Determinación de riboflavina por fluorescencia-versión final

Primera revisión Nota Fecha Firma del docente Segunda revisión Determinación de riboflavina por fluorescencia Autores Pablo Luzuriaga Lorena Sofía Pepa Leticia Anabella Randazzo Natalia Carolina Santoro Fecha de realización del TP: 23/08/11 Fecha de entrega del informe: 06/09/11 Objetivos del TP Optimizar parámetros instrumentales a fin de determinar la concentración de dos muestras incógnita de riboflavina mediante la técnica de fluorescencia. Materiales y métodos Método: cuantificación por emisión de fluorescencia. Materiales: Soluciones patrón de riboflavina. Soluciones de muestras incógnita. Cubetas para absorción de luz visible. Cubetas para emisión por fluorescencia. Fuente para espectroscopía LED. Software Spectra Suit. Espectrofluorómetro de matriz de diodos. Resultados El valor obtenido para la muestra incógnita de mayor concentración es de: (7 ± 2) μM La muestra incógnita más diluida no se pudo cuantificar. Evaluación crítica 1 Primeramente se realizó la optimización de parámetros instrumentales. En esta parte del trabajo se trató de buscar un compromiso entre el tiempo de lectura, la sensibilidad y la relación señal-ruido. Para cuantificar la muestra incógnita más diluida fue necesario cambiar algunos parámetros instrumentales, ya que era necesario conocer si su señal se distinguía de la del ruido instrumental. Para esto, se aumentó el tiempo de integración, aumentando el tiempo en el que el detector recibe fotones, lo que genera una mayor sensibilidad, ya que la señal aumenta. Como la muestra era muy diluida, se pudo aumentar bastante este parámetro ya que el límite de saturación era mucho mayor que el correspondiente a la muestra concentrada. Por otro lado, se aumentó el boxcar width. Este cambio genera una mayor relación señal-ruido, si bien disminuye la sensibilidad. Se cree que la calidad de la señal obtenida se podría haber mejorado mucho más si se hubiera cambiado el número de scans, a valores fijos de boxcar width y de tiempo de integración. Esto se debe a que el ruido disminuye significativamente, permitiendo una mejor distinción de la señal correspondiente a la muestra. Debido a la falta de tiempo, no se pudo verificar esta hipótesis, siendo necesario realizar análisis posteriores. Con respecto a la performance analítica, en el caso de la muestra incógnita más concentrada, se puede decir que el método de cuantificación de dicha muestra es adecuado. Esto se puede apreciar a través de las figuras de mérito, mediante las cuales se puede afirmar que la relación señal – concentración es lineal y que, tanto el límite de detección (LD) como el de cuantificación (LC), se encuentran muy por debajo de la concentración de la muestra en cuestión. En el caso de la muestra incógnita más diluida, no se tiene información suficiente para asegurar que la performance analítica fuera adecuada. Esto se debe a que se construyó una curva de calibración con dos datos, lo cual no es estadísticamente significativo. Además, siendo una concentración tan baja, lo único que se pudo asegurar sobre la misma es que hay analito en la muestra (la señal es significativamente distinta del ruido instrumental, ya que la concentración obtenida es mayor que el LD), pero no se pudo cuantificar, pues la concentración obtenida es menor al LC. Conclusiones Se pudo cuantificar exitosamente la muestra incógnita más concentrada, con lo cual se concluye que el método utilizado es adecuado. En cambio, en el caso de la muestra incógnita más diluida, apenas pudo distinguirse el analito del ruido, sin poder cuantificar la misma. Esto se debe a que, por un lado, la curva de calibración no es la adecuada; debería haberse construido con varios patrones de concentración menor. Por otro lado, el método utilizado no es 2 adecuado para la cuantificación de este tipo de muestras; tal vez sea necesario utilizar otro método analítico, o bien preconcentrar la muestra incógnita. Bibliografía consultada D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrumental, Ápendice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edición, 1994. J.C. Miller, J.N. Miller, Estadística para Química Analítica, Addison-Wesley, 1993. Apunte de calibración de la cátedra de Análisis Instrumental, año 2011. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorhom e.html 3 Anexo • Optimización de parámetros instrumentales Se realizó un espectro de absorbancia: 2000 1500 Absorbancia 1000 500 0 400 450 500 550 600 650 Longitud de onda (nm) Figura 1. Espectro de absorbancia de una solución de riboflavina. Se analizaron los parámetros analíticos que influyen en el aspecto de dicho espectro: a. Tiempo de integración: es el tiempo durante el cual el detector recibe fotones. Al aumentar este parámetro la intensidad de la señal es mayor, ya que el detector acumula más carga. Esto implica una mayor sensibilidad. Sin embargo, este parámetro no puede aumentarse indefinidamente, ya que puede excederse el límite de saturación del detector. b. Número de scans: es el número de lecturas espectrales realizadas por el equipo para generar un solo espectro. Al aumentar este parámetro se obtiene un espectro más limpio, ya que al promediar varias curvas, las señales correspondientes al ruido (que son aleatorias en magnitud) se compensan y el efecto neto es un espectro con una línea de base mejorada. El tiempo de cada lectura es el número de scan multiplicado por el tiempo de integración. c. Boxcar width (ancho de ranura): es el número de scans que utiliza el equipo para promediar las señales. A mayor boxcar width la curva se ve más suave, es decir, aumenta el cociente señal-ruido, pero disminuye la sensibilidad (se achata la curva obtenida). Este no es un parámetro netamente 4 instrumental, pero tiene el mismo efecto sobre el espectro obtenido que el que tendría una rendija en un espectrofotómetro. Se optimizaron los parámetros instrumentales para construir cada curva de calibración; los valores fijados fueron: Parámetro Tiempo de integración Número de scans Ancho de ranura Muestra más concentrada 2 segundos 5 1 Muestra más diluida 15 segundos 5 5 Tabla 1. Parámetros instrumentales de las dos curvas de calibración. • Relación entre los espectros de absorbancia y de fluorescencia Se compararon los espectros de absorbancia y fluorescencia: 4000 3500 3000 2500 fluorescencia absorbancia Señal 2000 1500 1000 500 0 400 500 600 700 Longitud de onda (nm) Figura 2. Espectros de absorbancia y fluorescencia. Se puede observar que hay un corrimiento hacia el rojo (hacia mayores longitudes de onda) de la fluorescencia respecto de la absorbancia (corrimiento de Stokes). Esto se debe a que la energía asociada con la emisión por fluorescencia es menor que la asociada a la absorción. Además, la emisión por fluorescencia es acompañada por transiciones entre niveles vibracionales del estado fundamental, lo que resulta en pérdidas de energía por vía térmica (no radiativa). Otros fenómenos, como efectos de orientación del solvente, reacciones del nivel excitado, formación de complejos y energía de resonancia pueden contribuir a las longitudes de onda mayores de la emisión. 5 • Cuantificación de muestras incógnita Para cuantificar dos muestras incógnita de riboflavina por el método de fluorescencia, se construyeron dos curvas de calibración: 4000 3000 Señal de fluorescencia 2000 1000 0 0 5 10 15 Concentración ( µM) Figura 3. Curva de calibración para la muestra incógnita más concentrada. Figura 4. Curva de calibración para la muestra incógnita más diluída. A continuación pueden verse los picos obtenidos para el patrón y la muestra B. 6 Figura 5. Espectro correspondiente a la solución de concentración más diluida Figura 6. Espectro correspondiente a la solución incógnita más diluida. de la curva Parámetros de la regresión lineal: Curva Figura Figura Pendient e (μM-1) 276 ± 8 2241 Ordenada al origen 223 ± 58 35,49 R2 0,9961 7 1 Tabla 2. Parámetros del método de cuadrados mínimos utilizado para obtener la curva de calibración. a. Cuantificación de la muestra incógnita más concentrada: 6,60 μM El error se calcula propagando los errores de la ordenada al origen y de la pendiente en la curva de calibración: μM 7 En una cifra significativa: Sr = 2 μM. b. Cuantificación de la muestra incógnita más diluida: Debido a que esta concentración se encuentra por debajo del LC, se concluye que no es posible cuantificar esta muestra. Sin embargo, se puede