EL FROTIS SANGUÍNEO Y SU UTILIDAD EN LA CLÍNICA EN PEQUEÑAS ESPECIES MVZ EPCV M en C Luis Enrique García Ortuño Introducción El hemograma es una de las pruebas más frecuentemente utilizadas en la práctica clínica diaria, debido a que es una herramienta diagnóstica que nos proporciona bastante información principalmente relacionada con la respuesta del sistema hematopoyético a diferentes estímulos fisiológicos o patológicos. A través del hemograma se puede evaluar la línea roja (eritrocitos, hematocrito y hemoglobina) para determinar alteraciones como anemia y eritrocitosis, de igual forma podemos evaluar hemostasia primaria realizando el conteo total de plaquetas cuyas alteraciones corresponden a trombocitopenia y trombocitosis y la línea blanca en donde se realiza un conteo total y diferencial de los leucocitos. Una de las partes fundamentales y necesarias dentro de la elaboración del hemograma es la evaluación del frotis sanguíneo, con el cual se corroboran o confirman algunos de los datos que proporciona un analizador automatizado o conteos manuales, y se obtiene información adicional, que resulta necesaria para interpretar los resultados. El objetivo del siguiente trabajo es dar a conocer la gran utilidad que representa una simple evaluación del frotis sanguíneo, inclusive sin tener el resto de los valores del hemograma. Confección del frotis sanguíneo Es indispensable una correcta confección del frotis, ya que de esta forma se facilita en gran medida su observación y evaluación puesto que las células se encontrarán homogéneamente distribuidas. Para la confección del frotis sanguíneo se requiere únicamente un par de laminillas, un capilar y la sangre con anticoagulante EDTA y se realiza de las siguiente forma: 1) se coloca una laminilla horizontalmente sobre la mesa de trabajo la cual va a ser en donde se extiende la sangre 2) Se toma sangre con el capilar y se coloca una gota en el extremo de la laminilla colocada anteriormente, 3) una segunda laminilla que se utilizará para extender la sangre se posiciona perpendicular a la primera formando un ángulo aproximado de 35 grados y justo por enfrente de la gota de sangre, 4) para iniciar a hacer el extendido se hace hacia atrás la segunda laminilla hasta hacer contacto con la gota de sangre (la cual por capilaridad se distribuirá en la base de la laminilla) y posteriormente se extiende hacia el extremo opuesto de la primera laminilla. Consejos: 1) es importante que las laminillas estén perfectamente limpias, 2) la laminilla con la que se va a hacer el extendido debe tener los extremos esmerilados y lo más lisos posible, de no ser así se deberá cambiar de laminilla ya que de otro modo será imposible obtener un adecuado frotis, 3) toda la gota de sangre debe quedar dentro de la laminilla ya que la parte final del frotis (llamada cola) debe también ser evaluada y debe quedar lo menos rayada posible, 4) si se reduce el ángulo de la laminilla colocada perpendicularmente obtendremos frotis más delgados, si el ángulo se aumenta los frotis serán más gruesos y 5) no olvidar marcar cada uno de los frotis con la identificación del paciente. Tinción del frotis sanguíneo Básicamente son dos tipos de tinciones hematológicas que se utilizan para teñir los frotis sanguíneos: Diff-Quik y Wright. Tinción de Diff-Quik: Esta tinción es la más recomendada a nivel de clínica, ya que es mucho más rápida y no se requiere preparar ningún reactivo. Esta tinción consta de un alcohol para fijar la laminilla y los colorantes de eosina y azul de metileno. La forma de teñir es muy sencilla, ya que solamente se introduce la laminilla en cada uno de los reactivos por un lapso de 15 a 30 segundos en el mismo orden antes mencionado, sin enjuagar entre cada pase. Después del último colorante se enjuaga con agua corriente, se deja secar y está listo para su evaluación. Tinción de Wright: Esta tinción tiene como ventaja ser más económica que la anterior. La desventaja es que es ligeramente más tardada y eventualmente si no se utilizan bien los tiempos pueden quedar las células muy pálidas, sobre teñidas u obtener precipitados en el fondo del frotis o sobre las células. Para teñir el frotis se coloca una capa de la tinción por un lapso aproximado de 3 minutos (el tiempo va a variar entre cada tinción preparada, así es que los tiempos se tienen que ajustar