FACULTAD DE QUÍMICA. UNTVERSIDA& DE LA HABANA. úca en análogos de iva de secuencias Tutor: Dra, Chrislaine Rodríguez Tanty. cNtc/2002. A la memoria de mis bisabuelos maternos, a mis padres y a mi hermana, Agr¿decimientos. Quiero agmdecer ante todo, de manera muy especial a mi mamá, que desde un comienzo supo guia¡me para que no perdiera el rumbo que me trajo hasta aquí y como ella dice, me dió los genes que me abrieron el camino de las ciencias. A mi papá, qüe siempre me brindó su apoyo incondicional, hasta en los momentos más dificiles y ha sido un ejemplo en todos los sentidos. A mi heÍnanita, que me ha sopo¡tado desde sus primems días y ha hecho menos abtmido mi papel de hijo. Quiero agradecer a mi tutora Chrislaine, así me pidió que la llamara desde el para conmigo! que reco¡lozco no fue poca y fue una gran amiga p¿¡Ia mí. p mer día, cuando cas¡ no nos conocíamos y tuvo siempre confianza en este t¡abajo. euiero agradecerle su paciencia Agradezco a Judith, Rafaela, Dannelis, Marquiza, Gabriel y a todas aquellas personas del Centro de Neüociencias de Cuba, que colabora¡ de una forma u otra en la realización de este trabajo e hicieron más agradable mi estancia en ese centro. como siempre, se queda alguien, quien sea, sepa qu€ aunque soro me diera una frase de ariento, se Io agradezco infinitamente. l. L- Materiales. ........ .....................2 1 3.l.l .- Disolventes y reactivos empleados. .... ............................21 3.2.- Purificación de los productos obtenidos. ................................ .........................................22 3.3.-Caracterizaciónde1osproductosobtenidos....................................................................22 3.4.- Síntesis de los reactivos de partida. .. .............................................23 ...........................23 3.4.1.- Síntesis de la ¡y'-Hidroxisuccinim ida. 3.4.2.- Síntesis del éster de ¡y'-hidroxisuccinimida del ácidop-bromobenzoico. ..........24 3.4.3.- Sintesis del ácido 6-p-bromobenzaminocaproico. ................ ..............................24 3.4.4.- Obtención del éster de 1y'-hidroxisuccinimida del ácido 6-p- bromobenzaminocaproico,,,...,,.,,,,........,,..... ...............25 3.4.5.- Síntesis delácido 3-p-bromobenzaminopropanoico. ........................................25 3.4.6.-Obtención del éster de 1y'-hidroxisuccinimida del ácido 3-p-bromo-benzalnino- propionico.................. .............................26 .--...26 3.4.7.- Síntesis del ácido /r'-[6-(p-bromobenzamino)caproil]-3-aminopropanoico. 3.4.8.- Obtención del éster de ¡y'-hidroxist¡ccinimida del ácido N-[6-(P- bromobenzamino)caproill-3-aminopropionico........................--....... ...... ...27 3.5.- Síntesis de los derivados de la 3.5. | .- Síntesis de la timidina ................ ............ . ...28 3'-.5'-di-O-aceril-2'-O-desoxitimidina. .......................................28 3.5.2.- Síntesis de la 3'-,5'-di-0-acetil-5-bromometil-2'-O-desoxiuridina... ..... ....28 3.5.3.- Síntesis de la 3'-, 5'-di-O-acetil-5-azidometil-2'-O-desoxiuridina. ............. ..30 3.5.4.- Obtenc¡ón de la 5-azidometil-2'-O-desoxiuridina. ............... ...... .... ...... ..30 3.5.5.- Síntesis de la 5-aminometil-2'-O-desoxiuridina. ..-............... 3.5.6.- Acilación de . ... ... .. ... ..31 General. ... 32 ...........32 la 5-aminometil-2'-O-desoxiuridina. Procedimiento 3.5.6.1.- 5-[ ¡r'-(p-bromobenzamino)aminometil]-2'-O-desoxiuridina. 3.5.6.2.- 5-I ir'-[propanoil-3-(p-bromobenzamino)]aminometil] -2'-O-desoxi ....................33 uridina....................... 3.5.6.3.3.6.- Transaminación de 5-{{ ADN N-{propanoil -3- lcaproilamino-6-(p-bromo-benzamino)]] aminometil) l-2'-O-desoxiuridina. ............... ...... ............ ..... .34 det¡mo. ........ ..........................34 3.7.- Acilación del ADN t¡ansaminado con difercntes ésteres de N-hidroxisuccinimida de derivados del acido p-b¡omobenzoilo. Proced¡miento general. .....................................35 3.8.- Fijación del ADN de timo a una membrana de nitrocelulosa. ........................................35 3.9.- Detección coloriúétrico inmunoenzimático de la marca (Dof Blof). .............................36 4.- Resultados y discusión. .....,,..,............,... ...............,.............................37 4.1.- Síntesis de los diferentes ésteres de ¡y'-hidroxisuccinimida de los derivados del ácido p- bromobenzoico......... 4.2.- Síntesis de los derivados de la Timidina ...... 6.- Recomendaciones 7.- Referencias Bibliográficas. ..........,......... 5.- Conclusiones. ........-........ .....................42 ......................................42 4.3.- Transaminación y Acilación de ADN de timo. ................................................................4'1 --...-,.---.....----...---...................,.50 ...............................................51 ..................,........................,52 ' 1.- Introducción. Desde finales del siglo pasado el empleo de m¿¡rcadores no radioactivos para la detección de secuencias de ADN ha tenido un gran auge. Se han empleado como marcas de este tipo compuestos fluorescentes o láse¡ y compuestos químicos. Estos últimos se pueden identificar a través del empleo de anticuerpos mono- y poli-clónales obtenidos contra los mismos. derignándose estos como marcadores inmunoquímicos. Las venlajas de la detección no radioactiva con respecto a las técnicas de detección r¿d¡oactiva son que las marcas utilizadas, por lo general, son estables durante un tiempo prolo¡gado, la 1 manipulación de los,nucleósidos, nupleótidos u oligonucleótidos marcados no resulta dañina para la salud. y la obtenc¡ón ) detección de las marca'. fundamenlalmenle las inmunoqurmicas. !resultan En el laboratorio de Síntesis del Centro de Neurociencias se ha empleado el radical pbromobenzoilo como marca inmunoquímica y se ha obtenido un anticuerpo monoclonal de alta mucho menos caras que las radiactivas. afinidad (Kd = 1,53 lo'e M). Esta marca ha sido inÍoducicla en posición 4 de Ia base pirimidínica de la timidina, a través de diferentes brazos espaciadores, y sc ha comprobado que la afinidad del antiouerpo monoclonal por el radical p-bromobenzo¡lo varía en dependencia de la estructura 1 largo del brazo espaciadár. Los objetivos fundamentales del presente trabajo fucron: ! la síntesis de dit'erentes ésteres de N-hidroxisucc¡nimida de derivados del ácido pbromoben¡oico. para scr emplbados como agentes atil¡ntes de grupos aminos pr¡marios. > l la introducción del radical ¿-bromobenzoilo en el grupo metilo de la posición 5 de la basc pirimidínica de la moléculá:de timidina a través de cadenas amidoalquí¡¡cas de Ll¡ lerenrcs long¡ludes. ) la introducción del radical p-bromobenzoilo en posición 4 de la base pirimidínica de la molécula de citidina en u¡a moléiula de ADN, a rravés cle caclenas amidoalquílicas de diferentcs longitudes. F La detección colorimétrica inmunoenzimática del radical p-bromobenzoilo cn molécula de áeirlo deso\iriboilucleico. una Revisión Bibliográfica 2.