador, no un estadodesalud“absoluto”.Estaflexibilidadenladefinicióndeindividuodereferenciapermiteestablecer valores de referencia utilizando grupos peculiares tanto por su estado fisiológico (mujeres embarazadas, por ejemplo),patológico(insuficienciasrenalesentratamientocondiálisis),ohistoriafarmacológica(mujeres tomando anticonceptivos orales), sin menoscabo de los fundamentos teóricos. Todos los individuos que cumplan las condiciones de inclusión definidas por el investigador, constituyen la población de referencia. La aplicación de la estadística a los datos obtenidos tras realizar observaciones – efectuar determinaciones analíticas en nuestro caso- en todosestosindividuos,permitela reduccióndela información.Nosemanejaránlistasderesultados,sinotansólodosotresparámetrosquecondensenla informacióncontenidaenlaslistas,haciéndolamanejableeinteligible.Elcálculodeestasmedidas(de centralización y de dispersión) se verá más adelante. Elnúmerodelaspersonasqueintegranlapoblacióndereferenciasueleserinmensoy,porlotanto imposible de obtener. Por esta razón se recurre a la teoría estadística del muestreo y se define la muestra dereferencia:ungruporepresentativodelapoblacióndereferenciasobreelqueserealizaránlas determinacionesanalíticasysobrelosdatosobtenidosseinferirálosparámetrosdelapoblación.Es evidente que al actuar así se introducirán errores debido a la imperfección de la selección de los individuos. Esta imperfección, no obstante, será reducida según vaya aumentándose el tamaño de la muestra. Por esta razónsedefinenunosintervalosdetolerancia,enfunción,enfuncióndelnúmerodeindividuosque constituyenlamuestradereferencia,decadaestimacióndelosparámetrosdelapoblación.Dentrode estos intervalos de tolerancia se contiene con una probabilidad determinada el auténtico valor del parámetro poblacional: media aritmética, desviación típica, etc. 4 Lasdistribucionesdeprobabilidaddelosdatosrecogidosenlamuestradereferenciaconstituyenla distribución de referencia. Esta distribución no sigue necesariamente un modelo gaussiano, sino más bien la obtención de tal modelo suele ser excepcional. El tipo de distribución condiciona el tratamiento estadístico de los datos. Laprobabilidaddequeunresultadoformepartedelapoblacióndereferenciaalolargodetodala distribuciónes,obviamente,máxima(igualalaunidad).Enotraspalabraselintervaloderesultados analíticos que contienen la máximaprobabilidad,laprobabilidadigualauno,esaquelqueestádelimitado por los valores máximo y mínimo. Generalmente se suele definir el intervalo de referencia como el intervalo de resultados que comprenden un 95 % de la probabilidad total. Los límites de este intervalo son pues los límites de referencia y, por proceder de una muestra de la población, están sujetos al intervalo de tolerancia al que aludimos antes. Losvaloresdereferenciapuedensercategorizadossegúndiferentescriterios,porejemplovaloresde referenciabasadosenpoblaciónovaloresdereferenciabasadosenindividuosloscualespuedenser univariados o multivariados, tiempo especificados o tiempo no especificados. Lamayoríadelosvaloresdereferenciapublicadossonvaloresdereferenciabasadosenpoblación, univariadosytiemponoespecificados,esdecirlosespecímenessontomadosdevariosindividuosde referencia sin tener en cuenta los ritmos biológicos y analizados para un tipo de magnitud. 5. Determinación de valores de referencia La determinación de valores de referencia en un laboratorio clínico se hace necesario fundamentalmente en dos situaciones: •al instaurar la medición de un nuevo constituyente; •al utilizar un método nuevo o diferente. Para la determinación de los valores de referencia hay que cumplir una serie de requisitos tanto en la fase preanalítica como en las fases analítica y postanalítica. Enlafasepreanalítica,unpuntoclaveeslaseleccióndelosindividuosdereferencia.Estoesquizásla parte más crítica del trabajo, ya que cuanto más estrictos seamos en la definición de individuo de referencia, seobtendránvaloresdereferenciamejoresymásrepresentativos,peroelnúmerodeindividuosseverá disminuido marcadamente. El mayor de los problemas es definir el estado de salud. El límite entre salud y enfermedadpuedellegaraserdifusoyademásvariardeinstituciónainstitución.Porestodeberían definirse claramente los criterios utilizados en la literatura para que se pudieran utilizar los mismos criterios. Dadas las dificultades en la definición de salud, conviene aplicar los criterios de exclusión, basándose en un aseriedeexámenes,historiaclínica,examenfísicoypruebasdelaboratorio.Elprimerpasoparala selección de los individuos de referencia es establecer los criterios de exclusión. Estos criterios deberían ser descriptos ydocumentados,paraqueseafactiblerealizarcomparacionesconotroslaboratorios.Entrelos criterios de exclusión para los valores de referencia podemos citar los siguientes: Condiciones patológicas o intervención médica Hospitalización Cirugía reciente Transfusión reciente Drogas Anticonceptivos orales Drogas prescriptas Drogas de abuso Abuso de vitaminas Alcoholismo Tabaquismo Factores de riesgo Obesidad Ocupación Factores genéticos Estados fisiológicos Embarazo Lactancia Presión sanguínea 5 Tambiénessumamenteimportanteyapropiadoestablecer,mediantecriteriosdepartición,lossubgrupos de referencia elegidos. Entre los criterios de partición para los valores de referencia se pueden citar: Edad Factores genéticos Raza Sexo Grupo sanguíneo Factores fisiológicos Variación circadiana Momento del ciclo menstrual Momento del embarazo Hábitos personales Dieta Ejercicio Consumo de alcohol Consumo de tabaco Factores preanalíticos Hora del día en que se hace el muestreo Tipo de extracción sanguínea Factores ambientales Altitud Época del año En la preparación de los sujetos para la determinación de los valores de referencia hay que tener en cuenta los siguientes factores: Factores críticos Factores biológicos: metabólicos, hemodinámicas, inducción enzimática, daño celular Factores metodológicos: obtención de muestra, transporte de muestra, manipulación de muestra Factores de variabilidad y estandarización Factores preanalíticos Preparacióndelindividuo:dietaanterior,ayuno,régimendedrogas,momentodela toma de muestra en relación con los ritmos biológicos, actividad física, encamado o no, estrés Obtencióndemuestra:condicionesambientalesdurantelatomademuestra, momento, postura del cuerpo, sitio de la toma de muestra, preparación del sitio de la toma de muestra, flujo sanguíneo, equipo, técnica Manipulación de la muestra: transporte, coagulación, separación del suero o plasma, preparación para el análisis Porotrapartelaseleccióndelosindividuosdereferenciapuedehacerseatendiendodiversosinteresesy recursosdisponibles.Loscriteriosdeexclusiónautilizardependendelusoqueseharádelosvaloresde referenciaydelamagnitudmedida.Lasparticionesdeberánlimitarseaaquellosvaloresdereferencia cuyas diferencias sean significativas. Para la toma de muestra se puede aplicar un muestreo directo cuando se toman individuos al azar de una poblaciónsana.Avecesseencuentraladificultaddenolograrelnúmeroapropiadodeindividuos,porlo quegeneralmenteselosbuscaenlosexámeneslaboralesoenmuestreodevoluntarios.Tambiénpuede serpormuestreoindirectocomoelquesehacesobreunapoblaciónnoseleccionada,aunqueestos métodos dan distribuciones sesgadas hacia los valores patológicos y con desviaciones típica mayores. En la literatura se han definido otros métodos de muestreo: •Apriori:requieretenerbiendefinidosloscriteriosdeexclusiónyparticiónantesdelaselección.Esel mejormétodoparaprocedimientosdelaboratoriobienestudiadosydondeseconocenlascausasde variabilidad biológica. Luego de obtener de la literatura una lista de exclusión y partición, se realiza un cuestionario para excluir del muestreo a quienes no cumplen con los criterios fijados. •Aposteriori:puedeserapropiadoparaprocedimientosnuevosopocoestudiadosycuandosetiene pocainformación.Tambiénenestudiosparadeterminarcriteriosdeexclusiónypartición.Enprimer 6 lugar se realiza el muestreo y luego la exclusión y partición. Resulta particularmente indicado cuando los factores que definen los subgrupos no son bien conocidos. Loscriteriosdeexclusiónantesexpuestos,aligualqueloscriteriosdepartición,contribuyenadefinirla población.Paralaexclusiónoparticiónsedebenplantearcuestionesconpreguntassimplesquese responderánporsíono.Encuantoaloscriterios departicióndependendelconstituyente,porejemplola hemoglobinaseafectaporlaedadyelsexo.Otrasvecesuncriteriodeparticiónpuedesertambiénun criterio de exclusión como es el caso del embarazo. Otros factores preanalíticos a tener en cuenta son los siguientes: Momento de obtención Hora del día Horas después de despertarse Minutos después de descanso Consumo de alimentos (24 h antes de la obtención) Comida Agua Alcohol Posición del individuo Sentado Acostado Punto de obtención Vena antecubital Vaso sanguíneo Tiempo que el torniquete se encuentra ajustado en el brazo Uso de tubo separador de suero En la fase analítica, se debe asegurar que el procedimiento y el instrumento analítico sean similaresalos utilizados en los estudios clínicos y que todos los procedimientos estén bajo control, monitorizandoporun sistema de control de calidad apropiado. En caso contrario los intervalos de referencia obtenidos no tendrán validez. Enlafasepostanalítica,elanálisisdelosdatossepuedehacerdedosformas,dependiendodeltipode distribución.Sisetratadeunapoblacióncondistribucióngaussiana,sepuedecalcularlamediayla desviación típica de los valores para crear el intervalo de confianza del 95 %. Si no se conoce la distribución delosvaloresonoesgaussiananitransformableengaussiana,elmétodonoparamétricoeselmas sencillo, el más directo y el adecuado. Se calculan así los percentiles 2,5 y 97,5 como límites de referencia. 