afirmar que hay analito en dicha muestra, ya que esta concentración se encuentra por encima del LD, lo que implica que la señal no se debe sólo al ruido instrumental. • Figuras de mérito Para determinar la performance analítica del método utilizado, se calcularán las siguientes figuras de mérito utilizando los datos de la curva de calibración para la muestra más concentrada. La curva construida para la muestra incógnita más diluida es estadísticamente poco significativa, por lo tanto, no se realizará este análisis para dicha curva. a. Sensibilidad: se define como la derivada de la señal con respecto a la concentración: S = (276 ± 8) μM-1 b. Límite de detección: se define como la concentración necesaria para producir una relación señal a ruido tres veces mayor a la desviación estándar del blanco. Para calcular este parámetro, es necesario hacer un análisis del ruido instrumental: Figura 7. Histograma del ruido en 800-1000 nm para la Figura 8. Histograma del ruido en 8001000 nm para la muestra B (frecuencia muestra DILUIDA (frecuencia vs. cuentas). vs. cuentas). 8 La distribución parece ser bimodal; al realizar el test de normalidad de ShapiroWilk se puede confirmar que la distribución no es normal. N Promedio Desviaci ón estánda r 1,96 Mínimo Median a 1,28 Máximo 201 1,71 -4,29 7,36 Tabla 3. Parámetros estadísticos correspondientes a la figura 7. N Promed io 0,82 Desviaci ón estánda r 1,66 Mínimo Media na 0,78 Máximo 201 -8,78 4,46 Tabla 4. Parámetros estadísticos correspondientes a la figura 8. De esta forma, el límite de detección es LD = 3 DS / s = 3 * 1,96 / 276 = 0,0213 μM donde DS es la desviación estándar del blanco (en este caso, fue extraída de una porción del espectro que sólo presenta ruido) y s es la sensibilidad, es decir, la pendiente de la curva de calibración. c. Límite de cuantificación: se define como: LC = 10 DS / m = 10 * 1,96 / 276 = 0,0710 μM En el siguiente gráfico puede verse que la señal del ruido se ubica por debajo de la señal que arrojaría la concentración correspondiente al límite de detección: 9 Figura 9. Señal vs. longitud de onda en nm (región de 800 a 900 nm) para el espectro de la muestra B. d. Ámbito lineal: Para verificar la linealidad de la relación señal-concentración, se pueden usar, entre otros, dos parámetros: 1. El coeficiente de correlación lineal R: el valor arrojado por la regresión lineal es: Este valor implica que hay una buena correlación lineal entre los datos, dado que es cercano a la unidad. Los valores de Sxy, Sxx, y Syy están relacionados con las diferencias entre los valores de x ó y respectivamente y los valores de sus promedios. Debido a que puede ocurrir que el numerador y el denominador de esta expresión sean parecidos, sin que la relación señal-concentración sea necesariamente lineal, es necesario realizar el análisis de los residuos: 2. Los valores residuales se definen como: donde y es el valor de la señal obtenida para la solución patrón de concentración conocida e y´ es el valor obtenido a partir de la curva de calibración construida. Para el análisis de residuos se realiza el gráfico de residuos vs. concentración: 10 100 50 Residuos 0 0 5 10 15 Concentración ( µ M) -50 -100 Figura 10. Gráfico de residuos en función de la concentración Se puede ver que hay una distribución aleatoria de los residuos positivos y negativos, de modo que se puede verificar la linealidad de la curva de calibración. De este modo, se puede definir el ámbito lineal del método como: AL = (1,25 – 12,5) μM e. Detección de datos anómalos: de acuerdo al test F de linealidad, se considera un dato anómalo a aquél dato que cumple con la siguiente desigualdad: Concentración (μM) 12,5 10 7,5 5 2,5 Señal y 3601, 32 3033, 8 2316, 32 1703, 62 871,3 8 Señal predicha por la regresión y´ 3677,659455 2986,68728 2295,715105 1604,74293 913,770755 Residuos y – y´ 76,33945 5 47,11272 20,60489 5 98,87707 42,39075 5 Detección de datos anómalos -1,02157653 0,630463618 0,275735229 1,323175467 -0,567274162 11 1,25 520,4 2 568,2846675 anómalos. 47,86466 75 -0,640526199 Tabla 5. Datos de los residuos y detección de datos Se puede observar de los valores de la tabla que ningún valor excede a 1,5, de lo cual se deduce que no hay datos anómalos. 12