- REVISIóN BIBLIOGRÁFICA Marcaje no radiactivo de nucleósidos. A partir de la década del 80 se han desarrollado las técnicas de detección no ndiaclivas como una alternat¡va en la detección de secuencias de ADN. Para ollo se han empleado marcadores no radifctivos los cuales deben curnplir una serie de requisiros. eslos son: l.- una vez introducida la marca dentro de una secuencia de oligonucleótido debe ser detectada con alta sensibilidad. 2.- en las condiciones de hibridación (temperatura, fuerza iónica, pH) la marca debe ser estable, 3.- la marca no debe afectar la c¡nética, ni la calidad del proceso de hibridación, 4.- la marca debe ser fácil de introduci¡, inene y no cara. El objetivo fundamental de nuestra revisión estií encaminado al estud¡o de los dil'erentes empleadas para la marcadores utilizados en el marcaje no radioactivo, así como, a las vías introducción de marcas en nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos. 2.1.- Tipos de marcas emple¿d¡s en la detección no radiactiva de secuencias de ADN Existen fundamentalmente dos tipos de marcas no radiactivas: l.- marcas láser. 2.- marcas inmunoquímicas. 2.1.1.-Marcas Láser: En los ensayos biológicos, bioquímicos y clínicos se han empleado diferentes compuestos fluorescentgs, como marcas liáser, para la detección no radiactiva de secuencias de ADN. Estos compuestos deben reunir una serie de características necesarias para ser empleados como marcas. estqs son: I a.- tener una alta intensidad de fluorescencia, la cual depende de la relación de absorción / excitación (€ > 104) y de la eficiencia cuiíntica del compuesto (e b.- la señal de emisión debc distinguirse del ruido, c-- no deben afectarse las propiedades de fluorescencia del compuesto por las condiciones en que se realice el ! l), experimento. Revísión B i b I ¡o ?rrifrca En la tabla 1 se muestran las propiedades de los compuestos fluorescentes más empleados. Tabla 1.- Propiedades de los compuestos fluorescentes más empleados r Der¡vados Fluoresceína: FITC. DTAF Derivados Rodaminai abvexc. (nJn) e (L/mol. cm) ), emis (nm) 0 492 550 550 530, 565 ,/ x t04 520 585 580 0,85 RBITC l'MRITC 104 5,0 x 104 l,2x 3,4 0,70 DANS ANS 340 194 550, 620 x 103 l0l 7.0 x 105 6,1 x 520 47t 475 580,660 480, 0,10 0,80 0,10 0,50 0.98 e, en";"n de isotiocianato de rcdami¡a; TMRITC: lsotiocianato an;linonaft alenosulfónico. trC Stet.metilrodaminai DANS: ctoruro de dansilor ANS: ácido Los compuestos láser más utilizados en el marcaje de oligonucleót¡dos son los de¡¡vados de fluoresceína y de rodamina, debido a su elevada eficiencia cuántica.l Recientementqo en la literatura, se ha descrito el empleo de nuevos derivados de fluoresceína y rodamina, ¡os cuales presenLan una alla intensidad de fluorescencia. 2.1.2.- Marcas InÍ¡unoquímic¿s: El marcaje inmunoquímico se basa fundamentalmente en la relación de afinidad que pueda existir entre el antígeno y su anticuerpo. La selección de un compuesto como marca inmunoquímica clebe garantizar una ¡espuesta señal_ ruido elevada para que pueda ser considerada como una marca eficiente.s La intensidad de esta señal depende de la actividad específica de la secuencia marcada, de la estabilidad de la misma y de la accesibilidad del sistema de detección a la marca en la doble y en la simple cadena cle ADN. El método dc marcaje inmunoquimjco de sondas de ADN presenta las siguientes caracteristicas: a.- las marcas utilizadas son moléculas estables. Revisión Biblio b.- el reconocim¡ento de la marca se realiza con una alta especificidad mediante el empleo de anticuerpos mono- y policlonales desanollados contra la marca, c.