6. Preparación de los individuos de referencia La estandarización de la obtención de especímenes es importante para el control de variables preanalíticas que pueden influir en la dispersión del intervalo de referencia o no ajustar el valor observado a la población de referencia. Se pretende definir una situación estándar o basal en la que las condiciones del individuo, de la técnica y del material de obtención de especímenes estén perfectamente establecidas. Lascondicionesqueseexponenluego–basadasenrecomendacionesefectuadasporlaSociedad EscandinavadeQuímicaClínica–debenseridénticasalasquesepracticaránenlarutinahabitualdel laboratorio. Lascondicionesdepreparacióndelosindividuosdereferenciaydeobtencióndelosespecímenespara analizardebenserconocidasporlosclínicosquerecibiránlosinformesdellaboratorio.Silosvaloresde referencia son objeto de eventual transferencia a otro centro es imprescindible comunicar de alguna forma lasmodalidadesdepreparaciónyobtencióndelosespecímenes,conelfindelograrunainterpretación correcta. 6.1. Preparación para la obtención de especímenes Lassiguientesrecomendacionesserefierenalaestandarizacióndelosaspectosrelacionadosconla extracción de sangre. 6.1.1. El día anterior a la obtención del espécimen Se recomienda una ingestión energética total no superior a 8400 julios diarios, distribuidos de modo que la últimacomidanosuperalos2000julios.Laingestiónseráinferiora2gramosyúnicamentedurantela 7 comidaprincipal.Seindicarálaprohibicióndefumar.Desdelas21:00hserestringirácualquiercomida, únicamente se autorizará la ingestión de agua. Se aconseja reposar desde las 22:00 h. 6.1.2. Instrucciones para el día de la obtención del espécimen: individuos hospitalizados No se les autorizará ir al lavabo una hora antes de la extracción. No se permitirá trabajo muscular desde 15 minutos antes de la extracción ni durante el tiempo en que se realice. 6.1.3. Instrucciones para el día de la obtención del espécimen: individuos ambulatorios Se le indicará que se levante de la cama entre una y tres horas antes de la extracción. El desplazamiento hasta el centro donde se efectuará la extracción en transporte público o personal se limitará a un máximo de unahora.Eldesplazamientoandandoavelocidadmoderadaselimitaráa500moa20minutos.En cualquiercasoseanotaráestacircunstancia,ysielindividuoacudeconduciendopersonalmenteel automóvil. 6.2. Extracción Laextracciónserealizaráenintervalosfijos.Enindividuoshospitalizadosconelbrazohorizontal;en individuos ambulatorios con el brazo a 45º del plano horizontal. La piel se desinfectará utilizando siempre el mismodesinfectante.Serecomiendaelusodeetanolo2-propanol70%,oclorhexidina0,5%,dejando secar antes de proceder a la flebotomía. Se utilizará siempre el mismo tipo de material, que previamente se habrácomprobadoquenoproduceinterferenciasconlasdeterminaciones.Noserecomiendaelusodel torniquete,nilacompresióndigitaldelasvenas.Cuandoseaimprescindibleseindicaráporescrito,así como todas las dificultades halladas. Si se requiere una segunda flebotomía se practicará en el otro brazo, trasundescansode15minutos,enelquenoseautorizaráalenfermonilevantarsenirealizarningún esfuerzo muscular. 6.3. Preparación del espécimen Si se desea obtener plasma, la sangre (con el anticoagulante apropiado) Se centrifuga a 1200 x g durante 10minutos;casodequehayaquecongelarlamuestra,separarelplasmasobrenadantedelascélulas, transfiriéndolo a un tubo adecuado. Si se desea obtener suero, la sangre (sin anticoagulante) se mantiene a temperatura ambiente al abrigo de la luz durante el tiempo necesario para su coagulación; seguidamente se centrifugará y se actúa lo mismo que en el caso del plasma. 6.4. Almacenamiento del espécimen Siladeterminaciónanalíticaserealizadentrodelas3hsiguientessemantendráelespécimena temperaturaambiente.Siladeterminación serealizadentrodelas24hsiguientesalaextraccióna4ºC. Porúltimo,siladeterminacionesrealizadentrodelos7díassiguientesalaextracción,semantendrán alícuotascongeladasa–20ºC;ladescongelacióndeestasmuestrasseharáenunabañoa37ºC, homogeneizándose por inversión y evitando una nueva congelación. Serecomiendaqueenelprotocolodeobtencióndevaloresdereferencia,oenlahojadepeticiónde análisis,sereserveunespacioparaquelapersonaencargadadelaobtencióndeespecímenespueda indicarlaseventualidadesaparecidasendichaobtención.Tambiénserecomiendaproveeralindividuode una hoja que contenga información sobre lo que va hacer, así como instrucciones claras y precisas acerca de las condiciones de preparación previa a la recogida del espécimen. 6.5. Recomendaciones especiales Debetenerseencuentaqueestasrecomendacionessehacenconcaráctergeneral.Enlaproducciónde valores de referencia de ciertos constituyentes bioquímicos deberán adoptarse otro tipo de precauciones. Sobre conservación de muestras puede verse el documento correspondiente que aparece en la página web de la SEQC. 7. Control de calidad en la producción de valores de referencia Dentrodelainformacióngeneralquedeberásuministrarsealclínico,debeconstarla“inveracidad”, imprecisión(osusuma,inexactitud),especificidadanalítica(substanciasinterferentes),procedimientosde control de calidad y variabilidad a largo plazo, que mediatizarán la obtención de los valores de referencia. 8 Lavarianzadelintervalodereferenciaobservado ( ) 2 0 s puedeconsiderarsecomolasumadelavarianza debida a la variación fisiológica (intra e interindividual) ( ) 2 v sy la variación metodológica ( ) 2 m s . La relación entre ambas puede formularse: 2 2 2 0 v m s s s = + Esta relación es correcta cuando se trata de distribuciones gaussianas, en las que el intervalo de referencia hasidocalculadopormétodosparamétricos.Cuandonoseaésteelcaso,noesenrigorutilizable.Sin embargo, en muchas ocasiones la contribución de la variación metodológica es pequeña, por lo que puede utilizarse de forma aproximada. 8. Descripción de la muestra de referencia Lamuestradereferenciaesunsubconjuntodelapoblacióndereferencia.Losresultadosanalíticos obtenidos en los elementos de este subconjunto son valores de una variable aleatoria real. En la producción de valores de referencia se obtiene, por tanto, una serie estadística constituida por un conjunto de números reales.Puestoquelaenumeracióndelaserienoesunmétodoadecuadoparatransmitirinformación,la información contenida en esta serie se describirá mediante unos parámetros que caractericen su tendencia central y su dispersión. Otro procedimiento, la expresión de su función de distribución, no es por lo general, ni fácil de obtener ni de interpretar. 8.1. Descripción gráfica de una muestra de referencia Serecomiendarepresentar siemprelosvaloresdereferenciaantesde procederacalcularlosrespectivos intervalos.Elhistogramaeselmétodográficohabitualparapresentarlosdatos.Esungráficode rectángulosdibujadoenunsistemadecoordenadasenelquelamagnitudmedidaserepresentaen abscisasylafrecuenciarelativaenordenadas.Eláreadecadarectánguloesproporcionalalnúmerode observaciones de la correspondiente clase. La adecuada selección del tamaño del intervalo de clase (amplitud) es importante para obtener el máximo deinformacióndelhistograma:sesgo(asimetría),curtosis(apuntamiento),datosaberrantes,etc.Un procedimientorecomendadoparaobtenereltamañodelintervaloenelhistogramaconsisteenaplicarla siguiente fórmula: 1 3, 321 log máximo mínimo x x amplitud n − = + × 8.2. Pruebas de gaussianidad El desarrollo de intervalos de referencia paramétricos exige que la distribución de referencia sea gaussiana, y en caso contrario deberá optarse por: (a) transformar los datos para obtener una distribución gaussiana; o (b)procederacalcularintervalosdereferencianoparamétricos.Esunhechoconstatadoqueunbuen número de distribuciones de variables biológicas se apartan claramente de la distribución de Gauss. Por ello noserecomiendaasumir,deentrada,lagaussianidaddeladistribución,debiéndosecomprobarencada caso. Para verificar la gaussianidad de una población hay varios tipos de pruebas y la IFCC recomienda dos: los coeficientes de sesgo y curtosis (tests de coeficientes) y el test de Anderson–Darling. 8.3. Transformaciones Lastransformacionesmatemáticasdelosvaloresdereferenciatienenporobjeto:(a)conseguirquela varianza sea uniforme en todo el intervalo de valores; (b) conseguir la aditividad en análisis de varianza; (c) normalizarladistribucióndefrecuencia;y(d)linealizarunadistribución.Desdeelpuntodevistadela produccióndevaloresdereferencialanormalizacióndeunadistribucióndereferenciapermitiráelcálculo deintervalosdereferenciapormétodosparamétricos,lahomogeneidaddelasvarianzaspermitiráutilizar pruebas paramétricas en la comprobación de la hipótesis de la igualdad de varios intervalos de referencia, por ejemplo entre sexos, y la linealidad permitirá realizar estudios de regresión lineal paramétricos. El cálculo de intervalos de referencia paramétricos parece ser más preciso que los no paramétricos, aunque sóloseaporqueenlosparamétricosparticipantodoslosvaloresnuméricosdelaserieestadística, 9 condensándoselainformaciónendosparámetrossuficientementeconocidos:lamediayladesviación típica. Deberáevaluarselaeficaciadelatransformaciónchequeandolosdatostransformadosconuntestde normalidad.Segúnquelafaltadenormalidadsedebaasesgooacurtosis,seutilizaránlas transformaciones que se verá más adelante. Algunas veces, cuando existe asociación entre la variación intra e interindividual, deberá hacerse el proceso endosfases:unaprimeratransformaciónenlaqueporejemploseelimineelsesgoyenmenorgradola curtosis, y una segunda transformación, en la que se elimine la curtosis restante. 8.3.1. Corrección del sesgo Las transformaciones logarítmica, logarítmica ampliada y potencial: ( ) ( ) log log a y x y x c y x = = + = son especialmente útiles para corregir el sesgo positivo De una forma general, la transformación( ) log x c +sugeridaporBoydyFlinn,yquetieneigualpotencia que la transformación raíz cuadrada, puede ser recomendable cuando se trabaja con ordenadores, ya que el cálculo de la constantecdebe hacerse por procedimientos iteractivos. La transformación potencial de Box y Cox tiene la ventaja de corregir tanto el sesgo positivo como negativo, cuando0 x > . Sin embargo, se requiere un proceso iteractivo por ordenador para el cálculo de la constante c . LatransformaciónexponencialdeManly,porsucaráctergeneral(puedeaplicarsetantoadatospositivos como negativos) ha sido recomendada; asimismo se recomienda utilizar datos estandarizados a media cero y desviación típica unidad, substrayendo de cada valor original la media y dividiendo por la desviación típica. 8.3.2. Corrección de la curtosis Lacurtosispositivapuedesereliminadaenocasionesutilizandolatransformaciónsenohiperbólicodelas variables estandarizadas tras la corrección del sesgo: ( ) -1 2 senh 2 senh ln 1 x x e e x x x x − − = = + + La platicurtosis es eliminable utilizando la transformación inversa. La curtosis en ambos sentidos se elimina utilizandolafunciónpotencial,segúnBoydolafunción,modulardeJohnyDraper,aunquebajola suposicióndequeladistribuciónessimétricaydequelosdatoshansidopreviamenteestandarizados: Ambastransformacionesrequierenlautilizacióndelordenadorpararealizarlascorrespondientes iteraciones. 8.3.3. Reconversión de los datos Unavezcalculadosloslímitesdereferenciaapartirdelosdatostransformados,elintervalodereferencia definitivoseobtendráutilizandolatransformacióninversaparadeshacerelanamorfismo(transformación) utilizado. Los intervalos de referencia definitivos serán diferentes a los obtenidos sin la transformación de los datos, o incluso pueda que sean asimétricos. 8.3.4. Conclusión Silasdistribucionesdereferencianosonnormales,ylastransformacionesreferidasresultanineficaces parasunormalización,deberáutilizarseunmétodonoparamétrico,quesatisfaceunbuennúmerode requisitos sin tener en cuenta la forma de la distribución. 8.4. Detección y tratamiento de valores aberrantes La dispersión que se halla en un Intervalo de referencia es la suma de la dispersión debida a: (a) la propia poblacióndereferencia,esdecirlasumadelasvariacionesintraeinterindividuales;(b)lavariación 10 atribuiblealosprocedimientosanalíticosutilizados(erroranalítico);(c)loqueAscombellamaerrorde “ejecución”, por ejemplo, equivocaciones en la selección de la muestra de referenciaenlaquese hubiera incluidounindividuoenfermo,queintroducevariaciones“disparatadas”.Cuandounvalordereferenciase encuentraespecialmentealejadodelconjuntoconstituidoporelrestodelamuestradereferencia,sele califica de valor aberrante; ya sea porque refleje un error analítico no tolerable, o un error “de ejecución” que lo sitúa en una región de “improbabilidad”. 8.4.1. Detección de datos aberrantes Por regla general no es posible conocer con certeza si un determinado valor de referencia es o no un valor aberrante; por otra parte, la detección de datos aberrantes se fundamenta, en la mayoría de los casos, en la suposicióndequeladistribucióndereferenciaseajustaaunmodelodeterminado,habitualmente gaussiano.Porlotanto,lavalidezdeladeteccióndedatosaberrantesdependeráengranmaneradela validez de tal suposición. Existen muchos procedimientos para detectar valores aberrantes. A continuación nos vamos a referir a dos. Una fórmula de utilidad es la que se indica a continuación: ( ) | | ( ) | | 3 3 1 1 3 1 1, 5 1 1, 5 2 Q Q Q Q Q Q + − − − donde: 1 Q es el primer cuartil (o percentil 25); y 3 Q es el tercer cuartil (percentil 75). Todovalormayorque | | 1 oinferiora | | 2 esunvaloraberrante.Estafórmulaesmuyútilporquees independiente del tipo de distribución. OtrapruebautilizadaparadetectardatosaberrantesomarginaleseseltestdeReed.Esteconsisteenel cálculo del cociente D R donde D esladiferenciaabsolutaentrelaobservaciónextrema(máximaomínima)yelsiguiente valor; R es el rango (amplitud) de todos los datos, incluyendo los extremos. Este cociente debe ser menor que 1 3 . Si es mayor que este valor se trata de un dato aberrante (marginal). 8.4.2. Estimaciones con datos aberrantes Sehanpropuestodossolucionesparaevitarperturbacionesocasionadasporlaexistenciadedatos aberrantes: (a)eldesarrollodeestimacionesdeparámetrosdelapoblacióndereferenciarobustos(resistentesala existenciadedatosaberrantes)yeficaces(conpocapérdidadeinformación);estimandolamediaa partir de la mediana y la desviación típica a partir de múltiplos del intervalo interfractílico. (b)recortar la muestra de referencia y estimar a continuación los parámetros La estimación de la media a partir de la mediana según el modelo (a) tiene una eficacia del 64 %, y por el procedimiento(b)de100 30 g − (siendog elporcentajedevaloresrecortados).Laestimacióndela desviacióntípicaporelmétodo(a)tansólotieneunaeficaciadel37%,mientrasqueporelmétodode Dawson puede llegar al 98 %. 8.4.3. Actitud ante los datos aberrantes Una completa información de la producción de valores de referencia debe necesariamente hacer alusión al número y procedimiento utilizado en la detección de datos aberrantes. Ante la presencia de un dato aberrante no debe actuarse con ligereza eliminándolo sin más, sino que debe procederse a una cuidadosa revisión e investigación acerca de la procedencia de tales valores aberrantes: debe averiguarse si lo es por tratarse de un error analítico excesivamente grande, por ejemplo revisando el protocolodecontroldecalidadyrepitiendoladeterminaciónanalítica;obiensisetratadeunerrorde 11 ejecución al seleccionar la muestra de referencia, por ejemplo un individuo que sufriera una enfermedad en el momento de ser calificada como individuo de referencia. Unavezconocidoelorigendeldatoaberrante,podráactuarseenconsecuencia:eliminándosedela muestradereferencia,obienrevisandoloscriteriosdeinclusiónyporlotantoelrestodeindividuosde referencia, o bien admitiendo que la distribución de referencia posee un sesgo mayor del previsto. 9. Determinación de intervalos de referencia 9.1. Diferentes tipos de intervalos de referencia Existen varios tipos de intervalos de referencia, cuya diferencia reside en sus bases teóricas, ya que en la práctica si se dispone de un número adecuado de datos los valores numéricos que se obtienen al aplicarlos son muy semejantes entre sí. Estos intervalos son: Intervalointerfractílico.Eltérminofractilindicaunvalorporencimaopordebajodecualexisteuna proporcióndeterminadadelosdatosdeladistribución.Unaextensión deltérminofractilesladepercentl, esto es, el fractil referido a 100 datos. Este tipo de intervalo es el más utilizado. Los valores comprendidos entredosfractiles(generalmenteel2,5yel97,5)delimitanelintervalodereferencia.Estoslímitesse escogendeformaarbitrariay,enocasiones,puedenserasimétricos.Porestarazóndebeexpresarsea partir de qué fractil se ha calculado el intervalo. Existen dos problemas en la utilización de los fractiles. En primer lugar, el intervalo de referencia obtenido enlamuestradedatosutilizadasóloesunaestimacióndelintervalodereferenciadelapoblaciónde referencia, siempre y cuando los individuos que compongan esta muestra hayan sido escogidos al azar. El segundo problema es la imprecisión de los fractiles de la muestra como estimación de los de la población. Esta imprecisión está inversamente relacionada con el tamaño de la muestra; cuanto mayor sea el tamaño delamuestra,menorserálaimprecisióndelosfractiles.Ambosproblemasseminimizanalaumentarel número de datos de la muestra. Intervalodetolerancia.Esteintervaloesaquelenquesehallacomprendidaunaproporciónespecíficade los valores de referencia con un grado de confianza determinado. En este caso debe cumplirse la condición delamuestraalazar,yaqueesteintervalodereferenciasebasaenlacertezadequelamuestraes realmente un estimación de la población. Intervalodepredicción.Esunintervalodefinidoporunoslímitessuperioreinferior,entreloscuálesse espera que se halle comprendido un valor de referencia con un grado de confianza determinado. También en este caso debe cumplirse la condición de la obtención aleatoria de la muestra. De todo lo expuesto resulta claro que es preferible determinar el intervalo de referencia por el método de los fractiles. Estos siempre son una descripción válida de los valores de referencia y si la muestra está obtenida al azar, se puede obtener una estimación de los verdaderos fractiles de la población. El cálculo de los intervalos de referencia, dependiendo de que la distribución se ajuste o no a la gaussiana, puede hacerse mediante métodos paramétricos –con estimación de parámetros, y por lo tanto relacionados con la forma de la distribución– o por métodos no parámetricos que son independientes de la distribución. 9.2. Cálculo paramétrico del intervalo de referencia Cuandounadistribuciónesgaussiana,losparámetrosdelapoblación,mediayvarianza,puedenser estimados a partir de los estadísticos muestrales con un intervalo de confianza determinado. Este intervalo de referencia es, en principio, el más sensible y preciso, 9.2.1. Intervalo interfractílico Para calcular el intervalo interfractílico se procederá de la forma siguiente: (a)Calcular las estimaciones de la media y la desviación típica de la forma usual; (b)Calcular los límites de referencia de acuerdo con la fórmula: l x k s = ± donde:k es el valor de la distribución de Gauss para el nivel de probabilidad fijado (generalmente se toma0, 05 α = , siendo entonces1, 96 k = ). 12 Ellímitesuperiorasícalculadocorresponderíaalfractil ( ) 0, 05 1 0, 975 2 − = (percentil97,5)yel inferior al fractil 0, 05 0, 025 2 =(percentil 2,5). (c)Calcular el intervalo de confianza paramétrico de cada fractil. La siguiente expresión permite calcular el intervalo de confianza al 90 % de cada fractil 2, 81 s fractil n ± donde:s es la desviación típica de la muestra en cuestión; y n es el número de datos. 