1. BAKTERIJŲBAKTERIJŲ IR EUKARIOTŲIR EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOSGENŲ VEIKLOS REGULIACIJAREGULIACIJA 2. 6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA Genų veiklos reguliacija reiškia, kad, esant skirtingoms sąlygoms, genų ekspresijos intensyvumas gali skirtis Nereguliuojami genai vadinami esminiais (constitutive) Jų ekspresijos lygis iš esmės yra pastovus Dažniausiai esminiai genai koduoja baltymus, būtinus organizmui išgyventi Genų reguliacijos pranašumas yra tas, kad reguliuojamų genų koduojami baltymai gaminami tik tada, kada to reikia 6-2 3. 6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA Genų reguliacija yra svarbi tokiems ląstelėje vykstantiems procesams, kaip Metabolizmas Atsakas į aplinkos stresą Ląstelių dalijimasis Reguliacija gali vykti bet kuriame genų ekspresijos etape. Todėl bakterijose ji gali būti: Transkripcinė Transliacinė Potransliacinė 6-3 4. Dažniausiai genų ekspresija bakterijose reguliuojama transkripcijos lygmenyje RNR sintezės laipsnis gali būti padidintas arba sumažintas Transkripcinėje reguliacijoje dalyvauja dviejų pagrindinių tipų reguliaciniai baltymai Represoriai Jungiasi prie DNR ir nuslopina transkripciją Aktyvatoriai Jungiasi prie DNR ir skatina transkripciją Transkripcinė reguliacija, vykdoma represorių, vadinama neigiama kontrole Transkripcinė reguliacija, vykdoma aktyvatorių, vadinama teigiama kontrole 6.2. TRANSKRIPCINĖ REGULIACIJA 6-4 5. Mažos efektorių molekulės taip pat veikia transkripcinę reguliaciją Tačiau jos jungiasi prie reguliuojančių baltymų, o ne tiesiogiai prie DNR Kai kada mažos efektorių molekulės gali sustiprinti transkripciją Tokios molekulės vadinamos induktoriais Induktoriai veikia dviem būdais Prisijungia prie aktyvatorių ir paskatina juos jungtis prie DNR Prisijungia prie represorių ir neleidžia jiems jungtis prie DNR Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami indukuojamais Kitais atvejais mažos efektorių molekulės gali slopinti transkripciją Korepresoriai jungiasi prie represorių ir skatina juos jungtis prie DNR Inhibitoriai jungiasi prie aktyvatorių ir neleidžia jiems prisijungti prie DNR Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami represuojamais 6-5 6. 6-6 Reguliuojantys baltymai turi dvi prisijungimo vietas Vieną mažai efektoriaus molekulei Kitą - DNR b) Baltymas represorius, korepresoriaus molekulė, represuojamas genas a) Baltymas represorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas 7. 6-7 c) Baltymas aktyvatorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas d) Baltymas aktyvatorius, inhibitoriaus molekulė, represuojamas genas 8. Operonas yra reguliacinis genomo vienetas, sudarytas iš kelių struktūrinių genų, kontroliuojamų vieno promotoriaus Jis koduoja policistroninę mRNR, turinčią dviejų ar daugiau struktūrinių genų koduojančias sekas Jis leidžia bakterijai koordinuotai reguliuoti grupę genų, kurie koduoja baltymus, atliekančius panašias funkcijas Operoną sudaro keletas įvairių sričių Promotorius; operatorius; struktūriniai genai; terminatorius lac operonas 6-8 9. 6-9 lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai 1. Tikrasis lac operonas a. DNR elementai Promotorius Jungiasi RNR polimerazė Operatorius Jungiasi lac baltymas represorius CAP vieta Jungiasi katabolizmą aktyvinantis baltymas (CAP - Catabolite Activator Protein) b. Struktūriniai genai lacZ Koduoja β-galaktozidazę Fermentiškai skaido laktozę ir jos analogus Verčia laktozę į alolaktozę (izomerą) lacY Koduoja laktozės permeazę Membraninis baltymas, reikalingas laktozės transportui į ląstelę lacA Koduoja transacetilazę Kovalentiškai modifikuoja laktozę ir jos analogus Funkcinė paskirtis kol kas neaiški 10. 6-10 2. lacI genas Nėra lac operono sudedamoji dalis Turi savo promotorių (i promotorių) Vyksta palyginti neintensyvi, tačiau pastovi ekspresija Koduoja lac represorių lac represoriaus baltymas funkcionuoja kaip tetrameras lac operono represijai reikia labai nedidelio represoriaus baltymo kiekio Vienoje ląstelėje paprastai randama dešimt tetramerinių represoriaus baltymų lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai 11. 6-11 Laktozės permeazės ir β-galaktozidazės funkcijos bakterijų ląstelėse 12. lac operoną transkripciškai gali reguliuoti 1. Represoriaus baltymas 2. Aktyvatoriaus baltymas Pirmuoju atveju veikia indukuojamas neigiamos kontrolės mechanizmas Jame dalyvauja lac represoriaus baltymas Induktorius yra alolaktozė Ji prisijungia prie lac represoriaus ir jį inaktyvina lac operoną reguliuoja baltymas represorius 6-12 13. 