- se pueden emplear diferentes métodos de de¡ección mediante diversas reacciones, que pueden ser colorimétricas, fluorescentes o luminescentes. 2.1.2.1 Marcas inmunoqüímicas frecuenteúente emple¡das: 2.1.2.1.1.- Biotina: t La biotina (vitamina H¡5 fue la p.i-".a marca inmunoquímica utilizada de mane.a eficiente en la detección no radiactiva de secuencia de ácidos nucleicos, debido a su gran afinidad por la avidina (K¿ : l0-15 M). Esta alta afinidad y especificidad de la avidina por la biolina garantiza que se forme rápidamente el complejo y que sea estable La biotina puede introducirse en una secuencia de ADN tanto por via enzimática como por vía química.5 Para la introdLrcc¡ón de la biotina por via química se han desarrollado diferentes der¡vados de ella (fig. l), con el obietivo de convertir este compuesto en un reactivo de fácil utilización. Entre ellos se encuentra: la fotobiotinas (la), el éster de ¡/-hidroxisuccinimida de la biotinae ( lb), el éster de ly'-hidroxisuccinimida del ácido 6-biotinilaminocaproíco (lc), la hidrazida de la biotinu'u 1l,l;, lo. derivados oligonucleótidos en de fosforoamiditos de la biotina 1le, lf.¡rr empleados en la fosforilación de l'](lg) posición 51en fase sólida y el derivado de carbodiimida de la biotina R ,)¡coR HN(.H ,)3N(cH r(cH,,.,O"' o ., o \-( Jo, NHNH2 l..-rh" o (d) "n"n"o""r"i"".,r,"nr)3N=c=N_c2N5 (s) Figurá 1.- Diferentes derivados de la biotina (vitamina H) empleados paraelmarcaj€ noradiactivo, a:fotobiotina;b: éster de N-hidroxisuccininida de la biotina; c: és1er de ,v-hidrox;succinim ida del ácido 6-biotinilaminocaproíco; d: hidrazid¿ ¡le la biotina; e,f: derivados d€ fosforoam;ditos de la biotina y el derivado de carbod;imida de la biotina (a). Revisión Bibliogrófica Sin embargo el empleo de la biotina como marca, en el caso de que se utilice en experimentos de hibridaciones ¡n situ , es ineficiente/ puesto que se producen respuestas inespecíficas por la t lr'la presencia de ¡a biotina como componente natural de la célula. Además en este caso, la relación señal-ruido es baja por la interacción enhe la biotina y las proteínas existentes en la célula 2,1.2.1.2.- Ra dícal 2,4-Dinitrofen ilo : purínicas't y pi.i.idínicas'u ll 17 de nucleósidos, nucleót¡dos-' y en posición 5'- terminal de los oligonucleótidos - En este último El radical 2, 4-dinitrofénilo (DNP) ha sido introducido en las bases caso, para la inserción del radical DNP en posició¡ 5lterminal de una secuencia de ADN, se han utilizado derivados de fosforoamiditos, como agentes fosforilantes, que contienen uno o dos radicales DNP. En todos los casos se ha empleado para su inserción una cadena diaminoalquílica, que sirve de puente o b¡azo espaciador para separar ia marca del nucleósido o del oligonucleótido. Para su detección se han utilizado a¡ticuerpos monoclonales obtenidos contra ella. En el trabajo desarollado por Vincent y col. '5 la marca no se pudo detectar debido a que la misma interactúa con el resto de las bases de la doble cadena, posiblemente, a través de la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos de oxigeno de los grupos nitro y los átomos de hidrógeno de los grupos aminos de las bases, por lo que la marca queda ocluida dentro de la doble hélice de ADN y resulta ¡mposible su reconoc¡miento en la doble cadena. 2.1.2.1.3.