9.3. Determinación no paramétrica del intervalo de referencia Aunque el primer intervalo de referencia no paramétrico fue publicado en 1938, no es hasta 1950 cuando s empieza a utilizar en Bioquímica Clínica unos intervalos interfractílicos no paramétricos para clasificar a los individuos.En1958sepublicanlasprimerasrecomendacionesformalesacercademétodosno paramétricosparaobtenerelintervalodereferencia,queposteriormenteserárecomendadopordiversos autores.Aunqueenteoríalosintervalosasíconstruidossonmásimprecisosquelosparamétricos,enla práctica no presentan grandes diferencias. Procedimiento para el cálculo de los intervalos interfractílicos: (a)Ordenarlosvaloresdereferenciaenordenascendente,aunqueenrealidadbastaconordenarunos cuantosvaloresporambosextremos.Encasodequeexistanvaloresdereferenciarepetidos,se adjudicarán números de orden sucesivos, aunque tengan el mismo valor numérico, o bien se obtendrán resultados analíticos con más decimales de los habituales para deshacer los empates. (b)Calcularlosfractiles–generalmentelospercentiles2,5y97,5–correspondientealoslímitesde referencia, mediante las expresiones siguientes: ( ) ( ) 0, 025 1 0, 975 1 fractil inferior n fractil superior n = + = + Loslímitesdereferenciaseránlosvaloresdereferenciacuyoordenseaelindicadoporelfractil.En caso de obtener un número con decimales, se interpolará el valor de referencia correspondiente. Supóngase que se tiene una muestra de referencia de 199 datos, cuyos diez primeros datos ordenados de menor a mayor son los siguientes (en la línea inferior se indica su número de orden): { } { } 24, 0 , 24, 3 , 25, 0 , 25, 8 , 26, 5 ,27, 3, 28, 0,28, 7 , 29, 0, 29,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 y los diez últimos son: { } { } 107, 5 , 109, 3 , 110, 3 , 112,1 , 112,1 , 112, 4 , 113, 5 , 113, 9 , 115, 0 , 115, 7 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 El resultado sería el siguiente: ( ) ( ) 0, 025 1991 5 26, 5 0, 975 1991 195 112, 4 fractil inferior dato número fractil superior dato número = + = = = + = = (c)Calcular el intervalo de confianza de cada límite de referencia. Generalmente se calculan Intervalos de Confianza al 90 % o al 70 %. Puede hallarse varias tabulaciones en la literatura. Segúnestastablas–basadasenunadistribuciónbinomial–elintervalodeconfianzaal90%,parael fractil 0,025 estará comprendido entre el dato número 2 y el dato número 10 : (24,04; 29,05). Tabla 1 yelintervalodeconfianzaparaelfractil97,5estarácomprendidoentreeldatonúmero190yeldato número 197: (107,5; 113,9). 13 n inferior superior n inferior superior n inferior superior 120 1 7 418 6 17 725 12 26 133 1 8 436 6 18 733 12 27 161 1 9 469 6 19 766 12 28 188 2 9 471 7 19 774 13 28 190 2 10 501 7 20 800 13 29 219 2 11 523 8 20 823 14 29 249 2 12 534 8 21 834 14 30 250 3 12 566 8 22 868 14 31 280 3 13 575 9 22 872 15 31 308 4 13 599 9 23 902 15 32 310 4 14 625 10 23 920 16 32 341 4 15 632 10 24 936 16 33 364 5 15 666 10 25 968 17 33 373 5 16 675 11 25 971 17 34 404 5 17 699 11 26 Tabla 1. Número de orden de los valores que constituyen el intervalo de confianza con probabilidad de 0,90 del fractil 0,025. Los correspondientes valores del fractil 0,975 se obtiene restando de( ) 1 n+ los resultados obtenidos para el fractil 0,025.nes el número de observaciones que constituyen la muestra de referencia. “inferior” es el número de orden del límite de confianza inferior y “superior” el número de orden del resultado que constituye el límite superior del intervalo de confianza. 9.4. Tamaño de muestra para la determinación de los valores de referencia Laimprecisiónenlaestimacióndelosfractilesaumentaenlamedidaqueeltamañodelamuestra disminuye. Losαfractiles y( ) 1 α −fractiles no son estimables al menos queαsea como mínimo del orden de 1/n, siendo n el tamaño de muestra (estimación paramétrica). De este modo la determinación paramétrica de los fractiles 0,025 y 0,975 requiere al menos 40 valores. Paraobtenerestimacionesnoparamétricasfiablesdelosintervalosdeconfianzaal90%delosfractiles tanto la IFCC como el NCCLS recomiendan como mínimo un tamaño de muestra de 120. 9.5. Determinación del intervalo de referencia en muestras “censuradas” Unamuestraaleatoriasedenomina“censurada”cuandoalgunasobservacionesquedansituadasenuna región perfectamente identificable pero cuyos valores absolutos se desconocen. Por ejemplo, los valores de referencia obtenidos en aquellas determinaciones analíticas cuyo método tenga un límite detección tal que unciertonúmerodevaloressoninferioresadicholímitededetección lod x ,comunicándoseelresultado como “menor que lod x ”. Se clasifican las muestras censuradas como “tipo I” cuando existe un punto fijo a partirdelcualseobtienelainformacióncuantitativa,yun“tipoII”cuandoesunnúmerofijode observacionesparaelquenosedisponedevalorescuantitativos.Enellaboratorioclínicoelcasomás habitual es la existencia de muestras censuradas tipo I. 9.5.1. Estimación de Intervalos de referencia en muestras censuradas tipo I Procedimiento: (a)Estimarelvalordelamediaylavarianzaapartirdelosdatosexistentesmediantelassiguientes fórmulas.Losdatosdebensernormales(onormalizables)mediantelastransformacionesoportunas según se comentó anteriormente). 14 ( ) ( ) 2 2 * lod lod x x x x s s x x λ λ = − − = + − donde * xy 2 * s sonrespectivamentelasestimacionesdelamediaylavarianzadelapoblación censurada; xy 2 s son respectivamente la media y varianza muestrales; lod x es el límite de detección; y λ es el valor tabulado por Cohen (Tabla 2) al que se accede mediante el cálculo de los parámetros: ( ) 2 2 lod s g x x n m h n = − − = Supóngase que se tiene la siguiente serie de resultados de una muestra de referencia , se recomienda la partición; •Si1, 5 R≤ calcular L D y U D ,lasdistanciasentreloslímitesmásbajosymásaltosdereferencia, respectivamente,delosgruposyusarladesviacióntípicadelsubgrupomáspequeñacomoescala unidad( ) s ; •Si ambas L D y U Dson0, 25s < , no se recomienda la partición; •Si L D , U Destá en el intervalo | | 0, 25 , 0, 75 s sy ninguna es0, 75s ≥ , la decisión de partición debe hacerse en base a otras consideraciones que las meramente estadísticas (marginal); •Si L D , U D o ambas son0, 75s ≥se recomienda la partición. 10.3. Criterio de Linton Recomiendan dividir los datos en subgrupos. Si la diferencia entre las medias de los subgrupos excede el 25%delaamplituddelintervalodereferenciadel95%paraelgrupocombinado,serecomiendala partición. 17 10.4. Consideraciones no estadísticas Las consideraciones no estadísticas necesarias en los casos marginales pueden incluir las siguientes: •¿esfácilenlaprácticaclínicaobtenerlainformacióndeseadaparaserusadacomounsubgrupo descriptor? •¿seusaellímitedereferenciacomounlímitefijadodedecisiónclínica(valordiscriminante,puntode corte)? Unarespuestapositivaaesta cuestiónapoyalaparticiónporque seincrementalaimportancia de un límite de referencia preciso; •¿apoyan los datos de la literatura la partición? Esimportanterecordarquelaaplicacióndeestasreglaspresuponenqueladistribucióndelossubgrupos son normales o han sido transformadas en normales mediante la transformación de los datos (por ejemplo, logarítmica), y que los tamaños deben ser en cada grupo lo que anteriormente se comentó. 11. Valores de referencia intraindividuales 11.1. Variabilidad intraindividual La variabilidad total de los resultados analíticos puede expresarse de la siguiente forma : 2 2 2 2 2 T ea a b w s s s s s = + + + donde: 2 T s es la varianza total; 2 ea s es la varianza extraanalítica; 2 a s es la varianza analítica; 2 b s es la varianza interindividual; 2 w s es la varianza intraindividual. Lavariabilidadbiológicainterindividual, 2 b s ,seestimacomoladispersióndelosresultadosanalíticos obtenidos en una serie de individuos de referencia en idénticas condiciones. La variación intraindividual, 2 Bw s , se calcula mediante la dispersión de los resultados analíticos obtenidos en un mismo individuo en las mismas condiciones que definen, por ejemplo, un estado de salud. En el estudio de la variabilidad intraindividual deben tenerse en cuenta dos factores: el periodo de tiempo durante el que se van recogiendo resultados –valores de referencia– y la frecuencia con que son obtenidos. Dentro de la variabilidadbiológicainterindividualpuededistinguirseunavariabilidadacortoplazoqueincluyelas variacionesproducidasalolargodeundíaylavariabilidadalargo'plazoqueincluyeperiodosmás prolongados, por ejemplo, meses o años. Hace años se introdujo el concepto de índice de individualidad( ) . . i idefinido por la siguiente expresión: 2 2 2 . . a w b CV CV i i CV + = donde a CV representa el coeficiente de variación analítico; w CV representa el coeficiente de variación biológica intraindividual; b CV representa el coeficiente de variación biológica interindividual. Cuandoel. . i i essuperiora1,4,losvaloresdereferenciabasadosenpoblacióntienenutilidadconfines comparativos, pero si es inferior a 0,6 el intervalo de referencia basado en la población es poco sensible, ya queincrementosrelativamentegrandesobservadosenunindividuopuedenpasardesapercibidosal comparados con un intervalo de referencia, poblacional cuya amplitud lo enmascare. En la figura 1 se puede verunejemplodeunamagnitudconfuerteindividualidadbiológica,lafosfatasaalcalina,con. . 0, 6 i i < y 18 como puede observarse los valores de referencia poblacionales son de muy poca utilidad. En la figura 2 se exponeelcasodelpotasiocon. .1, 4 i i > ycomopuedeobservarselosvaloresdereferenciabasadosen población si son de utilidad. Figura 1. Medias de los individuos (círculos), intervalos individuales (barras horizontales) y límites de referencia poblacionales (líneas discontinuas) de la concentración de fosfatasa alcalina en suero de 37 sujetos sanos (16) Figura 2. Medias de los individuos (círculos), intervalos individuales (barras horizontales) y límites de referencia poblacionales (líneas discontinuas) de la concentración de ion potasio del. suero de 37 sujetos sanos. (16) Unasolucióngeneralaesteproblemaeslaparticipacióndelapoblaciónsegúncriteriosquereduzcanla variabilidadatravésdeaumentarlahomogeneidaddelasubpoblación.Otraformademejorarla 19 sensibilidaddelintervalodereferencia,enestoscasosdondelavariabilidadinterindividuales proporcionalmente mayor, es calcular intervalos de referencia para el individuo. Los valores de referencia basados en individuos son valores puros del mismo individuo, obtenidos cuando el/ellaestabaenunestadodesaluddefinido.Lacomparacióndevaloresobservadosconvaloresde referenciabasados enindividuosfrecuentementeesunmétodomássensibleparadetectar cambiosenel estadobioquímicoofisiológicoporquelavariabilidadgeneralmenteesmenorenunindividuoqueenel conjunto de individuos. 11.2. Valores de referencia intraindividuales Los valores de referencia intraindividuales se obtendrán calculando un intervalo de resultados analíticos que contenga–conunadeterminadaprobabilidad–elresultadodeanalizarunpróximoespécimensiemprey cuandosetenganencuentalosespecímenesanteriores.Unintervaloasídefinidoesunintervalode predicción y su estimación es el intervalo de referencia del individuo. Para poder utilizar un intervalo de referencia individual deberán satisfacerse las siguientes condiciones: (a)deben haberse obtenido determinaciones analíticas con las que calcular el intervalo de referencia; (b)estasdeterminacionespreviasdebenhaberserealizadoenigualdaddecondicionesporloquehace referencia tanto a los aspectos analíticos (mantenimiento de la misma inveracidad e imprecisión) como fisiopatológicos del individuo; (c)para poder efectuar el cálculo del intervalo de predicción se asume que las determinaciones analíticas fueron realizadas con una periodicidad regular; (d)losmodelosteóricosenlosquesebasanloscálculospropuestoscorrespondenalanálisisdeseries temporales. 11.3. Fundamentos teóricos Elcálculodelosvaloresdereferenciaintraindividualessebasaenlapartedelaestadísticadenominada análisisdeseriestemporales.Elanálisisdeseriestemporalestieneporfinalidadladescripciónde fenómenosquesesucedeneneltiempo,suexplicación,laprediccióndeeventosfuturos,yelcontrolde tales fenómenos si esto es posible. Los fenómenos a los que se alude son fenómenos aleatorios, es decir, queseobservanconunaciertavariabilidad,comosucedeconlosresultadosanalíticos,sinquese presupongaquelavariabilidadseaintrínsecadelosfenómenoso,porelcontrario,seaatribuiblealos procedimientos de observación. Enelanálisisdeseriestemporalesseconsideranobservacionesordenadaseneltiempoquepuedenser dependientes o no dependientes. Cuando una observación es dependiente de las anteriores, éstas pueden serutilizadasparapredecirconunmargendeconfianzadeterminado,suvalor.Sipudierapredecirsecon toda exactitud se trataría de fenómenos determinísticos, Porlogeneral,las seriestemporalesquepueden serencontradasenBioquímicaClínicasondetiponodeterminístico,estoes,quepuedenserutilizadas para predecir sólo en parte un resultado o, dicho de otro modo, predicen un resultado con un determinado grado de confianza. Aunquenodeformaunánime,enanálisisdeseriesdetiemposeconsideranvariostiposdevariación susceptible de ser analizada y posteriormente eliminada: (a)variaciones cíclicas, por ejemplo, la variación estacional, circadiana, etc.; (b)tendencias, cambios en el valor promedio; (c)fluctuaciones irregulares que se producen aleatoriamente sin seguir un patrón definido. El análisis de series temporales distingue dos tipos de modelos: los modelos estacionarios, caracterizados por la ausencia de cambios sistemáticos en la tendencia, en su varianza y en la periodicidad; y los modelos noestacionarios.Lastécnicasestadísticashacenreferenciaamodelosestacionarios.Cuandoapareceun fenómenonoestacionario,atravésdetransformacionesmatemáticassepuedeconvertirenestacionario, suprimiendo la periodicidad o la tendencia. Enuninstantet laconcentraciónrealdeunconstituyentebioquímicoes t m .Sinembargo,alexistiruna desviación o error analítico y preanalítico ya se obtiene una estimación de esta concentración: t t x m a = + Un modelo general que explique la variabilidad de t mpodría ser: 20 ( ) ( ) 1 t t t m m e u ρ u − = + − + donde: u es el valor homeostático subyacente al que tiende el constituyente bioquímico; ( ) 1 t m ρ u − − indica la influencia del último instante considerado 1 t m − ; ρ es el denominado coeficiente de autocorrelación; t e corresponde a las fluctuaciones biológicas aleatorias que se distribuyen normalmente con media 0 y varianza 2 e σ . Unodelosparámetrosparticularmenteinteresanteseseldenominadocoeficientedeautocorrelaciónρ . Esteparámetrosecalculadeformasemejanteauncoeficientedecorrelaciónentredatosapareados, teniendoencuentaqueaquíseapareaelprimerresultadoconelsegundo,elsegundoconeltercero,el tercero con el cuarto hasta el penúltimo con el último. El coeficiente de auto correlaciónρadquiere valores comprendidosentre–1,0y1,0.Siesnegativoindicaqueelvalorverdaderotiendeaoscilarentreun instanteyotro.Cuandoρesiguala0indicaquenoexisteningunarelaciónentrelasdeterminaciones. Cuandoρ seaproximaa1,0tantomásprobableesladependenciaentredeterminacionessucesivas.El valor absoluto deρigual a 1,0 indica que no existe un punto homeostático donde referirse. A partir de las observaciones disponibles se realizarán las estimaciones de los parámetrosu , 2 a σ ,ρ , 2 e σ yelintervalodepredicción.Sinembargo,paraquelasestimacionesseanválidaselnúmerode observaciones previas debe ser muy grande –sobre las cincuenta puede empezar a calcularse con ciertas garantías.Estenúmeroraramentesealcanzaenquímicaclínicaporloquedebeadoptarseunaactitud práctica, considerando dos situaciones extremas: cuando0 ρ =y cuando1 ρ = . Cuandoelcoeficientedeautocorrelaciónseacerosetendráunmodelodenominadoestrictamente homeostático. El modelo general será: t t t t m e x e a u u = + = + + Cuandoelcoeficientedeautocorrelaciónsealaunidadsetendráeldenominadomodelorandomwalk (caminoalazar).Esunmodelodeserietemporalnoestacionario,dondeeltérminodeerrores, t e ,esen realidad un número indeterminado ya que no existe el punto de referencia o valor homeostático. El modelo general será: 1 t t t m m e ∗ − = + 21 i i x 2 i x 1 i i i d x x + = − 2 i d 1 x x − ( )( ) 1 i i x x x x + − − 1 2 1 n n − 1 2 1 n n x x x x − 2 1 2 2 2 1 2 n n x x x x − 1 1 2 1 2 3 1 1 n n n d x x d x x d x x − − = − = − = − − 2 1 2 2 2 1 n d d d − − 1 2 1 n n x x x x x x x x − − − − − ( )( ) ( )( ) ( )( ) 1 2 2 3 1 n n x x x x x x x x x x x x − − − − − − − − Sumas 1 n i i x = ∑ 2 1 n i i x = ∑ 1 n i i d = ∑ 2 1 n i i d = ∑ ( )( ) 1 1 1 n i i i A x x x x − − = = − − ∑ Media aritmética 1 1 n i i x x n = = ∑ Suma de cuadrados y desviaciones 2 1 2 1 n i n i i i x SCD x n = = | | | \ . = + ∑ ∑ Varianzas 2 1 SCD s n = − 2 1 1 2 1 n i n i i i d d d n s n = = | | | \ . + = − ∑ ∑ ˆ a σ= estimación de la impresión analítica modelos homeostático autorregresivo random walk ρ coeficiente de autorrelación ˆ 0 ρ = ( ) 2 ˆ 1 ˆ a B t A SCDB σ ρ = − = − ˆ 1 ρ = c cociente entre variancias ˆ 0 c = ( ) 2 ˆ ˆ ˆ 1 1 ˆ e a SCD c B σ ρ σ ′ | | = = − − | \ . 2 ˆ ˆ 2 ˆ ˆ d d a a s c σ σ σ = = − w ponderación asignada a la última observación ( ) t x (indeterminado) 2 2 2 4 2 t H I c H H c w ρ ρ ρ = + − − + + = ( ) 2 2 4 2 t c c w − + + − = 0 2 1 i i t a t y x x y w c σ = = ± + + 0 2 1 i i t a t y x x y w c σ = = ± + + 22 ( ) 1 j j s x y − − calculada por métodos convencionales 0 x predicción 0 1 2, 5 n x x n + = ± ( ) 0 2 t j n j x y s x y − = ± − ( ) , 0 2 j n t j x y s x y = ± − Tabla 3 Laseleccióndeunouotromodeloimplicarálaformadeestablecerlosfuturosvalores.Larepresentación gráfica de las diferencias: t t t k y x y − = − frente a los diferentes valores dekpermite distinguir el tipo de modelo: si la gráfica oscila alrededor del eje se trata de un modelo homeostático; si se desplaza linealmente se trata de un modelo random walk. En esta relación1, 2, k =representa los espacios entre dos determinaciones. Enlatabla3sepresentadeformaesquemáticaelcálculodelosintervalossegúnlosdiferentesmodelos extremos,utilizandounmínimode3ó4determinaciones.Paraelcálculodelintervalodereferenciase calculará una ponderaciónw, de la observación más reciente t x . Esta ponderación depende del cociente e entrelavariaciónanalíticaylavariaciónfisiológica–diferencias t d –.Enelmodelogeneral,c′ esel cocienteentrelavariaciónbiológicaylaanalítica: 2 2 b a σ σ calculadaapartirdelafórmulacitada anteriormente, conteniendo el coeficiente de autocorrelaciónρ . Cuandounvalorobservadorebasaellímitedereferenciaintraindividualdebeserconsideradopatológico, aunque no llegue a rebasar el límite de referencia poblacional. 12. Utilización de los valores de referencia Losintervalosdereferenciapuedenutilizarseparacompararentresídiferentespoblacionesopara comparar un valor aislado con los valores de referencia. 12.1. Comparación de poblaciones Lacomparacióndediferentespoblacionesentresipuedetenerdiferentesobjetivos:(a)estudios epidemiológicosoantropológicos–queresultanobligadoscuandoseconsiderelaposibilidaddetransferir losvaloreshalladosenunapoblaciónaotradiferente;(b)estudiosdeseleccióndedeterminaciones bioquímicas, en que la población de referencia actúa de control en la valoración de la efectividad clínica de unadeterminaciónanalítica;(c)estudiosdevaloracióndeefectosdemedicamentosyotrosagentes exteriores sobre las determinaciones bioquímicas. 12.1.1. Estado de referencia En la comparación de dos o más poblaciones, puede ser interesante desde el punto de vista de economizar tiempo, esfuerzo y costes, el definir un estado de referencia en que se realizará la comparación. En base a estudios epidemiológicos, puede definirse el siguiente estado de referencia: •Individuos de 20 a 30 años; •Sin sobrecarga ponderal; •Ayuno previo de 12 h; •No tomar medicamentos; •Consumir menos de 45 g de alcohol por día; •Fumar menos de 10 cigarrillo por día; •Sin enfermedad manifiesta. 