6-13 Todėl nėra ir alolaktozės RNR pol negali pasiekti promotoriaus lac operonas represuotas a) Aplinkoje laktozės nėra Pastovi ekspresija lac represorius jungiasi prie operono ir inhibuoja transkripciją 14. 6-14 Represoriaus konformacija pakinta Kažkiek jos pavirsta į alolaktozę Jis daugiau nebegali jungtis prie operatoriaus lac operonas indukuotas b) Aplinkoje yra laktozės 15. 6-15 lac operono indukcijos ir represijos ciklas Represorius nepilnai inhibuoja transkripciją Todėl sintetinami labai maži fermentų kiekiai Į ląstelę patenka nedidelis kiekis laktozės, kurią β-galaktozidazė verčia į alolaktozę. Represorius atsikabina nuo operatoriaus Sintetinami lac operono baltymai. Tai skatina efektyvų laktozės metabolizmą Laktozės ištekliai išsenka. Alolaktozės kiekis sumažėja. Represoriaus baltymas jungiasi prie operatoriaus Dauguma baltymų, dalyvaujančių laktozės įsisavinime, degraduoja 16. Detalūs genetiniai ir kristalografiniai tyrimai parodė, kad lac represoriaus prisijungimas yra sudėtingesnis procesas, nei manyta anksčiau Iš viso buvo nustatytos trys operatoriaus vietos O1 Tuoj pat už promotoriaus O2 Pasroviui lacZ koduojančioje srityje O3 Šiek tiek prieš srovę CAP vietos atžvilgiu lac operonas turi tris operatoriaus vietas lac represoriui prisijungti 6-16 17. 6-17 Trijų lac operatoriaus vietų nustatymas Represijos laipsnis 1,300 kartų Taigi, transkripcijos lygis yra 1/1,300 palyginus su lygiu, kai terpėje yra laktozės Represijos nėra t.y.: pastovi ekspresija 18. Šie rezultatai patvirtina hipotezę, kad efektyvi represija vyksta tada, kai lac represorius jungiasi prie dviejų iš trijų operatorių Jis gali jungtis prie O1 ir O2 , arba prie O1 ir O3, tačiau ne prie O2 ir O3 Jei trūksta O2 arba O3, maksimali ekspresija nėra pasiekiama lac represoriaus prisijungimas prie dviejų operatoriaus vietų reikalauja DNR kilpos susiformavimo DNR kilpa suartina operatorių vietas Tai palengvina represoriaus baltymo prisijungimą 6-18 19. 6-19 Kiekvienas represoriaus dimeras jungiasi prie vieno operatoriaus Kiekvienas represoriaus dimeras jungiasi prie vieno operatoriaus DNR kilpų, kurias suformuoja prisijungdamas lac represorius, konfigūracija 20. lac operonas gali būti transkripciškai reguliuojamas ir kitu būdu, kuris vadinamas katabolitų represija Jei aplinkoje yra tiek laktozės, tiek ir gliukozės, E. coli pradžioje naudoja gliukozę, o katabolitų represija neleidžia naudoti laktozę. Kai gliukozės atsargos išsenka, katabolitų represija susilpnėja ir vyksta lac operono ekspresija lac operoną taip pat reguliuoja ir baltymas aktyvatorius 6-20 21. Pati gliukozė nėra ta maža efektoriaus molekulė, reguliuojanti lac operono veiklą katabolitų represijos būdu. Šiame genetinės reguliacijos būde dalyvauja maža molekulė, vadinama cikline AMP (cAMP) Ją iš ATP gamina fermentas adenililciklazė cAMP jungiasi prie baltymo aktyvatoriaus, vadinamo CAP (Catabolite Activator Protein) lac operoną taip pat reguliuoja ir baltymas aktyvatorius 6-21 22. cAMP-CAP kompleksas vykdo indukuojamą teigiamą genetinę kontrolę cAMP-CAP kompleksas jungiasi prie CAP vietos, esančios netoli lac promotoriaus, ir skatina transkripciją Esant gliukozės fermentas adenililciklazė inhibuojamas Tai sumažina cAMP kiekį ląstelėje Todėl cAMP nebeprisijungia prie CAP Transcripcijos intensyvumas krenta lac operoną taip pat reguliuoja ir baltymas aktyvatorius 6-22 23. 6-23 (b) Ląstelėje yra laktozės, bet ne cAMP a) Ląstelėje yra cAMP ir laktozės 24. 6-24 c) Ląstelėje yra cAMP, bet ne laktozės d) Ląstelėje nėra nei cAMP, nei laktozės 25. trp operonas dalyvauja aminorūgšties triptofano biosintezėje Genai trpE, trpD, trpC, trpB ir trpA koduoja fermentus, dalyvaujančius triptofano biosintezėje Genai trpR ir trpL dalyvauja reguliacijoje trpR Koduoja trp represoriaus baltymą Dalyvauja represijoje trpL Koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu” Dalyvauja procese, vadinamame ateniuacija trp operonas 6-25 26. 6-26 trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp represoriaus baltymui Negali prisijungti prie operatoriaus vietos RNR pol gali prisijungti prie promotoriaus a) Mažai triptofano, vyksta viso operono transkripcija 27. 6-27 trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp represoriaus baltymui b) Daug triptofano, vyksta operono represija 28. 