cada vez que se cambie de tinción), posteriormente se coloca otra capa de amortiguador, aproximadamente la misma cantidad que se adicionó de colorante y se deja por 6 minutos. Una vez transcurrido el tiempo se escurre el colorante y se enjuaga la laminilla con agua corriente y se deja secar. Evaluación del frotis sanguíneo Una vez que el frotis sanguíneo ha sido debidamente teñido y montado, se inicia con la evaluación microscópica. Es fundamental una aproximación sistemática para obtener mejores resultados. La evaluación se debe iniciar con el objetivo de 10X (100 aumentos), para tratar de identificar si las células están distribuidas homogéneamente o la presencia de cúmulos de plaquetas u otro tipo de células. Posteriormente con el objetivo de 40 X se puede hacer una revisión general de los eritrocitos y leucocitos, en caso de encontrar alguna anormalidad muy evidente a este aumento deberá anotarse. Por último, se debe hacer la revisión con el objetivo de 100 X en donde se evaluará de forma detallada la línea roja, blanca y plaquetas. Cabe mencionar que para poder detectar anormalidades morfológicas en las células sanguíneas es necesario primero conocer características normales de cada una de estas células. Evaluación de los eritrocitos Es de gran utilidad a nivel de clínica conocer las principales anormalidades morfológicas en eritrocitos ya que si bien no sustituyen los valores obtenidos por el hemograma, si nos dan en muchas ocasiones una aproximación muy cercana a estos. La evaluación de los eritrocitos toma mayor relevancia en casos de pacientes con anemia, por lo tanto es deseable conocer el valor del hematocrito. Si bien existen diferentes formas de clasificar a las anemias, una de las más importantes corresponde a la clasificación con base en la respuesta medular, en regenerativas o no regenerativas. Los hallazgos que podemos observar en anemias regenerativas son los siguientes: 1) anisocitosis: diferencia en el tamaño de los eritrocitos, 2) policromasia: presencia de eritrocitos con una coloración azul grisácea debido a la presencia de restos de material nuclear, 3) eritrocitos nucleados, que pueden ser metarrubricitos o rubricitos y 4) cuerpos de Howell-Jolly: se observan como estructuras únicas, redondas y basófilas, frecuentemente en la periferia del eritrocito. Todos estos indican que los eritrocitos están saliendo a sangre periférica con cierto grado de inmadurez y por lo tanto la médula ósea está respondiendo adecuadamente a la disminución de eritrocitos. En el caso de anemias no regenerativas los hallazgos en los eritrocitos no son diferentes a los que esperaríamos encontrar en un perro normal, lo cual es indicativo de ausencia de respuesta medular. Existen diferentes anormalidades morfológicas inespecíficas en eritrocitos las cuales se denominan poiquilocitos. Los poiquilocitos pueden clasificarse de acuerdo a su forma en diferentes tipos y cada uno de estos puede indicar ciertas alteraciones u enfermedades en el paciente. En general los podemos clasificar de la siguiente manera: 1) producidos por daño oxidativo: excentrocitos y cuerpos de Heinz, 2) producidos por daño mecánico: esquistocitos y queratocitos, 3) producidos por alteración metabólica de membrana: codocitos, acantocitos y equinocitos, 4) enfermedades inmunomediadas y genéticas: esferocitos y estomatocitos. De igual forma debe evaluarse el patrón de acomodo de los eritrocitos en el frotis, en donde básicamente encontramos 2 alteraciones: 1) aglutinación, la cual se observa en procesos inmunomediados dada la presencia de anticuerpos en la superficie de los eritrocitos y 2) rouleaux, en donde los eritrocitos se encuentran apilados unos sobre otros formando una columna. Este hallazgo se puede observar en los casos de inflamación crónica, ya que la hiperproteinemia puede modificar las cargas de la membrana del eritrocito. Evaluación de plaquetas Las plaquetas fisiológicamente participan principalmente en el mecanismo de hemostasia por lo tanto cualquier paciente que tenga signos clínicos relacionados con hemorragias (petequias, equimosis, epistaxis, melena, hematoquezia, hematuria, etc.) debería ser evaluado para confirmar o descartar la probable presencia de trombocitopenia. El estimado plaquetario determinado en un frotis sanguíneo es muy confiable si se lleva a cabo correctamente y se