23 12.2. Comparación de un valor observado con los valores de referencia Cuandosehablade“comparación”sehaceenunsentidomástrivialqueestadísticodelapalabra.Sin embargo, no debe perderse de vista que tal comparación puede resultar equívoca si no se ajusta al máximo la población (subpoblación) de referencia a las características del individuo del que se ha observado el valor analítico que se desea interpretar. Elvalorobservadopuedepresentarsesolooacompañadodealgunatransformaciónque“suplante”su valor,yquecontengasimultáneamentelainformacióninherentealvalorobservadoyalosvaloresde referencia.Existennumerosastransformacionesdescritasenlaliteratura.Sueleccióndeberáhacerseen función tanto de la situación clínica en que deba actuarse (cribado, diagnóstico diferencial, seguimiento,…) como de las disponibilidades de cálculo o apoyo informático de que disponga el laboratorio. 12.2.1. Transformaciones lineales basadas en la dispersión de la población de referencia (a)Clasificacióndelosvaloresobservadosentrestipos.Seclasificaráalvalorobservadoentres categorías (“–1”, “0”, “+1”) si su valor está por debajo, dentro, o por encima de los límites de referencia. El intervalo de referencia vale “0”. Se trata de un procedimiento poco sensible que puede enmascarar la variaciónintraindividualyrepresentaunapobreygroserautilizacióndelintervalodereferencia.Enel casodeunamuestradereferenciaconmedia60,60perteneceríaalacategoría“0”;unvalorde30 sería “–1” y un valor observado de 100 sería “+1” (b)Clasificaciónennueve(sta-nine)odiez(sta-ten).Paraobviarlapérdidadeinformacióndelmétodo anterior,sehapropuestoaumentarelnúmerodecategoríasennueveydiez.Cadacategoría representaríalanovenaoladécimafraccióndeladesviacióntípicadelamuestradereferencia,de modo que el intervalo de referencia al 95 % valdría respectivamente [2, 8] y [1, 8]. Este sistema a pesar de representar un refinamiento respecto al anterior, no ha llegado a hacerse demasiado popular. 12.2.2. Transformaciones lineales basadas en la localización de la población de referencia Siendoxel valor de la media aritmética de la muestra de referencia, 0 xel valor observado yLel límite de referencia, se han propuesto las siguientes transformaciones: (a) 0 x x en este caso, el intervalo de referencia recubre la extensión de la recta real; (b) 0 x L en este caso el intervalo de recubre el Intervalo entre−∞ y 1; (c) 0 100 x L (“Centinormalizado”)descritoenprincipiopararesolverelproblemadelainterpretacióndelos Intervalosdereferenciadeenzimas.Elfactor 100 L esunfactorpropiodecadalaboratorio fácilmentesustituiblecuandosemodifiquelametodología,instrumental,etc..Sóloexistiríaun límite de referencia igual para todas las determinaciones, 100. 12.2.3. Transformaciones lineales basadas en la localización y la dispersión (a)Unidades SD (“USD”, desviaciones equivalentes normales, etc.) que miden la distancia a la media de la muestra de referencia en desviaciones típicas de esta muestra. Se calcula la cantidad 0 x x s − queimplicalautilizacióndedosestadísticos,x ys ,razónporlaquesedebecomprobarla gaussianidad de la muestra de referencia. De no ser normal, se desaconseja su uso. Sin embargo, se puedeutilizarconefectivossuperioresa500valoresymuestrasaproximadamentesimétricas.Con intervalosdereferenciaestrechos(desviacionestípicapequeñas)puedenobtenersevaloresUSDtan grandes como las propias magnitudes, perdiendo interés la transformación. El intervalo de referencia del 95 % sería [-1,96 ; 1,96]. (b)Transformacionesprobit.Seobtienenañadiendo5unidadesalosvaloresUSDcitadosanteriormente. El intervalo de referencia del 95 % sería [3,04 ; 6,96] (c)Valor relativo. Definido por: 24 0 2 x R R − donde R es el rango del intervalo de referencia. El intervalo de referencia del 95 % sería [-1 ; 1]. (d)Unidades clínicas, definidas por: 0 10 10 x Me R − | | + × | \ . donde Me es la mediana. El intervalo de referencia del 95 % central sería [80; 120]. (e)Unidades de cociente normal, definidas como: 0 20 20 100 x Me R R × − × + × El intervalo de referencia del 95 % sería [90, 100] (f)Valor relativo, definido como: 0 p x moda moda L − − donde p L es el límite de referencia más próximo a la moda. El Intervalo de referencia del 95 % sería [-1; 1] 12.2.4. Otras transformaciones: fractiles Esta transformación consiste en sustituir el valor observadoporelfractil correspondiente.Cuando setrata de distribuciones gaussianas se pueden calcular los fractiles (generalmente se usan percentiles) a partir de lastablasdeladistribucióndeGauss.Siladistribuciónnoesgaussiana,puedeobtenerseel correspondiente fractil a través de la comparación con una tabla de frecuencias relativas acumuladas de la distribucióndereferencia,yviendoquefrecuenciarelativatieneunvalordereferenciaigualalvalor observado(sinoexisteningúnvalordereferenciaidéntico,seinterpolaráentrelosinmediatossuperiore inferior). Constituyeunaformamásinformativaylibredesuposicionesacercadelaformadeladistribuciónde referencia. Por definición el Intervalo de referencia del 95 % estará delimitado por los percentiles 2,5 y 97,5. 12.2.5. Aproximación bayesiana Existenotraseriedetécnicasparamétricas–porlotanto,únicamenteutilizablescuandolasdistribuciones seangaussiana–basadasenelteoremadeBayes,quepermitenasociaracadavalorobservadola probabilidad de que se halle dentro o fuera del Intervalo de referencia. 12.2.6. Índice de atipismo Estemétodo,muypróximoalmétododelosfractilesycomosedijoanteriormente,bajolasuposiciónde quelapoblaciónseagaussiana,asociaacadavalorobservado 0 x uníndice 0 i querepresentala probabilidad de hallar un valor analíticoxque se halle más próximo a la mediaxque el valor observado 0 x . Por tratarse de una probabilidad, 0 ise hallará comprendido entre 0 y 1. Los valores observados más cercanos a la media tendrán índices de atipismo próximos a 0, y los más alejados tendrán índices próximos a 1. Llamando 2 dal cuadrado de la distancia relativa a la desviación típicasentre el valor observado 0 xy la mediax : 2 0 2 x x d s − | | = | \ . el índice de atipismo del valor observado 0 xviene dado por: 25 ( ) () ( ) ( ) 2 2 0 0 Pr o i x d x d x = ≤ Larelaciónantesaludidadelíndicedeatipismo ( ) 0 o i x conelfractil ( ) 0 fr x deundeterminadovalor observado 0 x–cuando se trata de distribuciones gaussianas– se puede expresar por: ( ) ( ) ( ) ( ) 0 0 0 0 0 0 0 2 1 para 1 2 en otros casos i x fr x x x i x fr x ¦ = × − > ¦ ´ = − × ¦ ¹ 13. Valores de referencia univariantes frente a multivariantes 13.1. Región de referencia multivariada Desdehacevariosaños,sehaprocuradoadaptarelmétododelosintervalosdereferenciaalcaso particulardelosperfilesbioquímicos,constituidosporpruebasbioquímicasqueformanunconjunto coherente desde el punto de vista biológico (por ejemplo pruebas de función tiroidea, perfil hepático, etc.). Estosperfilescontemplanespecíficamenteunórganoounafuncióndelorganismo.Entrelas determinacionesqueconstituyenunperfilseencuentrancorrelacionesycomplementariedadesque aumentansueficienciadiagnóstica.Parecelógicopues,queunperfilseainterpretadoglobalmente, teniendo en cuenta las interrelaciones entre sus distintos componentes. En este campo, es necesario tener en consideración la distribución multigaussiana, generalización de la distribución gaussiana clásica. Enteoría,sea { } 1 2 , , , p X X X = X … unperfilconstituidoporp determinacionesysuponiendoquelas distribucionesdeXenunapoblacióndereferenciadeindividuospresuntamentesanossea multigaussiana,devectormedioµydematrizdevarianzas–covarianzasΣ.Elvectormedioestá constituido por las medias de cada uno de las pruebas { } 1 2 , , , p X X X …por lo que { } 1 2 , , , p u u u = µ … Por otra parte, la matrizΣ es la generalización, al caso particular del perfil, de la varianza 2 σ . Se trata de una“tabla”cuadradaquecomprendeensudiagonallasvarianzasdecadaunadelaspruebas,esdecir, { } 2 2 2 1 2 , , , p σ σ σ … , y por fuera de la diagonal, las covarianzas entre las determinaciones tomadas dos a dos { } cov , i j i j X X σ =parai j ≠ . En efecto, la covarianza i j σes i j i j i j r σ σ σ = donde i j r es la correlación entre las dos pruebas i Xy j X ; y i σ y j σ son las desviaciones típicas correspondientes. De modo que la covarianza mide las relaciones existentes entre las pruebas tomadas dos a dos. ElconocimientodeµyΣpermitecalcularladistanciadecualquierperfilobservado { } 1 2 , , , p X X X = X … , al centro de gravedadµ. Así, se puede escribir: ( ) ( ) ( ) ( )( ) 2 1 , i j i i j j ij D x x σ u u − = − − = − − ∑ X x µ Σ x µ donde 1 − Σ es la inversa de la matrizΣ. 26 Debe tenerse en cuenta que( ) 2 D Xes un número positivo, de valor tanto mayor a medida queX se aleja deL. Si= XL , entonces( ) ( ) 2 2 0 D D = = X L . Es necesario desde el punto de vista gaussiano, incluir en la región de referencia el 95 % de los individuos cuya distancia( ) 2 D Xno exceda un valor crítico. Se demuestra que este valor crítico corresponde al fractil 0,95delaleyde 2 χ parap gradosdelibertadoEnotraspalabras,laregióndereferencia,queesde hecho una elipse, queda definida por: ( ) { } 2 2 , 0,95 : p RR D χ = ≤ X X Por ejemplo, para3 p = , el límite vale 7,82, para8 p =es igual a 15,51. Un perfil biológicoX se interpreta entonces de la siguiente manera: siX cae en el interior deRR, es decir, si su distancia( ) 2 D Xaµ es inferioroiguala 2 , 0,95 p χ ,elperfilesconsideradocomo“normal”,encasocontrariosecalificade “patológico”. Es importante remarcar que si1 p =(una única prueba), 2 1, 0,95 3, 84 χ = , es decir( ) 2 1, 96 . Por otro lado: ( ) x D x u σ − = y ( ) { } { } : 1, 96 : 1, 96 1, 96 RR x D x x x u σ u σ = ≤ = − ≤ ≤ + es decir, el intervalo de referencia clásico. Así la región de referenciaRR es la generalización del intervalo de referencia. En la práctica, cuando se quiere determinar la región de referencia, es necesario estimarµ yΣ. Para ello se determina el perfil biológico { } 1 2 , , , p X X X = X …ennsujetos obtenidosalazarenlapoblaciónde referencia. Se obtienen asínperfiles { } , , , 1 2 n x x x … , siendo { } 1 2 , , , p x x x = x …el vector medio de las medias aritméticas de cada una de las pruebas yS la matriz de las varianzas–covarianzas de la muestra tal que: ( ) , 1 1 1 1 n n n i j i j ij i j n S nn = = = | || | − | | \ .