Sequenciamento usando o Método de Sanger Luiz Claudio Santana da Silva Maira Cicero Ferreira.

Slide 1 Sequenciamento usando o Método de Sanger Luiz Claudio Santana da Silva Maira Cicero Ferreira Slide 2 Histórico 1975: primeira descrição do sequenciamento. Esse procedimento foi feito usando DNA polimerase, primer, dNTP e ddNTP marcadas por 32 P. Sanger, Coulson, 1975. Slide 3 dNTPs Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA. Slide 4 ddNTPS SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997 Slide 5 ddNTPS Atkinson mostrou a atividade inibitória do ddTTP (2´3´dideoxitimidina trifosfato). Após a incorporação do ddTTP ocorre a inibição da síntese da cadeia. ATKINSON, DEUTSCHER, KORNBERG, RUSSELL, MOFFATT. 1969 SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997 Slide 6 Metodologia Desnaturação do DNA de dupla fita. Primers: iniciam a reação feita pela DNA polimerase, nesse momento será definido qual a cadeia que será usada como molde. Sanger, Coulson, 1975. Slide 7 Metodologia Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs. Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente ao invés do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização. Sanger, Coulson, 1975. Slide 8 ddNTP marcada por 32 P Feitas 4 reações: uma para cada base ddNTP marcada por 32 P. Formados diversos fragmentos com tamanhos variados, de acordo com a posição e o ddNTP incorporado. Sanger, Coulson, 1975. Slide 9 ddNTP marcada por 32 P Feito gel desnaturante de poliacrilamida. A autoradiografia é feita após a corrida do gel. Sanger, Coulson, 1975. Slide 10 Leitura Após autoradiografia a ordem dos nucleotídeos, pode ser visualizada. Porém, esta será complementar ao molde. Sanger, Coulson, 1975. Slide 11 Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA. Slide 12 Sanger, Coulson, 1975. Slide 13 Sequenciadores automáticos Criado em 1986 pela Applied Biosystems. O princípio é o mesmo do sequenciamento manual feito por Sanger. ddNTPs são marcados por fluorescência característica, permitindo a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência. Slide 14 Sequenciadores automáticos Feita a eletroinjeção onde as moléculas de DNA(-) em suspensão são introduzidas nos capilares. Cada fragmento, recebe um feixe de laser de argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD. Slide 15 Sequenciadores automáticos A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde. Slide 16 Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA. Slide 17 Slide 18 Slide 19 Slide 20 Formato de saída – AB1 Slide 21 Formato de saída- AB1 Slide 22 Formato de saída – AB1 Slide 23 Formato de saída – PHD Slide 24 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGT ATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGG GTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCT GGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGT TCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNA CCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCC CACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCG GCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAG GGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAG GGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGAC ACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNA CANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANC CCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNN CCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNN NNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNN NNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN Formato de saída – SEQ Slide 25 Resumo do método Sanger Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA. Slide 26 Principal aspecto positivo Leitura de fragmentos longos. Principal aspecto negativo Valor elevado por base sequenciada. Slide 27 Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA. RESUMO DAS PLATAFORMAS Slide 28 Björn Nystedt, 2011 Slide 29 RESUMO DAS PLATAFORMAS Björn Nystedt, 2011 Glenn, 2011 Slide 30 OBRIGADO (A) !