- 5-Bromo-2'-O-desoxiuridina (5-BrdUrd): La s-Brdurd (fig. 2) ha sido utilizada en lee ensayos de marcaje no radiactivo, a través de introducción por vía enzimática tanto ¡r? su vivo como in riÍro, así fficomo por vía química mediante la síntesis de secue¡cias de ADN, marcadas en posición terminal del oligonucleótido.r3 74 Figüra 2.- 5'Bromo 2'-O-desoxiuridina (5-Brdurd). Rev i s ión Bibl io gráJica Para el reconocimiento de la s-Brdurd, se han empleado anticuerpos monoclonales de alta llevar a cabo la especiticidad.l8 Desatbftunadamente. nara realizar esta detección es convenie¡te la marca ocluida desnaturalización del ADN, debido a que el nivel de detección es bajo, al quedar 21 2l dentro de la doble cadena. 2,1.2.1.4.- Acetilamitrofl uoreno: F,l2-acetilaminofluoreno(AAF)osuderivacloT.yodado(AAIF)hansidoutilizadospor diferentes investigadores para el marcaje de ADN y ARN 5 La introducc¡ón del AAF en el ácido nucleico se ha ¡ealizado25 ir? yillo, comprobiindose que la entre un 5 y marca se introduce pÍincipalmente en la posición 8- de la guanina y que se obtiene un l0 % de bases modificadas en la secuencia marcada La detección en simple cadena y en doble cadena del AAF se ha realizado con el empleo de anticuerpos mono- y policlonales obtenidos contra lu tut"u,t'u 2? obteniéndose niveles de a 4 "C detección en el orden de los picogramos (pg). La sonda, una vez marcada es estable durante 2 años.5 El empleo de esta marca presenta el inconveniente de que el AAF es un 2R compuesto altamente cancerígeno,-" por lo que su utilización no es muy frecuente 2.1.2.1.5.- Digorigenina: A partir de 1989, Kessler y col."-" 29-:12 emplearon la digoxigenina (fig 3) como un matcador no radioactivoparaelmarcajedesecuenciasdeADN.Ladeteccióndelamarcaserealizamediante el empleo de anticuerpos monoclonales. La incorporación de esta marca al ADN puede ser realizada por vía enzimática, fotoquímica' o química. Los niveles de detección alcanzados eslin entre 0,5 y o 1 pg.ro H. Á Hooc(cH r OH ,,coo Figura 3.- Estructura de l¿digoxisen;na (l) empleada como ma.ca inmunoqüím¡. de ésteres de la ¡y'-hidroxisuccinimida de la digoxigenina que contienen brazos espaciadores 30 distintas longitudes. 2.2.- Nucleósidos empleaalos en el marcaje' Posición donde se introdüce la m¡rca: En los métodos de detccción no radioactivo de ADN se ha realizado l¿ inhoducción de la marca más en distintas posiciones de la molécula de los nucleótidos El marcaje se ha efectuado f.ecuentemente en nucleós¡dos con base pirimidínica ro 10 r1 ra que con butt putínita'lt 't'0't' son más debido a que los rendimientos resultan superiores, ya que los nucleósidos pirimidínicos estables en las condiciones de reacción empleadas. Posiciones para la introducción de la marca en los nucleótidos: a.- en el resto ribósico, en las posiciones 5'-, 3'-, o la posición ct- del grupo fosfato' b.-e¡laposición4ó5delabasepirimidínicayenlaposición7úSdelabasepurínica De ellos el marcaje en la base de los nucleótidos permite obtener secuencias de oligonucleótidos multimarcados internamente, sin que la marca interfiera en la polimerización del oligonuclcótido 2.2.1,- Introducción de la marca en la posición 4 de la base pirimidínica' Un valioso intermed¡ario para la inserción de marcas en la posición 4 de la base pirimidínica ha resultadoserla4-Ir'-alquil-2.-O-desoxicitidina'Enlaliteratulasedescribentresmétodos generales para su obtención, estos son: L- Transaminación catalítica con bisultito de sodio d€ la 2'-O-desoxi"itidinu Schulman 'o'" tt de y.ol." y po.t.rio,ment. Draperjt fueron pioneros en este mélodo Ld reaccinn transaminación catalítica de la citidina consiste (esquema 1), en la reacción de adición de bisulfito de sodio al 5. 