6-28 trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp represoriaus baltymui Kitas reguliacijos mechanizmmas c) Daug triptofano, vyksta ateniuacija 29. Ateniuacija vyksta bakterijose dėl to, kad jose transkripcija ir transliacija gali vykti vienu metu Vykstant ateniuacijai transkripcija prasideda, tačiau ji nutrūksta dar nepasigaminus pilnai mRNR Tokiai terminacijai vykti yra svarbus DNR segmentas, vadinamas ateniuatoriumi (silpnintuvu) trp operone transkripcija sustoja netoli po trpL srities Toiu būdu ateniuacija sustabdo tolesnę triptofano biosintezę trp operono segmentas, esantis iš karto pasroviui nuo operatoriaus vietos yra esminis ateniuacijai vykti Pirmasis trp operono genas yra trpL Jis koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu” 6-29 30. 6-30 trpL mRNR seka, gaunama ateniuacijos metu Dėka šių dviejų kodonų yra nustatoma, ar yra pakankamai triptofano transliacijai vykti Paskui 3-4 kilpą seka U seka 2-a sritis yra komplementari 1-ai ir 3-iai sritims 3-ia sritis yra komplementari 2-ai ir 4-ai sritims Todėl gali susidaryti keletas “smeigtuko galvučių” Ji veikia kaip vidinis (nuo ρ nepriklausomas) terminatorius 31. “Smeigtuko galvutės” formavimasis tarp 3-4 sričių priverčia RNR pol pabaigti transkripciją trpL geno pabaigoje 3-4 “smeigtuko galvutės” susidarymas priklauso nuo trpL mRNR transliacijos Galimi trys variantai 1. Transliacijos nėra 2. Ląstelėje triptofano mažai 3. Ląstelėje triptofano daug 6-31 32. 6-32 “Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai nuo transliacijos sąlygų Nevyksta vienalaikė transliacija ir transkripcija Gaunama stabiliausia mRNR forma Transkripcija sustoja iš karto už trpL geno a) Transliacijos nėra 33. 6-33 “Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai nuo transliacijos sąlygų Nepakankamas tRNRtrp kiekis 1-a sritis blokuojama Struktūra tarp 3-4 sričių nesusidaro RNR pol transkribuoja likusią operono dalį b) Ląstelėje triptofano mažai, susidaro struktūra tarp 2-3 sričių 34. 6-34 “Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai nuo transliacijos sąlygų Pakankamas tRNRtrp kiekis trpL mRNR transliacija vyksta iki stop kodono 2-oji sritis negali sudaryti bazių porų su jokia kita sritimi Susiformuoja “smeigtuko galvutė “ tarp 3-4 sričių Transkripcija sustoja RNR polimerazė sustoja c) Ląstelėje triptofano daug, susidaro struktūra tarp 3-4 sričių 35. Daugelio operonų tyrimai išryškino bendrąsias indukcinės ir represinės reguliacijos ypatybes Operonai, dalyvaujantys katabolizme (t.y., medžiagų skaidyme), dažniausiai yra indukuojami Medžiaga, kuri turi būti skaidoma (arba susiję junginiai), yra induktoriai Operonai, dalyvaujantys anabolizme (t.y., medžiagų biosintezėje) dažniausiai yra represuojami Inhibitorius arba korepresorius yra maža molekulė, kuri yra operono produktas Indukcinė ir represinė reguliacija 6-35 36. Bakterijų genų reguliacija dažniausiai vyksta transkripcijos lygmenyje Tačiau taip pat yra nemažai pavyzdžių tokios reguliacijos, kuri vyksta vėlesnėse genų ekspresijos stadijose Pavyzdžiui, genų ekspresijos reguliacija taip pat gali būti: transliacinė potransliacinė 6.3. TRANSLIACINĖ IR POTRANSLIACINĖ REGULIACIJA 6-36 37. Kai kurių bakterinių genų mRNR transliacija yra reguliuojama prisijungiant baltymams Transliaciniai reguliaciniai baltymai atpažįsta sekas, esančias mRNR Daugeliu atveju tokie baltymai inhibuoja transliaciją Jie vadinami transliaciniais represoriais Transliacinė reguliacija 6-37 38. Transliaciniai represoriai inhibuoja transliaciją vienu iš dviejų būdų: 1. Prisijungdami šalia Shine-Dalgarno sekos ir/ar starto kodono Tai steriškai trukdo ribosomoms inicijuoti transliaciją 2. Prisitvirtindami už Shine-Dalgarno sekos/starto kodono ribų Jie stabilizuoja antrinę mRNR struktūrą taip, kad nevyktų iniciacija Transliacinė represija taip pat aptinkama eukariotuose Transliacinė reguliacija 6-38 39. Antrasis transliacinės reguliacijos būdas yra antiprasminės (antisense) RNR sintezė Tai yra RNR grandinė, kuri komplementari mRNR Tokiu būdu yra reguliuojamas E.coli genas, atsakingas už osmoreguliaciją - sugebėjimą kontroliuoti vandens kiekį ląstelėje E. coli baltymas ompF yra svarbus osmoreguliacijai Jį koduoja ompF genas (outer membrane protein F) OmpF baltymas yra sintetinamas esant žemam osmoziniam slėgiui Esant aukštam osmoziniam slėgiui jo sintezė sumažėja Transliacinė reguliacija 6-39 40. 6-40 Už ompF geno inhibiciją esant aukštam osmoziniam slėgiui yra atsakingas kitas genas, vadinamas micF micF RNR nekoduoja baltymo Tačiau ji yra komplementari geno ompF mRNR Todėl ji vadinama antiprasmine RNR Jos transliacija blokuojama 41. Įprastas metabolizmo fermentų aktyvumo reguliacijos būdas yra grįžtamojo ryšio (feedback) inhibicija Galutinis metabolizmo kelio produktas gali inhibuoti fermentą, veikiantį ankstyvosiose kelio stadijose Potransliacinė reguliacija 6-41 42. 6-42 Jei 3-io produkto koncentracija pasidaro didelė, jis jungiasi prie 1-o fermento, taip inhibuodamas jo gebėjimą paversti 1-ą substratą 1-u produktu Fermentas 1 yra alosterinis fermentas, turintis dvi skirtingas prisijungimo vietas Katalitinę vietą jungiasi substratas Reguliacinę vietą jungiasi galutinis produktas 43. Kita baltymų funkcijos kontrolės strategija yra jų struktūros kovalentinė modifikacija Kai kurios modifikacijos yra negrįžtamos Proteolitinis perdirbimas Prostetinių grupių, karbohidratų ar lipidų prijungimas Kitos modifikacijos yra grįžtamos ir baltymų funkciją paveikia laikinai Fosforilinimas (–PO4) Acetilinimas (–COCH3) Metilinimas (–CH3) Potransliacinė reguliacija 6-43 44. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA Eukariotų organizmai gauna daug naudos iš genų veiklos reguliavimo Pavyzdžiui: Jie gali reaguoti į maisto prieinamumo pokyčius Jie gali reaguoti į aplinkos stresus Augalų ir gyvūnų daugialąstiškumas ir sudėtingesnė ląstelės struktūra taip pat reikalauja ir žymiai didesnės ir įvairesnės genų ekspresijos 6-44 45. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA Genų reguliacija būtina užtikrinant: 1. Taisyklingą genų ekspresiją įvairių vystymosi stadijų metu Kai kurių genų ekspresija vyksta tik embrione, tuo tarpu kitų – tik suaugusiame organizme 2. Skirtumus tarp skirtingų ląstelių tipų Nervų ir raumenų ląstelės atrodo tokios skirtingos tik dėl to, kad skiriasi jų genų reguliacija (o ne DNR sekos) 6-45 46. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS REGULIACIJOS APŽVALGA Eukariotų genų ekspresija reguliuojama šiuose lygmenyse: Transkripcijos Reguliaciniai transkripcijos veiksniai gali indukuoti arba inhibuoti transkripciją Chromatino kompaktizacijos laipsnis veikia transkripciją DNR metilinimas (dažniausiai) inhibuoja transkripciją RNR brendimo Alternatyvus splaisingas keičia egzonų pasirinkimą RNR redagavimas pakeičia bazių sekas mRNR Transliacijos Iniciacijos faktorių veikla gali būti modifikuojama fosforilinant Transliaciją gali reguliuoti baltymai, prisijungiantys prie mRNR 5’ galo mRNR stabilumas gali keistis dėl prisijungiančių baltymų Potransliaciniame Baltymų funkcija gali būti modifikuojama grįžtamojo ryšio inhibicijos būdu bei kovalentinės modifikacijos būdais 6-46 47. Transkripcijos faktoriai yra baltymai, veikiantys RNR polimerazės sugebėjimą transkribuoti tam tikrą geną Skiriami dviejų pagrindinių tipų transkripcijos faktoriai Bendrieji transkripcijos faktoriai Reikalingi RNR pol prisijungti prie pagrindinio promotoriaus ir perėjimui prie elongacijos Būtini bazinei transkripcijai Reguliaciniai transkripcijos faktoriai Reguliuoja šalia esančių genų transkripciją Daro įtaką RNR pol sugebėjimui pradėti tam tikro geno transkripciją 6.5. REGULIACINIAI TRANSKRIPCIJOS FAKTORIAI 6-47 48. Reguliaciniai transkripcijos faktoriai atpažįsta reguliacinius cis elementus, išsidėsčiusius šalia pagrindinio promotoriaus Šios sekos vadinamos atsako, kontrolės arba reguliaciniais elementais Susijusio geno transkripciją veikia baltymai (reguliaciniai transkripcijos faktoriai), prisijungiantys prie šių elementų Reguliaciniai baltymai, skatinantys transkripciją, vadinami aktyvatoriais Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama enhanseriu (stiprintuvu) Reguliaciniai baltymai, slopinantys transkripciją, vadinami represoriais Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama sailenseriu (duslintuvu) 6-48 49. 6-49 a) Genų aktyvacija b) Genų represija 50. Transkripcijos faktorių baltymai turi regionus, vadinamus domenais, atliekančius specifines funkcijas Vienas domenas gali būti jungimosi su DNR vieta Kitas domenas gali būti jungimosi su efektoriaus molekulėmis vieta Motyvas yra domenas ar jo dalis, kurio(s) struktūra yra labai panaši daugelyje skirtingų baltymų Reguliacinių transkripcijos faktorių struktūrinės ypatybės 6-50 51. 6-51 Atpažinimo spiralės atpažįsta ir sudaro kontaktus su bazių sekomis palei DNR didįjį griovelį Vienas iš transkripcijos faktorių prisijungimo prie DNR būdų yra vandenilinių jungčių sudarymas tarp α spiralės ir DNR bazių Spiralės-posūkio-spiralės elix-turn-helix) motyvas b) Spiralės-kilpos-spiralės (helix-loop-helix) motyvas Spiralės-kilpos-spiralės motyvai gali dalyvauti baltymų dimerizacijoje Homodimerus suformuoja du identiški transkripcijos faktoriai; Heterodimerus suformuoja du skirtingi transkripcijos faktoriai 52. 6-52 Sudarytas iš vienos α spiralės ir dviejų β klosčių, palaikomų kartu cinko metalo jonų (Zn++) Dvi α spiralės, susipynusios dėl leucino motyvų Besikaitaliojančios leucino liekanos abiejuose baltymuose sąveikauja, dėl ko vyksta baltymo dimerizacija c) Cinko “pirštelių” (zinc fingers) motyvas d) Leucino “užtrauktuko” (leucine zipper) motyvas 53. Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie enhanserio padidina transkripcijos laipsnį (nuo 10 iki 1000 kartų) Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie sailenserio sumažina transkripcijos laipsnį Daugelis reguliacinių elementų yra nepriklausomi nuo orientacijos arba dvikrypčiai Jie gali funkcionuoti tiek pirmyn, tiek ir atgal Dauguma reguliacinių elementų yra išsidėstę kelių šimtų nukleotidų atstumu “prieš srovę” nuo promotoriaus Tačiau kai kurie randami ir kitur Už keleto tūkstančių nukleotidų Pasroviui nuo promotoriaus Netgi intronuose! Enhanseriai ir sailenseriai 6-53 54. Dauguma reguliacinių transkripcijos faktorių tiesiogiai nesijungia su RNR polimeraze Reguliacinių transkripcijos faktorių poveikį RNR polimerazei perduoda du ląstelėje dažnai aptinkami baltymų kompleksai 1. TFIID 2. Mediatorius TFIID ir mediatorius 6-54 55. 6-55 Bendrasis transkripcijos faktorius, kuris jungiasi prie TATA dėžutės Pritraukia RNR polimerazę prie promotoriaus Transkripcijos aktyvatorius pritraukia TFIID prie promotoriaus ir/ar aktyvina jo funkciją Taigi, vyksta transkripcijos aktyvacija Transkripcijos represorius inhibuoja TFIID prisijungimą prie promotoriaus arba slopina jo funkciją Vyksta transkripcijos represija a) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir TFIID 56. 6-56 Transkripcijos aktyvatorius stimuliuoja mediatoriaus funkciją Šis leidžia RNR pol suformuoti preiniciacijos kompleksą Po to prasideda transkripcijos elongacijos fazė Transkripcijos represorius slopina mediatoriaus funkciją Transkripcija stabdoma STOP b) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir mediatorius 57. Reguliacinių transkripcijos faktorių funkcijai gali turėti įtakos: 1. Efektoriaus molekulės prisijungimas 2. Baltymų tarpusavio sąveika 3. Kovalentinė modifikacija Kaip reguliuojami reguliaciniai transkripcijos faktoriai? 6-57 58. 6-58 Transkripcijos faktorius dabar gali prisijungti prie DNR Homodimerų ir heterodimerų formavimasis a) Efektoriaus molekulės (pvz., hormono) prisijungimas b) Baltymų tarpusavio sąveika c) Potransliacinė modifikacija, pvz., fosforilinimas 59. Chromatino struktūros pokyčiai atsiranda dėl DNR struktūros pokyčių ir/ar dėl chromatino kompaktiškumo pokyčių Tokie pokyčiai gali būti 1. Genų amplifikacija 2. Genų pertvarkymai 3. DNR metilinimas 4. Chromatino glaudinimas 6.6. CHROMATINO STRUKTŪROS POKYČIAI 6-59 Retai taikomi genų ekspresijos reguliavimo būdai Įprastiniai genų ekspresijos reguliavimo būdai 60. Genų amplifikacija yra retai naudojamas genų veiklos reguliavimo mechanizmas Dėl amplifikacijos labai padaugėja tam tikrų genų kopijų rRNR genų amplifikacija Xenopus laevis ovocituose Kai kurių genų amplifikacija vėžinėse ląstelėse Susiformuoja žiedinės molekulės, sudarančios smulkias acentromerines chromosomas, vadinamas mažosiomis taškinėmis chromosomomis (double minutes; dmin) 6-60 Genų pertvarkymai stebimi tam tikrais specifiniais atvejais Pavyzdžiui, vyksta imunoglobulinų genų pertvarkymai, užtikrinantys skirtingų antikūnų baltymų kodavimą. 61. Erdvinė chromatino struktūra yra svarbus genų ekspresijos reguliavimo mechanizmas Chromatinas yra labai dinamiška struktūra, kurios konformacija keičiasi ir įgyja vieną iš dviejų galimų būvių Uždara konformacija Chromatinas labai kompaktiškas Transkripcija labai apsunkinta arba iš viso neįmanoma Atvira konformacija Chromatinas stipriai dekondensuotas Gali vykti transkripcija Chromatino struktūra 6-61 62. Chromatino supakavimo laipsnio kitimai eukariotų chromosomose vyksta interfazėje Vykstant genų aktyvacijai uždaras chromatinas turi virsti atviru chromatinu Tik tada gali vykti transkripcija 6-62 Pavyzdys gali būti varliagyvių ovocitų chromosomos Chromosoma nesuformuoja 30 nm siūlo Vietoje to susidaro daug dekondensuotų radialinių kilpų Tai yra tos DNR sritys, kurių genai aktyviai transkribuojami Šios chromosomos pavadintos lempų šepečiais (lampbrush chromosomes) Jos primena šepetėlius, kadaise naudotus žibalinėms lempoms valyti nuo suodžių 63. Globino genų ekspresija vyksta retikuliocituose Tačiau individualių šios genų šeimos narių ekspresija vyksta skirtingomis vystymosi stadijomis Pavyzdžiui: β-globinas Suaugusiame organizme γ-globinas Vaisiuje Kai kurie žmogaus globino genai yra išsidėstę 11-oje chromosomoje šalia vienas kito Globino genų ekspresija 6-63 64. Talasemija yra vieno ar daugiau globino genų ekspresijos defektas Įdomu, kad kai kurių talasemija sergančių pacientų organizmai nesugeba sintetinti β globino, nors ir turi normalų jo geną 6-64 Šio tipo talasemija atsiranda dėl DNR delecijos, įvykusios prieš srovę nuo β globino geno β globino genas yra sveikas Tačiau jis yra išjungtas DNR segmentų delecijos, randamos skirtingose žmonių populiacijose 65. 6-65 Prieš srovę nuo β globino geno buvo nustatyta DNR sritis, būtina globino geno ekspresijai Ši sritis pavadinta lokuso kontrolės regionu (locus control region - LCR) Ji padeda reguliuoti chromatino konformaciją Jos trūksta kai kurių pacientų, sergančių talasemija, DNR Dabar genus gali pasiekti RNR pol ir transkripcijos faktoriai 66. Šalia chromatino supakavimo laipsnio, kita chromatino struktūrinė ypatybė, turinti įtakos genų veiklai, yra nukleosomų padėtis Chromatine nukleosomos dažniausiai yra išsidėstę ant DNR maždaug vienodais intervalais Tačiau nukleosomų padėtis chromatine gali keistis, kai vyksta geno ekspresija Jų padėtis nesikeičia genuose, kurie neaktyvūs, pvz., esantys kituose audiniuose Globino genų ekspresija 6-66 67. 6-67 Nukleosomos padėties pokyčiai aktyvuojantis β globino genui Išsidėstę reguliariais intervalais nuo -3000 iki + 1,500 Išsidėstymo reguliarumo sutrikimas intervale nuo -500 iki + 200 a) Nukleosomų išsidėstymas fibroblastų β globino gene, kurio ekspresija nevyksta b) Nukleosomų išsidėstymas retikuliocitų β globino gene, kurio ekspresija yra intensyvi 68. Chromatino struktūra yra keičiama dviem įprastiniais būdais 1. Histonų kovalentinė modifikacija 2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros pertvarkymas Chromatino struktūros pertvarkymas (remodeling) 6-68 69. 1. Kovalentinė histonų modifikacija Histonų polipeptidų galai yra modifikuojami įvairiais būdais Tai gali būti acetilinimas; fosforilinimas; metilinimas 6-69 Prikabina acetilo grupes; taip susilpninamos histonų ir DNR sąveikos Pašalina acetilo grupes; sąveikos atsistato a) Histonų acetilinimas 70. 6-70 SWI/SNF šeimos baltymai Akronimai nurodo, kokie pokyčiai stebimi mielėse, jei fermentai neveiklūs SWI mutantai nesugeba atlikti poravimosi tipo perjungimo (switching) SNF mutantai nefermentuoja sacharozės (sucrose non- fermenters) Šie pokyčiai gali žymiai paveikti genų ekspresijąb) Chromatino struktūros pertvarkymas 2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros pertvarkymas ATP energija yra naudojama nukleosomų struktūrai pakeisti. Tada DNR lengviau gali pasiekti transkripcijos baltymai 71. Svarbi tranckripcijos aktyvatorių funkcija yra pritraukti anksčiau paminėtus baltymus prie promotoriaus Gerai ištyrinėtas pavyzdys yra mielių genas, dalyvaujantis poravimosi procese Mielės gali būti a ir α poravimosi tipo Persijungimą iš vieno tipo į kitą koduoja genas HO Chromatino struktūros pertvarkymas (remodeling) 6-71 72. 6-72 SWI pavadinimas kilęs nuo “switching” SAGA yra akronimas nuo Spt/Ada/GCN5/Acetyltransferase Histonų acetiltransferazė gali transkripciškai reguliuoti genų veiklą 73. 6-73 SBP yra akronimas nuo “mating type switching cell cycle box protein” RNR polimerazė Atvira konformacija leidžia prisijungti prie enhanserio antram transkripcijos aktyvatoriui (SBP) Šis antrasis transkripcijos aktyvatorius pritraukia RNR polimerazę ir bendruosius transkripcijos faktorius prie promotoriaus. Tai inicijuoja transkripciją 74. DNR metilinimas yra chromatino struktūros pokytis, nutildantis genų ekspresiją Jis būdingas daugeliui, tačiau ne visoms eukariotų rūšims Mielių ir drozofilos DNR yra mažai metilinta Stuburinių ir augalų DNR yra ženkliai metilinta Žinduolių DNR yra metilinta ~ 2 iki 7% DNR metilinimas 6-74 75. 6-75 (arba DNR metilazė) CH3 CH3 CH3 Tik viena grandinė metilinta Abidvi grandinės metilintos a) Citozino metilinimas b) Nemetilinta c) Hemimetilinta d) Pilnai metilinta 76. DNR metilinimas paprastai inhibuoja eukariotų genų transkripciją Ypač, jei metilinimas vyksta promotoriaus srityje Daugelis stuburinių ir augalų genų šalia savo promotorių turi CpG sąleles Šių CpG sąlelių ilgis yra 1,000 - 2,000 nukleotidų Namų ruošos (housekeeping) genų CpG sąlelės yra nemetilintos Šių genų ekspresija vyksta daugelio audinių ląstelėse Specifinių audinių genų ekspresija gali būti nutildyta metilinant CpG sąleles 6-76 77. 6-77 Transkripcinis nutildymas metilinant DNR Transkripcijos aktyvatoriai jungiasi prie nemetilintos DNR Tai inhibuoja transkripcijos iniciaciją a) Metilinimas inhibuoja transkripcijos aktyvatorių prisijungimą Metilinimas Metilo grupės blokuoja transkripcijos aktyvatoriaus prisijungimą prie enhanserio 78. 6-78 Transkripcinis nutildymas metilinant DNR b) metil-CpG surišantis baltymas pritraukia kitus baltymus, kurie kompaktizuoja chromatiną Metil-cpG surišantis baltymas prisitvirtina prie metilintos CpG sąlelės Metil-CpG surišantis baltymas pritraukia kitus baltymus, tokius kaip histonų deacetilazė, kurie pertvarko chromatiną į uždarą konformaciją 79. Metilintos DNR sekos yra paveldimos ląstelėms dalijantis Po replikacijos tik viena DNR grandinė yra metilinta (hemimetilinta DNR). Tai inicijuoja kitos DNR grandinės metilinimą DNR metilinimas yra paveldimas 6-79 80. CH3 CH3 CH3 CH3 Hemimetilinta DNR DNR metilazė verčia hemimetilintą DNR į pilnai metilintą Tai labai veiksmingas, tačiau ir įprastas įvykis, vykstantis žinduolių ir augalų ląstelėse CH3 CH3CH3 CH3 Einamasis metilinimas 6-80 DNR replikacija Metilinimas de novo Retas labai reguliuojamas įvykis 81. 6-81 DNR metilinimas gali veikti ne tik pavienių genų, tačiau ir visų chromosomų transkripciją Metilinant DNR yra inaktyvinama žinduolių viena X chromosoma X chromosomos inaktyvinimas vyksta atsitiktinai. Todėl jei X chromosomoje esantis genas yra heterozigotinėje būsenoje ir koduoja morfologinį požymį, tokios atsitiktinės inaktyvacijos pasekmės yra matomos fenotipiškai Pavyzdys yra kačių kailio spalva Calico Tortoiseshell 82. Eukariotų organizmuose gana įprasta genų ekspresiją reguliuoti ir RNR lygmenyje Galimi įvairūs tokios reguliacijos būdai Alternatyvus splaisingas RNR redagavimas RNR stabilumo keitimas RNR interferencija 6.7. RNR BRENDIMO IR TRANSLIACIJOS REGULIACIJA 6-82 83. Introninei eukariotų genų struktūrai labai svarbų biologinį pranašumą suteikia reiškinys, vadinamas alternatyviu splaisingu Alternatyvus splaisingas reiškia, kad pre-mRNR splaisingas gali vykti daugiau negu vienu būdu Daugeliu atveju tai sukuria dvi alternatyvias versijas baltymo, turinčio panašią funkciją Taip yra dėl to, kad daugelis jų aminorūgščių sekų yra identiškoas Tačiau susidarančio sekų skirtumo pakanka, kad kiekvienas baltymas pasižymmėtų tik jam būdingomis savybėmis Alternatyvus splaisingas 6-83 84. Splaisingo ir alternatyvaus splaisingo laipsnis labai nevienodas skirtingų rūšių organizmuose Kepimo mielės turi maždaug 6,000 genų ~ 300 (t.y., 5%) koduoja mRNR, kurių splaisingas vyksta Tik keletui iš šių 300 genų būdingas alternatyvus splaisingas Žmogus turi ~ 35,000 genų Daugumos šių genų mRNR būdingas splaisingas Manoma, kad ne mažiau kaip vienas trečdaliui būdingas alternatyvus spaisingas Pastaba: Kai kurių mRNR alternatyvus splaisingas vyksta taip, kad yra pagaminama dešimtys ar net šimtai skirtingų mRNR Alternatyvus splaisingas 6-84 85. Alternatyvus splaisingas nėra atsitiktinis reiškinys Specifiniai splaisingo būdai ląstelėje yra reguliuojami Šioje reguliacijoje dalyvauja baltymai, vadinami splaisingo faktoriais Jie svarbūs pasirenkant splaisingo vietas Vienas iš splaisingo faktorių pavyzdžių yra SR baltymai Jų terminaliniame C gale yra domenas, turintis daug serino (S) ir arginino (R) Šie baltymai dalyvauja baltymų tarpusavio atpažinimo procesuose Jų terminaliniame N gale yra prisijungimo prie RNR domenas Alternatyvus splaisingas 6-85 86. Splaisosoma atpažįsta 5’ ir 3’ splaisingo vietas ir pašalina įsiterpusį introną Splaisingo faktoriai moduliuoja splaisosomos sugebėjima atpažinti ir pasirinkti splaisingo vietas Tai gali vykti dviem būdais 1. Kai kurie splaisingo faktoriai inhibuoja splaisosomos sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo represoriai) 2. Kai kurie splaisingo faktoriai sustiprina splaisosomos sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo enhanseriai) 6-86 Alternatyvus splaisingas 87. 6-87 Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui a) Splaisingo represoriai 88. 6-88 Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui b) Splaisingo enhanseriai 89. RNR redagavimas reiškia nukleotidų sekos pakeitimą RNR molekulėje Gali būti tam tikrų bazių pašalinimas arba įterpimas į seką Arba vienos bazės virtimas (konversija) kita RNR redagavimo pasekmės mRNR yra įvairios Starto arba stop kodonų sukūrimas Koduojančios sekos pasikeitimas RNR redagavimas 6-89 90. RNR redagavimas pirmiausia buvo aptiktas tripanosomose Šiame procese dalyvauja RNA gidas (guide) RNR gidas gali nurodyti vieno ar daugiau uracilų įterpimą ar pašalinimą iš RNR RNR redagavimas 6-90 91. 6-91 3’ galai turi uracilų seką Pirmiausia, 5’ inkaras jungiasi su redaguojama RNR Kerpa redaguojamą RNR tam tikroje vietoje 5’ galas (inkaras) yra komplementarus redaguojamai mRNR RNR gido 3’ galas patraukiamas nuo redaguojamos RNR Įterpia uracilus Pašalina uracilus Sujungia dvi RNR dalis 92. Labiau paplitęs RNR redagavimo mechanizmas yra vienos bazės vertimas kita Dažniausiai tai daroma deamininant bazę 6-92 Transliacijos metu atpažįstamas kaip guaninas 93. RNR redagavimo pavyzdžiai Organizmas Redagavimo tipas Aptinkamas Tripanosomos Uracilo nukleotidų įterpimas, retkarčiais - pašalinimas Daugelyje mitochondrijų mRNR Sausumos augalai C konversija į U Daugelyje mitochondrijų ir chloroplastų mRNR, tRNR ir rRNR Gleivūnai C įterpimas Daugelyje mitochondrijų mRNR Žinduoliai C konversija į U Apolipoproteino B mRNR A konversija į I Glutamato receptoriaus mRNR, daugelyje tRNR Drozofila A konversija į I Kalcio ir natrio kanalų baltymų mRNR 6-93 94. Eukariotų mRNR stabilumas yra labai įvairus Gali būti nuo kelių minučių iki keleto dienų mRNR stabilumas gali būti reguliuojamas taip, kad jos gyvenimo pusamžis sutrumpėtų arba pailgėtų Tai stipriai veikia mRNR koncentraciją ląstelėje Kaip pasekmė, kinta gaminamo baltymo kiekis (geno ekspreijos laipsnis) mRNR stabilumą veikia šie veiksniai 1. poliA uodegos ilgis 2. Destabilizuojantys elementai mRNR stabilumas 6-94 95. 1. poliA uodegos ilgis Dauguma naujai sintetintų mRNR turi maždaug 200 nukleotidų ilgio poliA uodegą Ją atpažįsta su poliA susirišantis baltymas (polyA binding protein), Kuris susiriša su poliA uodega ir padidina stabilumą Senstant mRNR jos poliA uodega trumpėja dėl ląstelėje esančių nukleazių veiklos Su poliA susirišantis baltymas daugiau negali susirišti, jei poliA uodega trumpesnė nei 10-30 adenozinų Tokia mRNR grandinė suskaidoma egzo- ir endonukleazių 6-95 96. 2. Destabilizuojantys elementai Randami trumpai gyvenančiose mRNR Šie elementai gali būti randami bet kurioje mRNR vietoje Tačiau labiausiai įprasta jų buvimo vieta - 3’ gale tarp stop kodono ir poliA uodegos 6-96 3’-untranslated region5’-untranslated region AU-rich element Atpažįsta ir psisijungia ląstelės baltymai Šie baltymai veikia mRNR degradaciją 97. Dvigrandininė RNR gali nutildyti tam tikrų genų ekspresiją Šis atradimas buvo padarytas tiriant augalus ir nematodę Caenorhabditis elegans Naudojant klonavimo metodus į augalų genomą galima įterpti klonuotus genus Kai yra įterpiama daug klonuoto geno kopijų, geno ekspresija gana dažnai yra nutildoma Tai gali vykti dėl dvigrandininės RNR formavimosi Dvigrandininė RNR ir genų nutildymas (silencing) 6-97 98. 6-98 Genų insercijos, galinčios sukelti dvigrandininės RNR susidarymą Transkripcija vyksta nuo abiejų promotorių Todėl transkribuojama tiek prasminė, tiek koduojanti matricinė grandinės Dėl to susidaro komplementarios RNR, formuojančios dvigrandininę struktūrą Šis įvykis nutildo klonuoto geno ekspresiją 99. Įrodymai, kad mRNR degraduoja dėl dvigrandininės grandinės susidarymo, buvo gauti tiriant C. elegans Antiprasminės RNR injekcija į ovocitus nutildo geno ekspresiją Netikėtai pasirodė, kad dvigrandininės RNR injekcija tai daro 10 kartų efektyviau Šis reiškinys buvo pavadintas RNR interferencija (RNAi) Dvigrandininė RNR ir genų nutildymas (silencing) 6-99 100. 6-100 Ląstelėje esanti mRNR yra sukarpoma endonukleazių, esančių komplekse Trumpa RNR iš antiprasminės grandinės Geno, koduojančio šią mRNR, ekspresija nutildoma 101. RNR interferencija yra plačiai aptinkama eukariotuose Manoma, kad RNRi 1. Yra kovos su kai kuriais virusais būdas Ypač su turinčiais dvigrandininės RNR genomą 2. Svarbi nutildant kai kuriuos transpozabilius elementus Kai kurie šių elementų gamina dvigrandininę RNR kaip tarpinį transpozicijos proceso produktą Dvigrandininė RNR ir genų nutildymas (silencing) 6-101 102. Ląstelės fundamentiniai procesai dažnai reguliuojami moduliuojant transliacijos iniciacijos faktorius Esant tam tikroms sąlygoms ląstelei yra naudinga sustabdyti baltymų sintezę Virusinių infekcijų atveju Tada virusas negali gaminti virusinių baltymų Badaujant Ląstelė taupo resursus Iniciacijos faktoriai ir transliacijos laipsnis 6-103 103. Nustatyta, kad eukariotų transliaciją veikia iniciacijos faktorių fosforilinimas Pagrindiniai iniciacijos faktoriai, kontroliuojantys transliacijos iniciaciją yra eIF2 ir eIF4F Šių dviejų faktorių fosforilinimas duoda priešingus rezultatus eIF2α fosforilinimas transliaciją slopina eIF4F fosforilinimas transliaciją skatina 6-104 104. 6-105 Reikalingas skatinti iniciacijos tRNAmet jungimąsi prie 40S subvieneto 105. eIF4F naudoja kitą transliacijos reguliavimo kelią Jis reguliuoja mRNR prisijungimą prie ribosominio iniciacijos komplekso Fosforilinimas eIF4F aktyvina Fosforilinimą stimuliuoja signalinės molekulės, skatinančios ląstelių proliferaciją Pavyzdžiui, augimo faktoriai ir insulinas Fosforilinimą mažina šiluminis šokas ir virusinės infekcijos 6-106