\ . = − ∑ ∑ ∑ x x x x Esta fórmula es la misma que la dada para la varianza 2 spero generalizada al caso de un perfil. Conviene hacer una distinción sobre el tamaño muestraln , teniendo en cuenta, además, el número de pruebasp . Engeneralsedebetenerencuentaque10 n p ≥ .Asípara5pruebassonnecesariascomomínimo50 observacionesypara10pruebas100observaciones.Pordebajodeestosvaloressedebeactuarcon cautela. En la práctica la región de referencia se obtiene sustituyendoxyS por µ yΣ, y modificando la distancia crítica 2 , 0,95 p χde manera que se tenga en cuenta el tamaño de la muestra. Se obtiene entonces: ( ) ( ) { } 1 : - - RR K − = ≤ Xx x S x x donde ( ) ( ) 2 , , 0,95 1 p n p p n K F n n p − − = − ; y 27 , , 0,95 p n p F − eselfractil0,95deladistribuciónF deSnedecorconp yn p − gradosde libertad. Atítulodeejemplosupóngaseque3 p = y100 n= ,elvalorK es 3 9999 2, 70 8, 34 100 97 × × = × enlugarde 2 3, 0,95 7, 82 χ = . Para comprobar si un perfil es patológico es suficiente calcular su distancia respecto axy ver si esta es superior o igual a 8,34. Albert (1981) determinó la región de referencia de un perfil bioquímico constituidopormagnitudesséricas,urea(mmol/L),urato(µmol/L)ycreatinina(µmol/L),en284individuos presuntamentesanos.Enestecaso7, 99 K = espróximoalvalorteórico7,82.Enesteejemploelperfil (5,4,298,78)puedeserconsideradocomo“normal”yaque( ) 2 0, 58 D = x .Porelcontrario,elperfil(6,6, 387, 62) es claramente “patológico” ya que( ) 2 14, 53 7, 99 D = > x Aremarcar:(a)lahipótesisdemultigaussianidadesesencial.Esnecesarioquecadaconstituyente bioquímicodelperfilsigaunadistribucióngaussiana,denoserasíesnecesarioutilizaralguna transformacióncomohasidoindicadoanteriormente.Enlapráctica,calculandoparacadaperfildela muestraelvalorde( ) 2 D x yrepresentandosobreunpapelprobabilísticolosvaloresde( ) 2 D x o ( ) 2 3 D x ,sepuedeconocerlagaussianidadonodeladistribución.Asíenelcasomultigaussiano,los puntos se reparten más o menos alrededor de una recta. (b) El mismo método permite también juzgar la presencia de perfiles aberrantes (o extremos) que afectarían de forma importante al cálculo dexy deS. Estos perfiles deben ser eliminados o corregidos. 13.2. Paradojas de la interpretación multivariada La interpretación de un perfil bioquímico por el método de la región de referenciaRR, o por el que consiste encompararcadaresultadodeunadeterminaciónseparadamenterespectoasuintervalodereferencia (obteniéndose así una «caja» multivariadaRR′conduce a veces a situaciones paradójicas. Ello es debido al hecho de que en el segundo caso, la probabilidad de que todos los resultados del perfil se encuentren en elinteriordesuintervalodereferenciarespectivo,esdecir( ) 0, 95 p ,disminuyeconelvalordep . Expresado de otra forma, a medida que aumenta el número de determinaciones, aumenta la probabilidad de obtener algún resultado patológico. Así, para10 p = ,( ) 10 0, 95 0, 60 = . Es decir hay una probabilidad de 4 sobre10deobtenerunresultadoanormalenalgunadelas10determinaciones.Estasituaciónempeora cuando existen correlaciones importantes entre las distintas determinaciones. Estos resultados se confirman en la práctica. (a) Paradoja de tipo 1 La paradoja de tipo 1 es la más frecuente. Seproducecuandoelperfiles«normal»enlainterpretacióna nivel multivariado ( ) 2 D K ≤ , pero uno o más resultados del perfil son «patológicos», es decir se encuentran fueradesuintervalodereferencia.Lasdesviacionesunivariadasnoestánexentasdeinterésclínicoy puedenquedarenmascaradasporunainterpretacióndelosresultadosestrictamentemultivariada.Porlo tanto, es aconsejable utilizar las dos aproximaciones con buen sentido. (b) Paradoja de tipo 2' Este tipo de paradoja, más rara (inferior al aproximadamente 1 %), ocurre cuando el resultado de cada una delasdeterminacionesdelperfilsonnormales,peroelperfiles“patológico”desdeelpuntodevista multivariado. Así el perfil descritoanteriormente(urea=6,6mmol/L,urato=387µmol/L,ycreatinina =62 µmol/L) es “muy patológico” aunque cada resultado individual sea perfectamente normal. Esto se explica por el hecho que la concentración de creatinina es mucho más baja respecto a la de urea y la de urato en este paciente, ya que estas tres magnitudes se correlacionan de forma positiva. Debidoalapresenciadelasparadojasdeunoyotrotipo,serecomiendaunirunainterpretación multivariadaconlaunivariada.Laeficienciadiagnósticaaumenta.Laaproximaciónmultivariadaesmenos susceptible a los cambios individuales de las determinaciones de un perfil, pero permite poner en evidencia laexistenciadeperfilesanormalesquedeotraformahubieranpasadodesapercibidosalbioquímicooal médico. 28 14. Transferibilidad de valores de referencia 14.1. Introducción Muchoslaboratoriosclínicosobtienensusvaloresdereferenciadeacuerdoconlasrecomendaciones elaboradasporlassociedadesnacionalesyporlaIFCC,queinstanacadalaboratorioacumplirconsu responsabilidaddeofrecerunosvaloresdereferenciaapropiadosqueconstituyanelprimereslabónenla interpretacióndelosresultadosproducidosporestelaboratorio.Enalgunasocasioneslaproducciónde valoresdereferencianoresultafáciloinclusopuedenoserposible.Puedesucederqueelnúmerode individuos de referencia disponible sea escaso. Esto ocurre en algunos centros hospitalarios cuya actividad asistencialserealizaenpacientespreviamenteseleccionadosydondeelindividuopresuntamentesano acudemuyraramente.Enotroscasos,elvolumendetrabajodellaboratorioespequeño,yaunqueel número de individuos sanos que pueda acudir a este laboratorio para que se le realicen exploraciones sea proporcionalmente mayor, el tiempo necesario para reunir una muestra de referencia sería demasiado largo. Entalescasosserecurreabuscarunamuestradereferenciaconstituidaporpersonaldelaboratorio, muestra que a menudo es sesgada y que adolece de representatividad por tratarse de un muestreo dirigido. Porúltimo,elcostedelasdeterminacionesdestinadasaobtenervaloresdereferenciapuedeser demasiadoonerosoparaundeterminadolaboratorio.Encualquiercaso,puedeparecerexcesivoquese dupliquen trabajos de producción de valores de referencia en varios laboratorios o centros que sirvan a una misma comunidad y muchas veces geográficamente muy próximos. Portodoello,laadopcióndevaloresdereferenciaproducidosporotrolaboratorio–oporelmismo laboratorio,peroconotrométodoanalítico–constituyeunasoluciónparaaquelloscasosenquenosea posible atender a la recomendación de producir valores de referencia en el mismo laboratorio. No obstante, para que la adopción de valores de referencia sea correcta debe verificarse previamente la transferibilidad de los mismos. Por transferibilidad se entenderá la propiedad de poder ser asumidos como propios los datos obtenidosporunlaboratoriodiferente(oenelmismolaboratorio,porunmétododiferente)alquelosha producido. La transferencia de valores de referencia puede hacerse dentro del propio laboratorio cuando, por ejemplo, sesustituyeunmétodoanalíticoouninstrumentoporotro,ylarepeticióndelaproduccióndevaloresde referencia se considera lenta, cara o simplemente poco práctica. En otras ocasiones se implanta una nueva determinaciónanalíticaenunlaboratorio,dentrodeláreadeinfluenciadeotrocentrodondeyasehan producido valores de referencia, siendo razonable entonces adoptar los del otro centro. Finalmente, cuando ninguna de las circunstancias mencionadas es posible, debe recurrirse a la literatura científica o comercial disponible. Encualquiercaso,ellaboratorioqueadoptalosvaloresdereferenciaanteriormenteproducidoseneste mismolaboratorio,producidosenotrolaboratorio,descritosenlaliteraturaocontenidosenelfolletoque acompañaalosequiposdereactivos,tienelaobligacióndecomprobarquetalesvaloresseajustanala población que atiende este laboratorio y que la comparación que efectuará el médico clínico cuando reciba el informe analítico será hecha con valores de referencia apropiados. El sistema que se recomienda consiste en: (a)La producción en el mismo laboratorio de una serie de valores de referencia dentro de los límites de lo posible por lo que se refiere a número y representatividad; (b)El estudio detallado de las características técnicas de los métodos analíticos utilizados; (c)El estudio de los constituyentes bioquímicos desde el punto de vista fisiopatológico, de las variaciones intra e interindividuales; (d)Laconsideracióndelascaracterísticasepidemiológicasoderepresentatividaddelamuestrade referencia, que constituye la base de la comparación. Una vez se dispone de esta información, puede procederse a adoptar, recalcular o rechazar los valores de referencia de otro origen según las técnicas estadísticas apropiadas. 14.2. Cálculo del intervalo de referencia El intervalo de referencia puede calcularse de forma paramétrica o de forma no paramétrica según criterios expuestosanteriormente.Eltipodeintervalomarcaráclaramentelaestrategiaaseguircuandosevayaa transferir o a adoptar intervalos de referencia. 