ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la Producción Ingeniería en Alimentos FACTORES INTRÍNSECOS Y EXTRÍNSECOS QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO MICROBIANO TEMPERATURA Profesora: Msc. Ma. Fernanda Morales Integrantes: Gálvez Jiménez Denisse Figueroa Chico Grimaneza Tito Uzhca Javier Barzallo Sesme Joselyne Mero María José Fecha: Guayaquil, 30 de noviembre del 2010 Introducción Nuestro entorno está rodeado de muchas formas de vida, y como toda forma de vida cumplen distintas funciones. Y estas son objeto de estudio en nuestro trabajo. Estas formas de vidas a las que llamaremos microorganismos son aquellos que cumplen un rol muy importante en la naturaleza, sea este beneficioso o perjudicial. Lo interesante de esta investigación es que aparte de conocer la morfología de estos microorganismos vamos a ir irrumpiendo en el mundo estructural químico, la calidad tanto proteica como lipídica, puesto que los microorganismos se desarrollan en diferentes medios, que no exactamente son los medios en los que nosotros nos desarrollamos óptimamente. Estos microorganismos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas de factores extrínsecos como la temperatura, en el cual nos enfocaremos en este trabajo, unos se pueden desarrollar en medios con temperatura extremadamente baja, y a si mismo en temperaturas extremadamente altas. Tomando en cuenta que siempre tendrán un rango de temperatura tanto máxima como mínima y desde luego la optima. Son estas variaciones las que nos hacen suponer que estos microorganismos difieren en muchas de sus estructuras, y eso es lo que queremos aclarar en nuestro trabajo. Saber porque estos microorganismos se pueden desenvolver bajo estas condiciones sin que su estructura sufra modificación alguna y mucho menos se destruya. Así que nos basaremos principalmente en estudiar cada uno de los componentes lipídicos y proteicos, explicando su calidad monomerica y la estructuras glucosidicas que conforman la membrana, como los componentes sobre los cuales recae el daño que produce la temperatura a las estructuras, así como también su metabolismo y desarrollo de los mismos. Como sabemos los microorganismos en la rama alimentaria son definitivamente un factor muy importante ya que de ellos dependen la calidad o el fracaso del producto en desarrollo y sobretodo en el producto final, es necesario conocer cada una de las características de los mismos y cómo actúan frente a cualquier condición, de manera que podamos controlarlo a tiempo usando las medidas necesarias. De esta manera damos paso al comienzo de nuestra investigación, esperando que su contenido sea de mucha ayuda para aclarar las cuestiones planteadas. Mercedes La Temperatura como factor extrínseco que influye en el desarrollo de microorganismos Ya que el proceso de desarrollo de las bacterias dependen de reacciones químicas y la velocidad con que se efectúan estas reacciones. Estas también dependen de la temperatura y el patrón de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condición. La temperatura puede, en parte determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismos. Las variaciones en la temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. Cada especie de bacterias crece a temperaturas que están dentro de ciertos límites (mínima, máxima y óptima). De acuerdo a esto los microorganismos se pueden dividir en los siguientes grupos: Grupo Termófilos Termoduricos Mesófilas Psicrófilas Psicrótrofas Mínima 40 5 50 15 15 - 25 Óptima 55 30 15 25 75 45 20 30 30 - 40 Máxima 60 25 15 30 90 47 20 35 45 - 50 -5 hasta +5 -5 hasta +5 Tabla de crecimiento microbiano a diferentes temperaturas y ejemplos Clasificación de los microorganismos por su tolerancia a condiciones extremas Otros aspectos de la diversidad fisiológica de los microorganismos, particularmente de los procariotas, es la notable capacidad de algunas especies para vivir en hábitat caracterizado por uno o más parámetros extremos en las condiciones ambientales. Por ejemplo, no solo hay procariotas que crecen a un pH 7 y a 25ºC (condiciones que son ideales para el humano) sino que los procariotas abundan en fuentes termales con agua en ebullición, en el hielo, en aguas de elevada salinidad, y en suelos ya aguas que tienen un pH inferior a 0 o tan alto como 12. Por tanto, las especies de procariotas que habitan estos ambientes definen los límites biológicos de las condiciones fisicoquímicas extremas. En ocasiones, no se trata de que tales procariotas sean simplemente tolerantes a estas condiciones extremas sino que realmente requieran de tales condiciones para crecer. Por esta razón estos procariotas se denominan extremófilos para resaltar su condición de una o más condiciones extremas. Extremófilos: Microorganismos donde su hábitat normal pueden ser extremadamente caliente o extremadamente frío En el mundo de las eucariotas raramente se requiere condiciones extremas para crecer y, cuando ocurre, tales situaciones extremas son mucho más moderadas. En el hábitat que presentan condiciones ambientales extremas los procariotas son mayoritarios. La supervivencia de los extremófilos es posible debido a que sus células tienen componentes