Universidade Federal de Santa Catarina Cinética Enzimática Estágio de Docência Juliana Ribeiro Mariotto.

Slide 1 Universidade Federal de Santa Catarina Cinética Enzimática Estágio de Docência Juliana Ribeiro Mariotto Slide 2 Objetivos Medir velocidade das transformações; Estudar a influência das condições de trabalho; Correlacionar: velocidades fatores; Otimização do processo; Critérios para o controle; Projetar o reator mais adequado. Slide 3 Influência do Substrato Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação; Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P; Velocidade inicial (V 0 ): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante. Slide 4 Influência do Substrato [E] = cte [S] = V 0 linear [S] = V 0 V 0 = V máx Slide 5 Influência do Substrato Alguns casos a V 0 não pode ser medida Não existe técnica experimental; Equação química não representa a transformação; Velocidade da reação: Velocidade média de consumo ou produção; Variação de uma propriedade no sistema. Slide 6 Influência do Substrato Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório; Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) E combina-se reversivelmente com S ES k 1 E + S ES k -1 ES se rompe E e P k 2 ES E + P Slide 7 Influência do Substrato Qualquer instante da reação: E e ES; [S] = velocidade da reação [S]; V máx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima saturada; [S]: estado pré-estacionário ES; Estado estacionário [ES] = cte; V 0 estado estacionário. Slide 8 Equação Michaelis-Menten Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; Hipótese: limitante quebra de ES E + P. Slide 9 Equação Michaelis-Menten Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; Relação quantitativa entre a V 0, a V máx e a [S] inicial relacionadas através de K m. Slide 10 Equação Michaelis-Menten Relação numérica: V 0 é metade de V máx ; k m = afinidade pelo substrato; K m afinidade K m afinidade V máx é proporcional à [E]. Slide 11 Significado de K m e V máx Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos; Significado e magnitude de V máx e K m varia; K m : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação. Slide 12 Significado de K m e V máx K 2 > K -1 ; K 2 e K -1 são comparáveis a K m função complexa; V máx : número de passos da reação e identidade dos passos limitantes. Slide 13 Significado de K m e V máx Enzima na saturação: EP e V máx = k 3.[Et]; K cat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas; K cat e K m = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação. E + S ES EP E + P K 1 K 2 K 3 K -1 K -2 Slide 14 Reação de 1ª Ordem [S] Reação de Ordem Zero [S] >> K m Slide 18 Parâmetros Cinéticos Lineweaver-Burk Slide 19 Parâmetros Cinéticos Método de Hanes Slide 20 Parâmetros Cinéticos Método de Eadie-Scatchard Slide 21 Parâmetros Cinéticos Forma integrada Slide 22 Parâmetros Cinéticos Exemplo: [S] (g/L) V o (g/L.h) 0,25 0,78 0,51 1,25 1,03 1,66 2,52 2,19 4,33 2,35 7,25 2,57 Slide 23 Parâmetros Cinéticos Exemplo: Lineweaver-Burk Slide 24 Parâmetros Cinéticos Exemplo: Método de Hanes Slide 25 Inibidores Competitivos Forma estrutural = substrato competição; Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima. Slide 26 Inibidores Competitivos [S] V máx = K m Experimento 1º [E], [S] = cte 2º [E], [I] = cte 1/V 0 x 1/[S] Slide 27 Inibidores Competitivos Equação de Michaelis e Menten Lineweaver-Burk Slide 28 Inibidores Competitivos Relação entre as velocidades com e sem inibidor [S] = influência do [I] desprezível. Slide 29 Inibidores Não-Competitivos Ocupa outro sítio ES, EI e EIS; [S] = não leva todas as E produtiva; V máx e K m normal. Slide 30 Inibidores Não-Competitivos Equação da velocidade: Lineweaver-Burk Slide 31 Inibidores Incompetitivos Bloqueio de ES; 2 sítios ativos I se fixa no complexo ES; ESI = não forma P; V máx e K m Slide 32 Inibidores Incompetitivos Equação da velocidade: Lineweaver-Burk: Slide 33 Inibidores Incompetitivos Slide 34 Inibidores Irreversíveis Combinam-se com um grupo funcional destruição; União covalente inibidor e enzima. V máx e K m = Slide 35 Inibidores Irreversíveis Equação de Michaelis e Menten: Slide 36 Inibidores Irreversíveis Lineweaver-Burk: Slide 37 Influência do pH Valor de pH ótimo = atividade máxima; Velocidade da reação: pH afasta do ótimo; Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis; Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H +. Slide 38 Influência do pH HA A + H + pH HA A Aminoácidos: pH -COO - captam prótons = -COOH; pH -NH 3 + são dissociados = NH 2 ; Ligação eletrostática = -COO - -- NH 3 +. Slide 39 Influência do pH pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis estrutura primária; Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis; Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros. Slide 40 Influência do pH pH 5 e 8 = não afeta a atividade; Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; 5 > pH > 8 = inativação irreversível. Slide 41 Influência da Temperatura T velocidade de reação = energia cinética; T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação pouco acima da T ótima. Slide 42 Influência da Temperatura Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; Substratos protegem a enzima da desnaturação. Slide 43 Influência da Temperatura K é função da T Lei de Arrhenius Slide 44 Influência da Temperatura Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura Velocidade quando a T 10ºC. Slide 45 Regulação da Atividade Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente; Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência; Atividade catalítica ou sinais; Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores. Slide 46 Enzimas Alostéricas Ligação não-covalente e reversível modulador; Inibição por retroalimentação Enzima reguladora inibida pelo P final da via reequilibra as necessidades celulares; Moduladores: inibidores ou estimuladores. Slide 47 Enzimas Alostéricas Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas; Sítio alostérico específico para o modulador; Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas. Slide 48 Enzimas Alostéricas curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos. Slide 49 Modificação Covalente Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura; Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas.