Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

Eq.5 Se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalización. El primer paso consiste en crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria y lograr así su lisis y consecuente liberación del material genético. ` Las bacterias son puestas en contacto con la solución I de alta concentración de sales, glucosa y EDTA (ácido etilendiamino tetracético). Este último es un agente quelante de calcio (el calcio es un ión estabilizador de las membranas bacterianas). ` Posteriormente se agrega una solución (solución II) con una alta concentración de SDS e hidróxido de sodio: en condiciones alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin embargo, el ADN cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza más rápidamente que el ADN de plásmido . ` ` Cuando a esta solución se le agrega acetato de potasio (solución III), el ADN desnaturalizado (cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual precipita, mientras que el ADN del plásmido se mantiene en solución. La separación de la fracción soluble de la insoluble se logra mediante centrifugación. Finalmente, el ADN del plásmido es concentrado por precipitación con etanol. ` Debido a que este procedimiento no garantiza una alta pureza, es posible que la muestra final contenga trazas de ADNasas bacterianas que se acarrean durante el proceso de extracción. Para evitar la degradación de las moléculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar de forma rápida y con soluciones a baja temperatura. Eq.5