y propiedades particulares que les permiten mantenerse estables en el entorno en el que viven. Algunas de estas propiedades se detallan a continuación: y - Contienen enzimas estables. Por ejemplo, los termófilos tienen enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas y protegen al ADN para evitar su degradación. Estas enzimas, al igual que las que funcionan a bajas temperaturas o a pH extremos, son conocidas como extremozimas. y y y y - La membrana celular no es una bicapa de lípidos, como en el resto de los seres vivos, sino una monocapa, con uniones químicas distintas a las de las membranas convencionales, que le otorga mayor estabilidad. - Los que habitan en sitios muy salinos (halófilos) acumulan sales también intracelularmente, y así mantienen un equilibrio osmótico con el medio que los rodea sin deshidratarse. - Los que habitan en glaciares acumulan solutos que impiden que se congelen (similar a la función que cumple el anticongelante en un auto). - Los que metabolizan compuestos inorgánicos tienen enzimas que le permiten hacerlo. Otra aplicación de las enzimas obtenidas de los extremófilos es la investigación básica. Por ejemplo, en laboratorios de biología molecular se utilizan técnicas que requieren de enzimas estables a altas o bajas temperaturas. Un caso puntual es la técnica conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), en la cual se requiere una enzima (ADN polimerasa) que produce cadenas de ADN a 94 ºC. Para lograrlo se utiliza la ADN polimerasa obtenida del termófilo Thermus aquaticus. Por lo tanto la clasificación que podemos dar a los microorganismos por su tolerancia a condiciones extremas en temperaturas son: y Psicrófilo: Se desarrollan en ambientes de temperatura muy fría, como la Polaromonas vacuolata. Hay algunos cuya temperatura óptima todavía es más baja, los llamamos psicrófilos extremos, un ejemplo es Polaromonas vacuolata, que vive en las aguas de la Antártida; su temperatura óptima es de 4ºC y la máxima que resiste es de 14º C; a más temperatura se muere de calor. Termófilo: Se desarrollan en ambientes a temperaturas superiores a 45ºC, algunos de ellos, los hipertermófilos tienen su temperatura òptima de crecimiento por encima de los 80ºC., como el Pyrococcus furiosus. y Ejemplos de microorganismos que crecen a diferentes rangos de temperatura para su crecimiento Calidad Proteica en Microorganismos Para comprender lo que es una proteína, empezaremos por definir una de ellas y los factores por los cuales pueden degradarse, de manera que comprenderemos a que se debe que un microorganismo pueda desarrollarse en ambientes de estrés extremos sabiendo que la proteína es susceptible a cambios bruscos. PROTEINAS Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. La estructura es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia de aminoácidos. Propiedades físico-químico de las proteínas AA con R no polar o apolar (Hidrofóbicos): Poco soluble en agua. Hidrocarburos alifáticos: alanina, leucina, isoleucina, valina y prolina. Anillo Aromático: fenilalanina y triptófano. Azufrado: metionina AA con R polar (Hidrofílicos): Son más solubles en agua. sin carga (neutro): serina, treonina y tirosina (OH); asparagina y glutamina (NH2),Cisteína (HS) Con carga (+) aa básicos: lisina, arginina e histidina [CH6N3]+. * Con carga (-) aa ácidos: aspártico y glutámico (COO-) * Desnaturalización Pérdida de la estructura tridimensional o conformación, y por tanto también de la actividad biológica. Se produce al variar la temperatura, presión, pH, electronegatividad, etc. Esto provoca la rotura de los puentes de hidrógeno que mantienen las estructuras secundaria y terciaria, y las proteínas se convierten en fibras insolubles en agua. Si las condiciones son suaves, el proceso es reversible, y si el cambio es más drástico, es irreversible. Efectos de la desnaturalización proteica Descenso de solubilidad Modificación de la capacidad de fijación de agua Pérdida de actividad biológica Susceptibilidad al ataque proteasas Incremento de viscosidad Incapacidad de cristalizarse de Plegamiento de Proteínas La función de cualquier proteína depende en gran medida de cómo se ha plegado, de su estructura terciaria, de su forma. Una estructura que de momento no sabemos predecir a partir de su secuencia de aminoácidos. Si la temperatura es demasiado alta la proteína empieza a perder su estructura tridimensional, se despliega y forma agregados; se dice entonces que la proteína se ha desnaturalizado. Además, a partir de un punto, no hay vuelta atrás. Las células mantienen un completo sistema de proteínas funcionalmente competentes que hacen frente a lesiones o procesos estresantes a través del uso de varios mecanismos, que incluyen el complejo conjunto de proteínas denominadas chaperonas moleculares. La típica función de un chaperona recae en asistir a una naciente cadena polipeptídica para lograr una conformación funcional como proteína nueva y después apoyar la llegada de dicha proteína al sitio celular en donde realizará sus funciones; es decir, muchas proteínas requieren la ayuda de de otras proteínas llamadas chaperones moleculares para el plegamiento apropiado o para ensamblarse en complejos grandes. Los chaperones no forman parte de las proteínas, ensambladas. Una actividad importante de los chaperones; es impedir la agregación impropiamente de las proteínas. Existen muchos tipos de estos chaperones e incluso algunos están asociados con los ribosomas. Algunos también son muy abundantes en la célula. Estas proteínas parecen estar ampliamente distribuidas y sus secuencias altamente conservadas. Un tipo de chaperón molecular, conocido como chaperoninas, está presente casi con seguridad en todos los organismos vivos. La proteína no-plegada o plegada inapropiadamente entra en el chaperón molecular en donde se pliega y luego se libera. La energía para el plegamiento proviene del ATP. Otros chaperones moleculares están implicados en conducir la proteína no-plegada hasta la chaperonina. Además de plegar las proteínas recién sintetizadas, los chaperones pueden volver a plegar proteínas que han sido parcialmente desnaturalizadas en la célula. Tal desnaturalización puede producirse si el organismo ha experimentado temporalmente altas temperaturas en su ambiente. La renaturalización no siempre tiene éxito, y las células también poseen proteasas que identifican y destruyen las proteínas mal plegadas. Psicrófilos Microorganismos que crecen a 0 °C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas superiores, cercanas a 15 °C o 20 °C. Las bacterias psicrófilas aisladas de aguas antárticas contienen un gran número de proteínas excepcionalmente lábiles al calor. Los Psicrófilos pueden crecer sólo a bajas temperaturas porque algunas de sus proteínas son inusualmente sensibles al calor. La estabilidad al calor refleja la estructura proteica total. Esto es, poseen mayor cantidad de hechices alfa y, menor cantidad de hojas beta en sus estructura secundaria. La disposición en hojas beta tiende a ser una estructura más rígida y la mayor cantidad de hélices alfa en las enzimas activas en frío puede permitir a estas proteínas mayor flexibilidad en estas condiciones. Estos microorganismos también crean proteínas anticongelantes para mantener su interior líquido y proteger su ADN a temperaturas por debajo de la de congelación del agua. A baja temperatura, todas las proteínas sufren ligeros cambios de conformación atribuibles al debilitamiento de sus enlaces hidrófobos, que cumplen una importante misión en la determinación de la estructura terciaria (tridimensional). Todos los otros tipos de enlace en las proteínas se hacen más fuertes a medida que la temperatura desciende. La importancia que tiene una conformación precisa en el funcionamiento adecuado de las proteínas alostéricas y en el autoensamble de las proteínas ribosómicas hace a esas dos clases de proteínas particularmente sensibles a la inactivación por el frío. En el caso de las bajas temperaturas la fluidez de la membrana disminuye, las proteínas se vuelven rígidas: en respuesta los Psicrófilos muestran disminución en interacciones iónicas y enlaces de hidrógeno, poseen menos grupos hidrofóbicos y más grupos cargados en la superficie. Debido a estas modificaciones los psicrófilos pierden su rigidez y ganan flexibilidad estructural para la realización de sus funciones. Los psicrófilos vienen equipados con proteínas especiales para adaptar su estilo de vida al frío. Algunas de estas proteínas actúan como anticongelante para bajar el punto de congelación del agua, para prevenir el congelamiento, expansión y rompimiento de la célula. Otras proteínas (enzimas) están especialmente formuladas para asegurar que la función química continuará aún cuando la temperatura disminuya hasta los dígitos más bajos del termómetro. Psicrótrofos Las psicrófilas facultativas o psicrotolerantes (también llamadas psicrotrofas) presentan temperatura óptima en torno a los 20 30 °C y máximas a los 35 ºC. Muchas de las especies aisladas en la Antártida se encontraron en proliferación a -7 °C, pero se desarrollaron en forma óptima entre 20 y 30 °C. Los microorganismos psicrótrofos tienen un ritmo metabólico más lento. No se conoce totalmente las causas exactas por las que a temperaturas bajas el ritmo metabólico es más lento. Se sabe que conforme disminuye la temperatura, el ritmo de la síntesis de proteínas decrece, y esto ocurre sin que se modifique la cantidad de ADN de la célula. Por otra parte, parece ser que, a temperaturas de crecimiento bajas, la disminución de la síntesis proteica está relacionada con la disminución de la síntesis de determinadas enzimas. Las causas de la temperatura mínima de crecimiento son más complejas, pero la mayoría tienen la misma base. Las interaciones hidrofóbicas de las proteínas se hacen más débiles cuando disminuye la temperatura, y la forma de las proteínas cambia ligeramente. La función de algunas proteínas, incluidas las que regulan el metabolismo, es particularmente sensible a dichos cambios, y por lo tanto, a bajas temperaturas, los mecanismos de regulación metabólica se distorsionan y se detiene el crecimiento. Termoduricos Las bacterias termoduricas, que en su mayoría son mesófilas que resisten temperaturas de pasteurización, algunas de ellas son termófilas. Se encuentran en este grupo lo Micrococcus Microbacteirum, Esporas de Bacillus y Clostridium.´ Las proteínas de estos microorganismos al verse en riesgo debido al aumento de temperatura tienden a desnaturalizarse pero junto con la ayuda de chaperonas esta puede evitar el desplegamiento y así continuar con sus funciones. Termófilos En base a las temperaturas e crecimiento, los microorganismos termófilos pueden ser definidos como microorganismos cuya temperatura mínima de crecimiento se encuentra en torno a 45 °C, cuya óptima está comprendida entre 50 y 60 °C y cuya máxima es de 70 °C o más. Los termófilos crecen a temperaturas elevadas porque sus proteínas son excepcionalmente estables al calor, las proteínas de termófilos presentan un mayor contenido de pares iónicos en la superficie. Se ha demostrado que muchas proteínas específicas de las bacterias termófilas son considerablemente más estables al calor que sus homólogas de bacterias mesófilas. Todas las proteínas de una bacteria termófila permanecen en estado nativo después de un tratamiento por calor que desnaturaliza casi todas las proteínas de un mesófilo afín. Por consiguiente, se deduce que la adaptación de un microorganismo termófilo a su medio termal solo puede lograrse mediante cambios de mutación que afecten las estructuras primarias de la mayoría (si no todas) de las proteínas de la célula. Aunque las adaptaciones evolutivas que han dado lugar a los termófilos tienen que haber implicado mutaciones que hayan incrementado la estabilidad térmica de sus proteínas, la mayor parte de las mutaciones que afectan las estructuras primarias de una proteína específica (por ejemplo: una enzima) disminuyen su estabilidad térmica, incluso aunque muchas de esas mutaciones tengan un escaso o nulo efecto sobre sus propiedades catalíticas. Por ello, en ausencia de contra selección por la presión térmica ambiental, la temperatura de crecimiento máxima de cualquier microorganismo descendería progresivamente como resultado de mutaciones al azar que afecte la estructura primaria de sus proteínas. En el caso de los organismos termófilos e hipertermófilos, las proteínas se condensan para excluir el agua de su interior, tienen un grado más alto de hidrofobicidad, tienen las cadenas de ácidos grasos más saturadas y más largas (en los archaea están unidas por éter, y son cadenas de ácidos grasos ramificadas que todavía son más hidrófobas). Es decir, Si aumenta la temperatura varía la presencia de proteínas y sistemas enzimáticos capaces de ser funcionales a altas temperaturas. Para ello presentan un empaquetamiento altamente hidrofóbico que establece puentes salinos, lo que confiere mayor estabilidad. También la maquinaria encargada de sintetizar las proteínas (ribosomas, etc) es en conjunto mucho más estable en estos organismos, al igual que la membrana citoplasmática. Tamara Lípidos y la calidad lipídica en microorganismos Los lípidos son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono e hidrógeno y generalmente también oxígeno; pero en porcentajes mucho más bajos. Además pueden contener también fósforo, nitrógeno y azufre. Una característica básica de los lípidos, y de la que derivan sus principales propiedades biológicas es la hidrofobicidad. La baja solubilidad de los lípidos se debe a que su estructura química es fundamentalmente hidrocarbonada (alifática, alicíclica o aromática), con gran cantidad de enlaces C-H y C-C (Figura de la izquierda). La naturaleza de estos enlaces es 100% covalente y su momento dipolar es mínimo. El agua, al ser una molécula muy polar, con gran facilidad para formar puentes de hidrógeno, no es capaz de interaccionar con estas moléculas. En presencia de moléculas lipídicas, el agua adopta en torno a ellas una estructura muy ordenada que maximiza las interacciones entre las propias moléculas de agua, forzando a la molécula hidrofóbica al interior de una estructura en forma de jaula, que también reduce la movilidad del lípido. Todo ello supone una configuración de baja entropía, que resulta energéticamente desfavorable. Esta disminución de entropía es mínima si las moléculas lipídicas se agregan entre sí, e interaccionan mediante fuerzas de corto alcance, como las fuerzas de Vander Waals. Cuando se cambia la temperatura de crecimiento en un rango normal, las células no exhiben cambios de composición significativos. Sin embargo, cambios en los rangos extremos se acompañan típicamente por algunas alteraciones. Los cambios a temperatura alta induce la producción de unas 24 proteínas, incluyendo muchas proteasas, chaperones, etc. Los cambios para bajas temperaturas también induce un juego especial de proteínas que difieren de las proteínas resistentes al calor. La temperatura baja causa un cambio en los ácidos grasos con más enlaces dobles (poli-insaturados); algunas especies también disminuyen la longitud de las cadenas ácidas grasas. Estos cambios ayudan a mantener la fluidez de los lípidos a temperatura baja lo que a su vez ayuda a mantener la funcionalidad de las proteínas de membrana. Psicrófilos Las membranas están compuestas por fosfolípidos; por lo tanto, como la mayoría de los lípidos, solidifican con el frío y se hacen líquidos con el calor. Para funcionar adecuadamente, las membranas deben mantener el grado de fluidez adecuado en un intervalo de temperatura. Cómo lo hacen? De la siguiente manera: la composición en ácidos grasos de los fosfolípidos de sus membranas cambia con la temperatura ambiental. El efecto de la composición de ácidos grasos en la fluidez de los lípidos es enorme. En el refrigerador, el aceite de oliva solidifica, pero el de maíz se mantiene fluido. Esto sucede porque el aceite de maíz, es rico en ácidos grasos insaturados (contienen dobles enlaces), y el aceite de oliva tiene ácidos grasos más saturados (no contienen dobles enlaces). A la temperatura ambiente, el aceite de maíz es más fluido que el aceite de oliva. Pero al mezclar el aceite de maíz y el de olíva en las proporciones adecuadas, se puede obtener un nivel de fluidez intermedio a temperatura ambiente, en el refrigerador o a cualquier temperatura intermedia. Este mismo proceso ocurre en los microorganismos. Cuando disminuye la temperatura de crecimiento, una alta proporción de los ácidos grasos de los fosfolípidos de las membranas son insaturados, y así su fluidez es óptima a cualquier temperatura de crecimiento. En Escherichia coli este preciso ajuste se hace de una manera muy sencilla. Los ácidos grasos se sintetizan mediante una ruta metabólica ramificada. Una rama lleva a ácidos grasos saturados y la otra a ácidos grasos insaturados. Una enzima cerca del punto de ramificación, en la parte insaturada, es sensible a las elevadas temperaturas. Cuando aumenta la temperatura, su actividad disminuye, y se fabrican más ácidos grasos mediante la rama "saturada". Cuando disminuye la temperatura, ocurre lo contrario. El resultado es una fluidez constante a todas las temperaturas. Por tanto en los Psicrófilos hay una mayor proporción de lípidos líquidos (bajo punto de fusión) a temperaturas bajas. Presentan una mayor proporción de lípidos insaturados y/o de cadenas cortas, que mantienen flexibles las membranas a bajas temperaturas. El límite practico seria la temperatura de congelación del contenido celular. Los Psicrófilos se caracterizan por membranas celulares lipídicas capaces de oponerse a la rigidez que impone el frió externo, y por crear proteínas anticongelantes para mantener su interior liquido y proteger su ADN a temperaturas por debajo de la congelación del agua. El contenido de grasa bruta de un alimento o de un organismo microorganismo puede determinarse a fácilmente mediante el empleo de métodos de extracción rutinarios. El deterioro de los tejidos grasos de un animal se lleva a cabo mediante calentamiento en seco hasta que la grasa se funda o mediante vapor. Este sebo contiene partículas microscópicas de grasa recubiertas cada una con una membrana, puede fragmentarse debido precisamente a esta estructura membranal. La presencia de ácidos libres asociada a sabores jabonosos en aceites vegetales como cereales, leches, nata y huevos se debe con frecuencias a la acción de las lipasas, que actúan solamente en las interfases agua-lípido de las micelas lipídicas. En general estas enzimas catalizan la hidrólisis de los triglicéridos dando ácidos grasos y glicerol, aunque también existen enzimas especificas que catalizan la hidrólisis de monoasilgliceridos, fosfolípidos esteres de esterol. Las enzimas que catalizan la hidrólisis de estas últimas sustancias en solución acuosas, sin requerir presencia de micela lipídica son esterazas, presentes de manera natural en los aceites vegetales, granos de cereal o leche, etc. O como resultado de la contaminación microbiana. La lipólisis de la leche fresca puede inducirse por agitación y por la presencia de activadores en parte a unos no identificados. En la leche de lipasa nativa es la lipoproteína lipasa absorbida a las micelas de la caseína, que se activa por enfriamiento o en el proceso de homogenización. En el plasma sanguíneo de los mamíferos existe una activador de esta enzima, por lo que en el caso de enfermedad de la mama, la contaminación de la leche con plasma también puede dar lugar a lipólisis. Por otra parte los ácidos liberados pueden determinarse una vez extraídos con solventes orgánicos por valoración o como jabones de cobre las ganas por espectrofotometría a 440 nm. Los métodos calorimétricos y el PH-stat, que miden ácidos liberados, son menos sensibles para los homogenados de alimentos debido a la capacidad tamponante de sales y proteínas extrañas. La lipólisis se puede dividir en tres etapas: la formación de ícelas lipídicas, el establecimiento de un interfase agua-lípido y la absorción de la enzima previa a la hidrólisis catalizada por el. La energía necesaria para la formación de micela lipídica proviene de un gran cambio de energía libre producido en la transferencia de restos de alcano desde una fase acuosa a un medio ambiente no acuoso. Debido a la naturaleza interfacial de la lipólisis la velocidad de la reacción es proporcional a las concentraciones superficiales d enzimas y substratos en la micela en vez de sus concentraciones globales en la suspensión. En consecuencia para las lipasas no es fácil establecer la clásica relación entre la velocidad de una reacción y la concentración de substrato en la fase acuosa ya que la velocidad de reacción está más estrechamente relacionada con el área superficial disponible de las micelas lipídicas. Como funcionan estas estructuras componentes celulares en ambientes temperatura. químicas como de baja y alta Proteínas Como primer paso deben aparecer las chaperonas, las mismas que se encargan de plegar correctamente las proteínas realizando cambios a nivel estructural. Tanto para lo termofilos y psicrofilos, los componentes químicos, que son consecuencia de este cambio evitando el despligue (Estructura terciaria) en las estructuras proteicas, son los enlaces de hidrógeno que unen al grupo carbonilo con la amida en la estructura secundaria, los mismos presentados en el grafico: Hoja B Elises Alfa Psicrofilos Específicamente para los psicrofilos, las proteínas deben poseer mayor cantidad de hélices alfa y, menor cantidad de hojas beta en su estructura secundaria. La disposición de las hojas beta tiende a ser una estructura más rígida y la mayor cantidad de hélices alfa en las enzimas activas en frío puede permitir a estas proteínas mayor flexibilidad en estas condiciones. Poseen menos grupos hidrofobicos. Termófilos En los termófilos se da un empaquetamiento de los enlaces hidrofobicos y se dan también sustituciones de aminoácidos críticos en uno o en pocos sitios de la enzima, lo que hace que la proteínas se pliegue de tal modo que se hace termoestable y aumento en los pares iónicos entre los aminoácidos. Lípidos Termófilos Estos microorganismos poseen enlaces éter entre el glicerol y los ácidos grasos, los mismos que son saturados y más hidrófobos. Esta estructura es apolar y por tanto es más termorresistente. Psicrofilos Esto microorganismos poseen enlaces ester entre el glicerol y los ácidos grasos, los mismo que son insaturados. Como hacen los microorganismos para que sus estructuras celulares no se destruyan en ambientes extremos de temperaturas. A las estructuras celulares bacterianas las podemos dividir en: Elementos obligados: y y y Membrana citoplasmática. Ribosomas. Nucloide (Nucleoide) o cromosoma bacteriano. Elementos facultativos: y y y y y y y Capsula. Flagelos. Fimbrias o pili. Esporo. Glicocalix. Plasmidos. Transposones. En este caso nos referiremos las estructuras celulares obligadas ya que en estas se lleva a cabo la mayor parte de las funciones de los microorganismos. Membrana citoplasmática y Es la principal adaptación a la temperatura. Esta membrana es radicalmente distinta a la conocida para bacterias y eucariotas. La membrana de las Archaeabacterias se construye sobre un patrón de bifitanil tetraéter, estableciéndose pues, enlaces éter entre las moléculas de glicerol (que en las Archaeabacterias es el L-glicerol) y las cadenas laterales hidrofóbicas que jamás serán de ácidos grasos. Estas cadenas laterales están formadas en su mayoría por unidades repetitivas de isopreno. En ciertos puntos de la membrana, las cadenas laterales se unen mediante enlaces de tipo covalente y en estos puntos se forma una monocapa. De esta forma la membrana es mucho más estable y resistente a la desorganización por temperatura que las bicapas de ácidos grasos presentes en los organismos eucariotas y en las bacterias. DNA El DNA se desnaturaliza a los 70ºC. Sales mono y divalentes potencian su estabilidad debido a que estas detectan las cargas negativas de los grupos fosfato. El KCl y MgCl2 protegen al DNA de la depurinización y por tanto de la hidrólisis. Por otro lado aunque los puentes de hidrogeno entre los pares de bases individualmente son muy débiles, su conjunto mantiene unidas las cadenas de una molécula de DNA. Recuérdese que cada par de adenina timina tiene dos enlaces, mientras que el par guanina citosina tiene 3. Esto hace que los pares GC sean más fuertes que los pares AT. Cuando se eleva la temperatura los puentes de hidrogeno se rompen pero no los enlaces covalente intracatenarios y las cadenas de DNA se separan. Este proceso se denomina fusión y puede medirse experimentalmente debido a que las cadenas sencillas y las dobles difieren en su capacidad para absorber luz ultravioleta de cierta longitud de onda. El DNA con alto porcentaje de pares CG funde a temperatura más alta que una molécula de tamaño similar con más pares AT. Ribosomas En general, la termoestabilidad de los ribosomas corresponde con la temperatura. Se ha señalado que existen ribosomas termorresistentes .En un estudio de los ribosomas B. stearothermophilus no se pudieron encontrar propiedades químicas excepcionales que pudiesen explicar su termoestabilidad y, en otro estudio, no se pudieron encontrar diferencias significativas ni en la longitud ni en la disposición de los filamentos superficiales de los ribosomas de B. stearothermophilus y de E. coli. Se ha demostrado que la composición de bases del RNAr influye en la termoestabilidad de los ribosomas. En un estudio realizado en 19 microorganismos, se comprobó que conforme aumentaban las temperaturas máximas de crecimiento, el contenido de GC de las moléculas de RNAr aumentaba, mientras que el contenido de A-U disminuía. El mayor contenido de G-C contribuye a que la estructura de los ribosomas sea más estable gracias a la existencia de mayor número de enlaces hidrógeno. Por otra parte, parece ser que la termoestabilidad del RNA de los microorganismos termófilos y la del RNA de los mesófilos es parecida. Que ocurre con las glucosidicas que conforman las membranas celulares. Los glúcidos presentes en las membranas no se encuentran libres, sino que están unidos covalentemente a los lípidos formando los glucolípidos y a las proteínas formando las glucoproteínas de membrana. Aunque existen glúcidos en las membranas intracelulares, tanto glucolípidos como glucoproteínas son más abundantes en la membrana plasmática, preferentemente localizados en la monocapa externa. Los glúcidos de las membranas se ensamblan principalmente en el aparato de Golgi. Ha y tres tipos de glucolípidos: los glucoesfingolípidos, que son los más abundantes, los glicerolglucolípidos y los glucosilfosfatidilinositoles. Los gliceroglucolípidos son típicos de las membranas plasmáticas de las plantas. Sin embargo, la mayoría de los glúcidos de membrana se encuentran asociados a las proteínas. Mientras que prácticamente todas las proteínas contienen sacáridos unidos, sólo un 5 % de los lípidos los poseen. En algunos tipos celulares la cantidad de glúcidos que se encuentran en la superficie celular es tan grande que pueden ser observados con el microscopio electrónico. La célula queda así recubierta por una envoltura de glúcidos que representa entre el 2 y el 10 % del peso de la membrana plasmática. El grado de desarrollo del glucocálix depende del tipo celular. No se puede considerar a los glúcidos como moléculas inertes sino que tienen papeles importantes en el funcionamiento celular, fundamentalmente actúan como: y Lugares de reconocimiento y unión. Actúan como una huella dactilar característica de cada célula, que permite distinguir lo propio de lo ajeno. y y y Proteger a la superficie de la célula de agresiones mecánicas o físicas. Como ejemplo podemos citar a las células situadas en la luz del intestino delgado que presentan un glicocálix muy pronunciado. Poseer muchas cargas negativas, que atraen cationes y agua del medido extracelular. Actuar como receptores de moléculas que provienen del medio extracelular y que traen determinada información para la célula, por ejemplo, receptores de hormonas y neurotransmisores. Por ejemplo, los grupos sanguíneos vienen determinados por glúcidos de la membrana, lo que implica que tienen capacidad de respuesta inmunitaria. Cuando se produce una infección, las células endoteliales próximas exponen una serie de proteínas llamadas selectinas que reconocen y unen sacáridos de los linfocitos circulantes en el torrente sanguíneo y permiten su adhesión y el cruce del propio endotelio para dirigirse hacia la zona infectada. El reconocimiento celular mediado por los glúcidos es también muy importante durante el desarrollo embrionario. Son unos de los principales lugares de reconocimiento por parte de los patógenos para unirse e infectar a las células. Los virus como el de la gripe, bacterias como las E. coli patógenas y protozoos patógenos deben adherirse a la superficie celular para infectar, de otra manera serán barridos por los mecanismos de limpieza del organismo. Estos organismos patógenos poseen unas proteínas de membrana denominadas lectinas que tienen afinidad por determinados azúcares o cadenas de azúcares y por tanto sólo reconocerán a las células que los posean. La selectividad en la infección de determinados tipos celulares depende de la composición de azúcares de su glucocálix. Sólo se encuentran en el lado externo de la membrana y son oligosacáridos y en algunas membranas polisacáridos. De esta forma la célula queda envuelta de material hidrocarbonado denominado glucocálix que es el conjunto de glúcidos localizados en la membrana plasmática. En esta capa, la parte de hidratos de carbono, se pueden encontrar algunas proteínas. Los oligosacáridos pueden estar unidos a lípidos o proteínas, mientras que los polisacáridos sólo se unen a las proteínas. Monica Glucolípido Los glucolípidos (o glicolípidos) o glucoesfingolípidos (o glicoesfingolípidos) son esfingolípidos compuestos por una ceramida (esfingosina + ácido graso) y un glúcido de cadena corta; carecen de grupo fosfato. Los glucolípidos forman parte de la bicapa lipídica de la membrana celular; la parte glucídica de la molécula está orientada hacia el exterior de la membrana plasmática y es un componente fundamental del glicocálix, donde actúa en el reconocimiento celular y como receptores antigénicos. Entre los principales glúcidos que forman parte de los glucolípidos encontramos a la galactosa, manosa, fructosa, glucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y el ácido siálico. Dependiendo del glucolípido, la cadena glucídica puede contener, en cualquier lugar, entre uno y quince monómeros de monosacárido. Al igual que la cabeza de fosfato de un fosfolípido, la cabeza de carbohidrato de un glucolípido es hidrofílica, y las colas de ácidos grasos son hidrofóbicas. En solución acuosa, los glucolípidos se comportan de manera similar a los fosfolípidos El enlace glicosídico Los polisacáridon hidratos de carbono que contienen muchas unidades monoméricas (a veces cientos incluso miles) unidos por enlaces covalentes llamados enlaces glicosídicos. Se denominan enlaces glucosídicos cuando todos los Monoceros son de glucosa exclusivamente; y enlace glicosídico si el enlace se establece entre diversos hidratos de carbono además de la glucosa. Si dos azúcares (monosacáridos) se unen por un enlace glicosídico se forma un disacárido. La adición a esta molécula de otro monosacárido origina un trisacárido y cuando son varios más, un oligosacárido; una cadena muy larga de este tipo se denomina polisacárido. El enlace glicosídico puede presentar dos orientaciones, llamadas alfa y beta. Los polisacáridos con unidades respectivas de glucosa unidas entre los carbonos 1 y 4 en orientación de tipo alfa funcionan como reservas importantes de carbono y energía en bacterias, plantas y animales. Alternativamente, las unidades de glucosa unidas por enlace beta-1,4 forman la celulosa, un componente rígido de la pared celular de las platas y de las algas. Así, aunque tanto el almidón como la celulosa se componen en ambos casos solamente de unidades de glucosa, sus propiedades funcionales son completamente diferentes debido a las diferentes configuraciones, y , de sus enlaces glucosídicos. Los polisacáridos se pueden combinar también con otras clases de macromoléculas, como proteínas y lípidos, formando polisacáridos complejos del tipo de las glicoproteínas y los glicolípidos, respectivamente. Estos compuestos tienen funciones fundamentales en las membranas celulares como moleculas receptoras de superficie y residen en la cara externa de la membrana, en contacto con el medio ambiente. Los glicolípidos también constituyen una fracción importante de la pared celular de las bacterias Gram negativas y a ellos se deben algunas propiedades de las superficies de estos microorganismos Que son los microorganismos psicotrópicos Los microorganismos que juegan un papel significativo en los procesos biológicos a bajas temperaturas han sido llamados usualmente psicrofilicos. El termino psicotrópico es usado para referirse específicamente a microorganismos que son capaces de desarrollarse rápidamente a temperaturas inferiores a 7°C y que producen enzimas indeseables termorresistente como lipasas y proteasas. Especies como pseudomonas, flavobacteria, alcaligenes, acinobacter y Bacillus pertenecen al grupo de los microorganismos psicotrópicos. Este grupo generalmente son no patógenos, pero en productos como la leche pueden causar una variedad de sabores, incluyendo sabores a frutas, amargo y rancio. El número de microorganismos psicotrópicos depende de las condiciones sanitarias que prevalecen durante el proceso de la producción de la leche, depende del tiempo y la temperatura de almacenamiento antes de su producción Ejemplos de microorganismos psicotrópicos Los microorganismos psicotroficos o psicrotolerantes son aquellos que pueden crecer a bajas temperaturas, 0ºC, pero tienen un crecimiento óptimo a temperaturas sobre este rango, (20 ºC -40 ºC). Estos organismos afectan especialmente la vida útil de los productos lácteos frescos refrigerados. Es importante considerar que los microorganismos psicotroficos son una derivación de los psicrofilos pero no cumplen necesariamente con las mimas características. Los psicotroficos son tolerantes al frio, es decir que pueden desarrollarse a temperaturas bajas pero su crecimiento optimo es a temperaturas mayores, y los psicrofilos son dependientes del frio, es decir que su temperatura de crecimiento optimo es a temperaturas necesariamente bajas. Entre los microorganismos psicrotolerantes tenemos a varios géneros de bacteria como: Penicillium expansum: capaz de producir pudriciones en manzanas almacenadas a 0ºC. Causante de múltiples pérdidas en frutas, se conoce como uno de los mayores productores de patulina. Bacillus cereus: Bacilo Gram positivo, esporulado, aerobio o anaerobio facultativo, móvil. La espora es ovoidea, central y no deformante. Hidroliza la lecitina de la yema del huevo y no fermenta el manitol. Temperatura optima 30°C a 37°C, su temperatura de crecimiento 5°C a 55°C y temperatura de germinación 5°C a 8°C. Su pH optimo 4.5 a 9.3, Aw 0.95 y su concentración de sal 7.5%. Produce dos tipos de toxiinfecciones alimentarias: la forma diarreica y la forma emética. Micrococcus Luteus: Es un género de bacterias del filo Actinobacteria. 'Se encuentran en ambientes diversos, incluyendo agua y suelo. Son bacterias Gram-positivas con células esféricas de diámetro comprendido entre 0,5 y 3 micrómetros que típicamente aparecen en tétradas. Micrococcus tiene una gruesa pared celular que puede abarcar tanto como el 50% del materia celular. Sobrevive a bajas temperaturas y comienza su proliferación después de nueve días de almacenamiento del producto, siendo capaz de producir diferentes enzimas descarboxilasa productoras de cadaverina y putrescina que causan la descomposición del alimento mantenido en congelación Bibliografía Brock; Madigan, Michael; Martinko, John; y Parker, Jack. Biología de los Microorganismos. Décima Edición. Pearson. Madrid- España. 2004. Págs. 43-45, 203, 68, 153 157, 171 174. Guayaquil 27 de Octubre del 2010 Avers, Charlotte. Biología Celular. 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