Recherche en pneumologie 669 dans les LLP (May-Grünwald Giemsa), un phénomène de mort cellu- laire dans certaines zones sous-pleurales (marquage TUNEL) et une augmentation du taux de TGF-�1 dans LLP (respectivement ×3 et ×8 comparé au CT, p < 0,05). Nous suspectons également une TEM des cellules méothéliales en raison de la surexpression d’HSP27 (Wettstein, FASEB 2013) et d’une migration de cellules pleurales dans les régions sous-pleurales à J10. Conclusion.— L’administration systémique de bléomycine chez le rongeur induit une FP marquée de la plèvre et de la région sous- pleurale comme cela est observé dans la FPI. Nous montrons une activation de la caspase-1 et de la TEM des cellules mésothéliales dans l’initiation de cette FP. ANR 11-BSV-011-01meso-IPF/GW et OB ont reçu le soutien du Fond de Dotation «Recherche en Santé Respiratoire ». http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.056 57 Étude de la régulation du canal chlorure ANO1par les microARNs chez les patients atteints de mucoviscidose F. Sonneville a,∗, M. Ruffina, P. Le Rouzica, S. Blouquit-Layeb, L. Guillot a, A. Clementa, H. Corvol a, O. Tabarya a CDR Saint-Antoine, Paris, France b UPRES, EA 220, Suresnes, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail :
[email protected] (F. Sonneville) Mot clé : Physiologie Introduction.— La déficience de l’activité du canal chlorure CFTR observée dans la mucoviscidose (CF) est à l’origine de la dégradation de la fonction respiratoire des patients. Cette atteinte pulmonaire est la principale cause de morbidité et de mortalité de ces patients. En 2008, trois groupes ont identifié un nouveau canal chlorure : le canal ANO1 (TMEM16a), proposé comme cible thérapeutique potentielle pour restaurer les efflux chlorures au niveau pulmo- naire dans la mucoviscidose. Des travaux précédents du laboratoire ont également montré que l’activité et l’expression d’ANO1étaient diminuées dans un contexte CF et que l’origine de cette diminution reste aujourd’hui inconnue. Une hypothèse serait que les miRNAs, comme cela a été montré sur d’autres canaux ioniques, pourraient avoir un rôle majeur dans cette dérégulation. L’objectif de ce travail est de comprendre l’origine de la diminution d’expression d’ANO1dans les cellules CF en étudiant le rôle des miRNAs. Méthodes.— Nous avons utilisé des bases de données bio- informatiques afin d’étudier les miRNAs qui pourraient cibler ANO1. Pour initier ce projet, nous avons évalué les niveaux d’expression d’un miRNA candidat par RT-qPCR dans des lignées de cellules épi- théliales bronchiques et dans des explants pulmonaires humains CF et non-CF. Afin de valider le lien entre ANO1et ce miRNA, nous avons effectué des expériences de fonctionnalité en étudiant la liaison du miRNA candidat au 3′UTR d’ANO1en condition de sur- ou sous- expression du miRNA, et en quantifiant l’expression d’ANO1dans ces mêmes conditions. Résultats.— L’étude bio-informatique nous a permis d’identifier dif- férents miRNAs dont miR-9 comme régulateurs potentiels d’ANO1. L’étude de l’expression de miR-9 dans un contexte CF versus non-CF n’a cependant pas montré de différence d’expression de celui-ci, ni de régulation d’ANO1par celui-ci. Conclusion.— Nos résultats suggèrent que miR-9, seul, ne régule pas l’expression d’ANO1 au niveau des cellules épithéliales bronchiques, mais nous a permis de mettre en place les techniques qui serviront de base à ce projet. Chez les patients CF, des stratégies théra- peutiques alternatives à la déficience de CFTR sont d’un intérêt majeur et sont complémentaires aux stratégies protéiques propo- sées pour CFTR. De plus ces stratégies visant ANO1pourraient être appliquées à un grand nombre de patients en étant indépendantes de la mutation de CFTR. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.057 58 Effets du SAHA (iHDAC) sur un modèle ex vivo d’épithélium nasal de patients atteints de mucoviscidose A. Bergougnouxa,b,c,∗, L. Knabea, A. Fort a,d, E. Bribesa,c, R. Chirona, A. De Sariob,c, M. Claustresa,b,c, N. Molinari a,c, M. Taulan-Cadars a,b,c, I. Vachier a, A. Bourdina,d a CHU de Montpellier, Montpellier, France b Inserm U827, Montpellier, France c Université Montpellier I, Montpellier, France d Inserm U1046, Montpellier, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail :
[email protected] (A. Bergougnoux) Mots clés : Mucoviscidose ; Infection-Inflammation Introduction.— La mucoviscidose résulte d’un défaut d’expression membranaire de protéine CFTR. Le SAHA, inhibiteur d’Histone DéACétylases (iHDAC), est capable de restaurer une protéine CFTR mature et fonctionnelle dans la lignée cellulaire CFBe41o- (F508del homozygote). Les objectifs de ce travail sont d’obtenir et de carac- tériser notre modèle ex vivo d’épithélium nasal différencié en quantifiant l’expression de marqueurs épithéliaux (FOXJ1, MUC5AC, MUC5B) et inflammatoires (IL-8, ALOX15A, ALOX15B) et d’évaluer l’action du SAHA sur la restauration de CFTR dans ce modèle ex vivo. Méthodes.— À 28 jours de différenciation des epithelia de patients CF F508del homozygotes (n = 8) ou de témoins sains non-CF (n = 10), un traitement basolatéral de SAHA (4�M) est appliqué 5 jours (J + 5) puis arrêté 5 jours (J + 10). L’hyperacétylation des lysines (Western Blot, WB) et l’absence de surmortalité cellulaire (activité LDH) pro- duite par le SAHA ont été vérifiées. L’expression du CFTR (RTqPCR et WB), des marqueurs épithéliaux et inflammatoires (RTqPCR), la sécrétion des mucines (ELLA) et d’IL-8 (Elisa) ont été évaluées avant et après traitement. Les modifications structurelles de l’épithélium ont été déterminées par immunofluorescence (marquage MUC5AC, �tubuline et DAPI). Résultats.— En l’absence de traitement, l’expression des marqueurs épithéliaux varie peu entre CF et non-CF. À J + 5, nous observons une diminution significative de l’expression de CFTR, ainsi que du taux de transcrits ALOX15A et ALOX15B. Bien que la synthèse d’IL- 8 (ARNm) ou sa sécrétion basolatérale ne soient pas modifiées, sa sécrétion apicale est diminuée. Par ailleurs, nous observons une diminution significative des transcrits MUC5AC et MUC5B, de la sécrétion apicale des mucines et du nombre de cellules à mucus. Nous observons une réversibilité de ces effets à J + 10. Conclusions.— Le SAHA ne permet pas la restauration apicale du CFTR dans notre modèle ex vivo d’épithélium respiratoire dif- férencié, contrairement à ce qui a été observé dans la lignée transformée CFBe41o-. De plus, le SAHA induit une augmentation de l’inflammation par modification du gradient chimio-attractant d’IL-8 et diminution de la synthèse de lipoxygénases impliquées dans la résolution de ce processus. Enfin, le SAHA induit une dé- différenciation transitoire des cellules caliciformes. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.058 59 Les cellules souches mésenchymateuses réduisent l’apoptose des cellules épithéliales alvéolaires induite par l’hypoxie en modulant la signalisation antioxydante dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.056 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.rmr.2014.04.057&domain=pdf mailto:
[email protected] dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.057 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.rmr.2014.04.058&domain=pdf mailto:
[email protected] dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.058 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.rmr.2014.04.059&domain=pdf 670 O. Bernarda, F. Jenya, E. Dondi c, Y. Uzunhana, S. Sivarajaha, V. Vanneauxb, J. Largherob, H. Nunèsa, C. Planèsa, N. Darda,∗ a Réponses cellulaires et fonctionnelles à l’hypoxie, EA2363, université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, Bobigny, France b Institut de thérapie cellulaire, hôpital Saint-Louis, AP—HP, université Paris 7, Sorbonne Paris Cité, Paris, France c ASIH, UMR Inserm 978, université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, Bobigny, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail :
[email protected] (N. Dard) Mot clé : Inflammation Introduction.— L’apoptose massive des cellules épithéliales alvéo- laires (CEA) observée lors des agressions alvéolaires aiguës et/ou fibrosantes compromet gravement l’efficacité de la réparation alvéolaire. Ce phénomène est vraisemblablement favorisé par l’hypoxie (HX) alvéolaire. De façon intéressante, l’administration de cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSM) dérivées de moelle osseuse limite l’inflammation, la fibrose et la mortalité dans divers modèles murins d’agression alvéolaire par un méca- nisme encore mal compris. Notre hypothèse est que les hCSM favorisent la réparation alvéolaire après lésion en limitant l’apoptose des CEA induite par l’hypoxie, via une modulation de la signalisation hypoxique des CEA (facteurs de transcription HIF�, production d’espèces réactives de l’O2). Méthodes.— Des CEA de rat cultivées sur filtres semi-perméables ou en fonds de puits ont été exposées à une hypoxie sévère (HX, 1,5 % O2) ou à la normoxie pendant 24 h à 48 h, en présence ou non de milieu conditionné de hCSM (MC-hCSM) ou d’antioxydant (N-acétyl- cystéine, NAC). L’apoptose des CEA, l’expression d’HIF� et l’activité des enzymes antioxydantes ont été analysées. Résultats.— L’apoptose des CEA induite par l’HX est en grande par- tie prévenue lorsque les CEA sont co-cultivées avec des hCSM, ou incubées avec le MC-hCSM ou la NAC. L’activité des enzymes anti- oxydantes (catalase, glutathion peroxydase) de CEA exposées à l’HX est augmentée en présence de MC-hCSM. L’incubation des CEA avec le MC-hCSM ou la NAC réduit l’expression d’HIF2� induite par l’HX. L’effet anti-apoptotique du MC-hCSM est conservé lorsque le MC- hCSM est déplété en Keratinocyte Growth Factor (KGF). Conclusion.— Les hCSM réduisent l’apoptose des CEA induite par l’HX, par un effet paracrine indépendant du KGF. Cet effet pourrait être dû à une stimulation de l’activité des enzymes antioxydantes des CEA permettant de limiter l’accumulation délétère des espèces réactives de l’O2 et l’expression d’HIF2� au cours de l’HX. L’effet anti-apoptotique des hCSM sur les CEA pourrait en partie expliquer leur effet bénéfique en cas d’agression alvéolaire. Financement : Legs Poix, Université Paris 13. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.059 60 Étude de la régulation de l’expression d’Endocan murin par les cellules endothéliales pulmonaires, in vivo et in vitro, en condition inflammatoire localisée au poumon T. Vanparis ∗, N. De Freitas Caires , A. Tsicopoulos , P. Lassalle U1019, équipe 11, institut Pasteur de Lille, Lille, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail :
[email protected] (T. Vanparis) Mots clés : Infection ; Inflammation ; Endocan ; ALI Introduction.— Le SDRA (syndrome de détresse respiratoire de l’adulte) et l’ALI (Acute Lung Injury) concernent 10 à 15% des patients hospitalisés en unité réanimatoire. Il s’agit d’une lésion pulmonaire consécutive à une invasion tissulaire excessive du paren- chyme pulmonaire par des polynucléaires neutrophiles (PNN). Endocan est un protéoglycane exprimé par les cellules endothéliales pulmonaires et rénales. Sa synthèse est régulée chez l’homme par le LPS et par des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-�. Sa dégradation se fait par des protéases du PNN. Son principal rôle est son action anti-inflammatoire par blocage de la liaison endothélium- leucocyte. Endocan, à des taux sériques élevés, serait prédictif de l’absence d’ALI chez les patients polytraumatisés réanimatoires. Méthodes.— In vivo, un modèle d’ALI par administration de LPS en intra-trachéal a été développé chez la souris. Après sacrifice à H2, H4, H8, J1, J3, J5 et J7 ; avec prélèvements des sérums, des poumons et réalisation de LBA ; l’endocan, l’E-sélectine, la myé- lopéroxydase, et des cytokines pro-inflammatoires sont dosés par Elisa. In vitro, une méthode de culture primaire de cellules endothéliales pulmonaires murines a été élaborée grâce à un tri positif par anti- corps anti-CD31. Ces cellules purifiées ont ensuite été stimulées par le VEGF, le TNF-� ou le LPS, avant recueil des surnageants à 24 h et 48 h. Résultats.— In vivo, l’ALI est validé grâce à la présence d’un exsudat associée à un infiltrat en PNN dans le LBA. L’activation neutrophilique et endothéliale, démontrée par l’augmentation de l’E-sélectine et de la myéloperoxydase, confirme l’inflammation. Dans ces conditions, la concentration d’endocan sérique chute très rapidement dès H2, avec un creux obtenu à H8 suivi d’une réaug- mentation progressive sans restitution intégrale à J7. Localement, endocan pulmonaire suit exactement la même cinétique avec cette fois-ci un seuil minimal plus tardif à J3. In vitro, il existe une nette augmentation des taux d’endocan dans le surnageant des cellules murines stimulées par le VEGF, mais pas de variation en présence de TNF-� et même une tendance à la diminution avec le LPS. Conclusions.— La chute des taux d’endocan sérique et pulmonaire est à mettre en relation avec l’invasion et l’activation des PNN. Cependant, cette chute pourrait aussi être liée à une régulation différente de l’Endocan par rapport à l’homme, selon les résultats in vitro. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.060 61 Modélisation in vitro de l’épithélium bronchique par la technologie des cellules souches pluripotentes induites C. Sansaca,b,c,∗, A. Petit d,e, Q. Bai b,c, J. Bouckenheimerb,c, L. Knabed,e, I. Vachierd, A. Bourdinb,d,e, J. De Vosa,b,c a UTC, CHRU de Montpellier, Montpellier, France b UM1, Montpellier, France c IRB/Inserm U1040, Montpellier, France d Inserm U1046, Montpellier, France e Service des maladies respiratoires, CHRU de Montpellier, Montpellier, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail :
[email protected] (C. Sansac) Mots clés : Physiologie ; Contrôle ventilatoire Introduction.— Les cellules souches pluripotentes comprennent les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripo- tentes induites (iPS). Elles suscitent un intérêt grandissant en raison de leur capacité à générer tous les tissus. Notre projet a pour objectif d’utiliser la technologie des iPS pour produire in vitro de l’épithélium bronchique dans le but de modéli- ser in vitro des pathologies bronchiques et de fournir du tissu pour du crible pharmacologique. Méthodes.— Les iPS sont obtenues par reprogrammation cellulaire de cellules différenciées. Cette technique consiste à surexprimer quatre facteurs de transcription (OCT4, SOX2, c-MYC et KLF4) dans une cellule telle qu’un fibroblaste de peau [1]. Les iPS peuvent mailto:
[email protected] dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.059 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.rmr.2014.04.060&domain=pdf mailto:
[email protected] dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.060 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.rmr.2014.04.061&domain=pdf mailto:
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