29 14.3. Procedimiento general El procedimiento recomendado aquí se inicia con la producción de una serie corta de valores de referencia en el laboratorio que desea adoptarlos. Estos valores se obtienen con todas las limitaciones ya citadas que impedían al laboratorio producir sus propios intervalos de referencia según las recomendaciones habituales. Apesardetodo,laseleccióndeindividuosdeberáhacersedelaformamásprecisayrepresentativa posible.Encasodedisponerdeinformacióncontrastadaacercadefactoresdevariaciónquesugieranla necesidaddeintroducirparticionesenlapoblación(porejemplo,laedad),todaslasanteriores consideracionessobrelatransferibilidaddevaloresdereferenciapuedenhacerseextensivasa subpoblacionesdereferenciaoriginadascomoconsecuenciadetalesparticipaciones.Seintroduce entonces el problema de seleccionar además un grupo o segmento de la población de referencia. En tales casosserecomiendaseleccionarungrupohomogéneodeindividuosporejemplo,enelestadode referencia).Apartirdeestemomentolaestrategiaaseguirvienecondicionadaporlainformación disponible. (a) Si se dispone de la serie completa de valores de referencia que ha dado origen al intervalo de referencia candidato a ser adoptado, puede procederse a una comparación de los estadísticos que caracterizan a las dosmuestras.Lacomparaciónpuedeserparamétrica(comparacióndemediasyvarianzas)ono paramétricas(mediantelapruebadeKolmogorovparalacomparacióndedosgruposdedatos).La hipótesis a demostrar es que ambas muestras proceden de la misma población. (b)Cuandosolamentesedisponedelintervalodereferenciacandidatoaseradoptado,desconociendola eventual equivalencia analítica o biológica, no es excesivamente recomendable proceder a la transferencia de estos intervalos. (c)Cuandoelintervalodereferenciaaadoptarseaunintervalocalculadodeformaparamétricayse conozcanlasequivalenciasanalíticasybiológicasseseguiráelesquemadescritoenelapartado15, Comparación y transferencia de intervalos de referencia calculados de forma paramétrica. 15. Comparación de intervalos de referencia calculados de forma paramétrica Latransferenciadeintervalosdereferenciacalculadosdeformaparamétricaseráposiblesiemprequeel intervalo candidato a ser transferido y el intervalo producido sean equivalentes, es decir, se demuestre que proceden de la misma población de referencia. 15.1. Parámetros de centralización: comparación de medias La comparación estadística de dos medias 1 xy 2 xestimadas a partir de dos muestras compuestas de 1 n y 2 n observaciones,seharámediantelapruebat deStudent.Lapruebanoparamétricaequivalente,la prueba Ude Mann–Whitney, implica el conocimiento de toda la serie de valores de referencia candidatos a sertransferidos.Porestarazón,casodenosatisfacerlosrequisitosdelapruebat ,lacomparaciónde intervalos de referencia deberá hacerse por el procedimiento general no paramétrico descrito en el apartado 16. (a)Hipótesis:setratadeverificarsilamediau delaotrapoblación,convarianza 2 σ común,pero desconocida: 0 1 2 1 1 2 : : H H u u u u = ¦ ¦ ´ ≠ ¦ ¹ (b)Realización de la prueba: se calculará el estadísticotde Student: 1 2 1 2 1 1 x x t s n n − = + donde: 1 x es la media de la muestra de referencia producida provisionalmente con 1 nindividuos; 2 x eslamediadelamuestradereferenciacandidataasertransferida,obtenidacon 2 n individuos 30 s es la estimación de la desviación típica de la población calculada utilizando las respectivas desviaciones típicas de las dos poblaciones: 1 sy 2 s : ( ) ( ) 2 2 1 1 2 2 2 1 2 1 1 2 n s n s s n n − + − = + − (c)Conclusión: Se rechaza la hipótesis nula, aceptando que ambas medias son diferentes cuando: 2 1 t t α − > donde 2 1 t α − eselvalorenlatablaencontradoenlatabladelat deStudent,paraunriesgoα con 1 2 2 n n + −grados de libertad. (d) Limitaciones: esta prueba es utilizada correctamente cuando: •ambas muestras han sido seleccionadas independiente y aleatoriamente; •ambas muestras han sido obtenidas de una población que aproximadamente se distribuye según la ley de Gauss o por lo menos simétricamente si es numerosa ( 30 n> individuos); •cuandosiendo 1 2 n n ≠ sehaverificadolaigualdaddevarianzas(segúnseindicaenelapartado 15.2.). Cuando las varianzas son desiguales se procederá según se indica en el apartado 15.1.6. (d)Númerodecasosnecesarios:elnúmerodecasosestárelacionadoconlapotenciadelaprueba estadística, es decir, la resistencia a caer en el llamado errorβo declarar falsamente que dos medias son igualescuandonoloson.Cuandomayorsealadiferenciarelativaquesepretendaponerdemanifiesto, menor será la cantidad de individuos necesaria. Siendon′el número de individuos necesario a tomar: 2 2 1 2 t CV n d α − ′ = donde: 2 1 t α − es el valor de la distribuciónt ; CV es el coeficiente de variación; d eselerrorrelativomáximo,expresadoenporcentajedelamedia,conunaconfianzade 1 α − . Cuandon essuficientementegrande( ) 30 n> ,entonces: 2 1 t α − puedeserreemplazadoporsu correspondientevalorenladistribucióngaussiana:para0, 05 α = ,entonces2 t ≅ ylafórmulaqueda simplificada: 2 2 4 CV n d ′ = (e) Cuando las varianzas 2 1 σy 2 2 σno son iguales se distinguen dos situaciones: •Cuando el número de casos es pequeño ( ) 1 2 , 30 n n>se calculará la misma cantidad, observada ty se comparará con la 2 1 t α − tabulada para un número de grados de libertad ν : 2 2 2 1 2 2 1 2 2 2 2 1 2 2 1 2 1 1 1 s s n n s s n n n n ν | | + | \ . = | | | | || \ . \ . + − − 31 •Cuandoelnúmerodecasosesmayor ( ) 1 2 , 80 n n> )entonces( ) 0,1 t z N = ,pudiéndosecalcularla siguiente expresión det : 1 2 2 2 1 2 1 2 observada x x t s s n n − = + donde: 2 1 sy 2 2 s son, respectivamente, las estimaciones de las varianzas de las poblaciones. Se rechazará la hipótesis de igualdad de medias cuando observada tsea superior a la tabulada t . 15.2. Parámetros de dispersión: comparación de dos varianzas La comparación de la dispersión de dos intervalos de referencia se hará mediante la pruebaF : (a)Hipótesis: las varianzas de dos distribuciones son iguales: 2 2 0 1 2 2 2 1 1 2 : : H H σ σ σ σ ¦ = ¦ ´ ≠ ¦ ¹ (b)Cálculos: se calculará el estadísticoFde la siguiente forma: 2 2 máxima observada mínima s F s = (c)Interpretación: se rechazará la hipótesis de que ambas varianzas son iguales cuando: 1 2 , , observada F F α ν ν ≥ donde: ν1 eselnúmerodeobservacionesmenosunacorrespondientealamuestraquepresenta una varianza máxima; ν2 eselnúmerodeobservacionesmenosunacorrespondientealamuestraquepresenta una varianza mínima. (d) Limitaciones: la pruebaFes sensible a la no-gaussianidad de las poblaciones. (e)Númerodedatos:ladeterminacióndelnúmerodedatosnecesarioparaobtenerunadeterminada potencia estadística, o lo que es lo mismo, el determinar la potencia, dado el número de observaciones con quesecuentanoessencillodeestablecer.Atítuloorientativo,paraunniveldesignificaciónhabitual ( ) 0, 05 α = yunapotenciaequivalenteaunerror0,10 β = parapoderdetectarcomoestadísticamente significativas diferencias del 100% se requiere un número aproximadode90individuos.Siladiferenciaa detectar se desea que sea del 50 % las observaciones necesarias se acercan a 250. 15.3. Conclusiones Cuando las comparaciones de los parámetros que definen la centralización y la dispersión de la muestra de referencia,candidataasertransferidaconlaseriedevaloresobtenidosenellaboratorioquedesea adoptarlos,dancomoresultadoqueambasmuestrasprocedendelamismapoblación,podránadaptarse los valores de referencia y es razonable admitir los intervalos correspondientes a subpoblaciones originadas a partir de particiones según criterios de variación biológica. Cuandounodelosparámetrosestudiadosnoseaigualpodrásustituirseenelvalordelintervalode referencia: 1, 96 x s ± Cuando ambos parámetros son diferentes, se rechazará la transferencia. Esquemáticamente: varianzas 32 iguales diferentes iguales aceptar 1, 96 x s′ ± medias diferentes 1, 96 x s ′ ± rechazar donde:x′ corresponde a los estadísticos candidatos a ser transferidos; y x corresponde a los estadísticos calculados en el laboratorio y que desea adoptar. 16. Comparación de Intervalos no parámetricos La transferencia de intervalos de referencia expresados de forma no paramétrica podrá hacerse cuando los fractiles que limitan este intervalo sean iguales. 16.1. Prueba de comparación de fractiles La prueba de comparación de fractiles está basada en la distribución binomial. (a)Hipótesis: si el fractil* pde una muestra aleatoriaXes* x ( ) ( ) 0 1 : Pr * * : Pr * * H X x p H X x p ≤ ≥ ¦ ¦ ´ < ≤ ¦ ¹ (b) Cálculos: se utilizarán dos estadísticos: 1 T= número de observaciones menores o iguales a* x ; 2 T= número de observaciones menores a* x . de modo que cuando no existan observaciones iguales al valor propuesto de* xentonces, 1 2 T T = . Laregióncríticaderechazodelahipótesis,deuntamañoaproximadoalvalorα deseado,seobtiene entrando en la tabla el númeronde observaciones en la muestra de referencia provisional y valorpdel fractil apropiado (se presentan tablas para fractiles0, 95, 0, 05, 0, 90, 0,10 p = ). En la tabla se buscará un valor 1 Y queseaaproximadamentelamitaddelvalorα deseado(porejemplo,para0, 05 α = deberá localizarseunnúmero 1 t correspondienteaunvalor 1 Y cercanoa0,025)yunsegundonúmero 2 t correspondienteaunvalor 2 Y talque 2 1 Y − seaaproximadamentelaotramitaddelaregióncrítica deseada(esdecir,paraunaregión0, 05 α = entonces 2 1 0, 025 Y − = ).Elgradodesignificacióndela prueba será ( ) 1 2 1 Y Y α = + − . (c) Interpretación: la hipótesis nula de igualdad de fractiles se rechaza, con un nivel de significación igual a ( ) 1 2 1 Y Y + −cuando 1 1 T t ≤o bien cuando 2 2 T t > . 16.2. Conclusiones Cuando los fractiles que limitan el intervalo de referencia candidato a ser transferido pertenecen a la misma poblaciónqueloslímitesdereferenciadelamuestraproducidaenellaboratorioquedeseaadoptarlos, podrán ser transferidos en los mismos términos expresados en el apartado 3.3. Cuando no sea posible admitir tal igualdad, pero, no obstante, se tenga la evidencia de que ambos métodos son analíticamente equivalentes, de modo que se conozca una ecuación de regresión que permita convertir resultados de un método a otro, pueden transformarse las observaciones y proceder a recalcular los límites dereferenciayrecomprobarsuadecuación.Encasodequesecomprobaradichaigualdad,podría procederse a la transferencia de los valores candidatos aplicándoles la función inversa. 33 17. Bibliografía citada 1. SolbergHE.Approvedrecommendation(1988)onthetheoryofreferencevalues.Part5:Statistical treatmentofcollectedreferencevalues:determinationofreferencelimits.JClinChemClinBiochem 1987;25:645-56. 2. Solberg HE. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), Scientific Committee, Clinical Section, ExpertPanelonTheoryofReferenceValues,andInternationalCommitteeforStandardizationin Haematology (ICSH), Standing Committee on Reference Values. 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