aproxima mucho a conteos con analizadores automatizados. La forma de estimar el conteo plaquetario en un frotis sanguíneo se realiza de la siguiente manera: 1) En un frotis sanguíneo teñido y con el objetivo de 100X se cuentan las plaquetas en cada uno de 10 campos, 2) se obtiene un promedio de las plaquetas contadas en los 10 campos, 3) el promedio se multiplica por 20 y el resultado es el conteo total de plaquetas expresado en X109/L. Este valor se deberá comparar con los valores de referencia para la especie y de esa forma se podrán detectar hallazgos como trombocitopenia o trombocitosis. Para esta técnica es muy importante que las plaquetas estén distribuidas homogéneamente, ya que en casos de encontrar cúmulos de plaquetas en la cola del frotis o en la monocapa, podemos subestimar el estimado plaquetario y diagnosticar una falsa trombocitopenia. Pueden observarse alteraciones morfológicas en las plaquetas, sin embargo, estas no son de mucho valor diagnóstico. Las microplaquetas ( 7µm) suelen reflejar respuesta medular en algunos casos con trombocitopenia. Eventualmente pueden observarse prolongaciones citoplasmáticas en las plaquetas lo cual indica actividad de las mismas. Evaluación de leucocitos La evaluación de los leucocitos debe realizarse por tres razones: 1) estimar el conteo total y tratar de detectar alteraciones como leucocitosis o leucopenia, 2) realizar un diferencial e identificar si existe predominio de alguno de los diferentes tipos de los leucocitos, 3) detectar alteraciones morfológicas. El estimado de leucocitos se puede realizar de la siguiente forma: 1) en un frotis sanguíneo teñido y con el objetivo de 10X se cuentan la cantidad de leucocitos observados en un mínimo de 3 campos, 2) se obtiene un promedio de los leucocitos contados, 3) se multiplica por el factor de 0.36. El resultado final será un aproximado del conteo total de leucocitos expresado en X10 9/L. El estimado de leucocitos no suele ser tan confiable como lo es para plaquetas, por lo tanto en todos los casos será un resultado preliminar que deberá confirmarse con el hemograma completo. Existen algunas enfermedades en que resulta fácil detectar las alteraciones, por ejemplo en leucemias en donde podemos encontrar leucocitosis marcadas o leucopenias severas como en el caso de aplasia medular. El diferencial de leucocitos se realiza en el frotis sanguíneo de preferencia utilizando el objetivo de 100X. Se debe recorrer la laminilla en forma de Zig-Zag y contabilizar 100 leucocitos, definiendo el tipo específico al que corresponde cada uno de ellos (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos o basófilos). A través de este conteo se puede obtener un valor relativo porcentual de los diferentes leucocitos, sin embargo, para compararlo con el valor de referencia es necesario obtener los valores absolutos. Para esto puede utilizarse el valor total de leucocitos previamente estimado y realizar una regla de tres en donde el 100% corresponde al valor estimado de leucocitos. El valor final obtenido de cada uno de los leucocitos se expresa en X10 9/L y podrá compararse con los valores de referencia para definir alteraciones en cada línea. Con respecto a la morfología, deben evaluarse alteraciones principalmente en el tamaño de las células, color y características del citoplasma. Dentro de los hallazgos frecuentes que deberán identificarse son: la presencia de neutrófilos en banda y neutrófilos tóxicos. Los neutrófilos en banda suelen ser formas inmaduras que se presentan con mucha frecuencia en procesos inflamatorios, a este hallazgo también se le denomina desviación a la izquierda y mientras más marcado sea, el proceso inflamatorio es más severo. Los neutrófilos tóxicos son anormalidades morfológicas que se producen por defectos en la maduración del neutrófilo en médula ósea y son indicativos también de procesos inflamatorios severos. Conclusión El frotis sanguíneo puede representar una herramienta diagnóstica de gran utilidad en la clínica, debido a la gran cantidad de información que se puede obtener a través de una correcta evaluación. Si bien no se pretende sustituir un hemograma completo o la experiencia de un Patólogo Clínico, si es aconsejable que los clínicos conozcan las bases de su interpretación para poder tomar decisiones adecuados principalmente en casos de urgencias.