6- doble enlace de la base pirimidínica del nucleósido, para obtener el aducto de bisulfito de citidina (4). Este aducto se transforma en el derivado 4-¡y'-alquilamino de la c¡tidina (é) por el ataque de la diamina seleccionada. En la reacción de transaminación tiene lugar como reacción colateral la desaminación de la citidina, por 1o que se obtiene la uridina(5) como subproducto. sodio Schulman y col.rr efectuaron la tmnsaminación catalítica de ta citidina con bisulfito de l' 8empleanclo diaminas de dilerentes longitudes (1,3 Auo - ^ H.N.[ o t : \"J o ro oh. p l,O l^ C-: o A. BNhS ,, .n,,,.o-- \-J e elc--"rlis BLCjr-NHS Br \r/-\ ^ ,-=Ä,r----- A-"--4,Ho(B) ,,),,) L--"\] L{ 'N- lr -l \o V{*-*n------\ \-/ v x-\s- -., v t '(-"-^'*Ä'" P '"-l-"-i- It \o Esquema 10.- Secuencia de reacciones empreada parala introducciön de la marca en el grupo metf lico en posiciön 5 de la moldcula de la tirnidina. P -5-bromometil-2'-O-desoxiuridina es un intermediario versätil para la obtenciön de diferentes anälogos de nucleösidos. Esto se debe a que el ätomo de bromo resulta ser fücilmente sustituible producto a que se encLrentra en una posiciön alilica. La 3" 5'-di-O-acetil Bärwolff y col.73 fueron los pioneros en la sfntesis de este intermediario media'te la reacciön radicälica de la 3', 5'-di-O-acelil 2'-O-desoxitimidina con bromo molecular en tetracloruro carbono. La reaccidn se llevö a cabo a reflujo y se inicializ6 irradiando con una lämpara de 500 oÄ. W. El rendimiento reportado fue de un 78 42 de -l Resultados v Discusiön Este rndtodo ha sido ampliamente utilizado por diferentes investigadores para la obtenci6n de diferentes derivados.7e' 80' 81 En 1998, Walker y.ol.7a emplearon como agente bromante la N-bromosuccinimida para la bromaciön de la S-etil 2'-O-desoxi-4'-tiouridina, en presencia de AIBN como iniciador de radicales. La reacciön se realizö a reflujo en cloroformo 84%. y el rendimiento obtenido fue de un Con el ob.ietivo de detern-rinar las condiciones optimas parala brornaciön de la 3',5'-di-O-acetil - 2'-O-desoxitimidina se realizd un estudio para comparar los resultados de la utilizaciön de Br2 y NBS con'ro agentes bromantes (Tabla 4). Tabla 4.- Condiciones de reacciön ensayadas para la obtenciön de la 3' , 5'- di-O-acetil-5bromometil 2'-O-desoxiuridina a partir de la 3' , 5'- di-O-acelil-2'-O-desoxitimidina con el empleo de diferentes agentes bromantes en CCI+. Agtes. Bromantes Relaciön molar nucleösido: Agte. Bromante 1:1.5 Conversiön* (%) Tiempo de reacciön (h) 5 *>r* 6 x** 2.5 ) Bromo molecular. Brz a-6) '> lQ- öi " I O \o ao I I ^r ' tA9rl \-.1 =lrvtJ a)c)l I 9 A.; c! cö >y= .9c; (tsi '= 'rA-. _\, !i (-) E (-) o6 a- co I 'o ca ho.!A !-A o 1 .K o O o-q Ph --\ (gN'r= .9 ! c E z trc.l I =\ a ca o-o:! NOi,., aä4 -oc ö00 ? L v)-.- 9-! Ni^ () O o c'l O I -Y! 0)-o:: -o A; *t= - '-"1.= C)-: tr v ! 9!V ^ LAF; ^-N I aa C..i o.l c..l (-) ö:l O Q9 F-r .=< y = I ^v VdI \Y P ,^ i-v -äö A^ö vL^ a|r) .i I I ca I z ta) I t-r @ .ö . I L\ 't' (-) n ca vl aa v1 AJOJÄ L -vL 6 9o9 tl-^ vu!w Lg-! LT\I E ! ( to , "''\-4o A: B: (39) (35) (35) ,/ t c: " (37) - "r'."n ,n* '"t n C /\H-ct 't \). \HcocoraBr o/ o, .,"^l'(" d "öe ilx ,F/'-\{ Ho \n, H,c F)-\/ t 17.- Keller, G. H.; Cumming, C 1988, 170,441. u'; 18.- Traincard, F.; Ternynck, T.; Danchin, A'; Avrameas, S',Ann' Immunol'/ Inst Pasteur 1983,134,399. 19.- Niedobitek,G.; Finn,T.; Herbst,H.; Bornhöft,G.; 1988, 131, 1. 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