API SISTEMA DE IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS CLINICA Y APLICACIÓN INDUSTRIAL API 20 E es un sistema para la identificación de las Enterobacterias y otros bacilos Gramnegativos no exigentes que utiliza 23 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. PRINCIPIO API 20 E consta de 20 microtubulos conteniendo substratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensión bacteriana la cual hidrata el medio. Durante la incubación, se producen cambios de color espontáneos o revelados por adición de reactivos. La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la Tabla de lectura y la identificación mediante el API20E Index o el Programa informático para la identificación. LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E LECTURA API 20 E Orto-Nitrofenil--galactopiranósido ONPG INTRODUCCION Esta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar la lactosa. Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen dos enzimas específicos uno es la lactosa Permeasa que está en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a través de la membrana celular. La otra enzima es la B-D-Galactosidasa que está localizado en el interior de la célula y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa. Los microorga nismos , según fermente o no la lactosa, se pueden clasificar en : Fermentadores activos de lactosa en 24 horas, los cuales poseen ambas enzimas. No fermentadores de lactosa, carecen de ambas enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la célula la lactosa. Fermentadores tardíos de lactosa, poseen la enzima B-D-Galactosidasa son capaces de permeabilizar ligeramente la lactosa con concentraciones altas de lactosa y fermentarla en 2 a 15 días. Para detectar en los microorganismos la enzima B-D-Galactosidasa se utiliza un compuesto similar a la lactosa, pero en su formula molecular se ha sustituido la glucosa por el Orto-nitrofenol; éste, al liberarse al medio alcalino por acción de la enzima B-D-Galactosidasa, si lo hubiera en el microorganismo, produce un color amarillo. ONPG (+): A los 60 minutos se observa un color amarillo. ONPG (-): No se puede interpretar antes de las 24 horas. Orto-Nitrofenil--galactopiranósido ONPG TECNICA: Preparar una suspensión densa del microorganismo a partir de un cultivo puro en 0.5 ml Solución Fisológica. Liberar la B-D-Galactosidasa de las bacterias. Para ello se añade una gota de tolueno a la suspensión y mezclar vigorosamente durante unos segundos. Añadir 0.5 ml de la solución ONPG, mezclar. Incubar a 37ºC y leer antes de 24 horas. REACCION: Orto-Nitrofenil -galactosidasa Galactosa + OrtoniTrofenol -galactopiranósido Hidrólisis Amarillo Incoloro Debe utilizarse un inóculo concentrado para que exista una concentración alta de enzima y aumentar la velocidad de reacción. La solución de ONPG debe ser incolora y por ello debe prepararse en el momento . La solución debe guardarse en frascos de color topacio a una temperatura de 4ºC. pues es fácilmente desestabilizante. Antes de usarse se debe atemperar en un baño a 37ºC para que se disuelvan los fosfatos que cristalizan durante la conservación. DESCARBOXILASA DE MOELLER Lisina Arginina Ornitina La lisina descarboxilasa LDC es la enzima que actúa sobre la L-lisina obteniéndose cadaverina y CO2. La ornitina descarboxilasa ODC es la enzima que actúa sobre la L-ornitina obteniéndose putrescina y CO2. La arginina deshidrolasa es la enzima que cataliza una hidrólisis de la L-arginina obteniéndose L-citrulina más amoníaco, para posteriormente sufrir una descarboxilación en la L-citrulina formándose putrescina más CO2. En todas estas reacciones se desprende CO2 y se alcaliniza el medio. La liberación de aminas se evidencia por un color rojo o púrpura, en contraste con el color amarillo del control y de los tubos con reacciones negativas. Lisina (+), Arginina (-), Ornitina (+). Las descarboxilasas son enzimas que actúan sobre el grupo carboxilo de los aminoácidos Lisina, Ornitina, Arginina, para formar aminas y se desprende CO2, este proceso se realiza en anaerobiosis.Cada descarboxilasa actúa sobre un aminoácido. Citrato de Simmons C.S. INTRODUCCION El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs . Algunas bacterias pueden obtener energía por vía distinta de la de fermentación de hidratos de carbono, utilizando citrato como única fuente de carbono. La determinación de esta característica importante para la identificación de muchas enterobacterias. TECNICA Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio e inocular en una sola ,estría en el pico del agro citrato e incubar a 37ºC por 24 - 48 horas. INTERPRETACION El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. Agar S.I.M. PRODUCCION DE H2S Se evidencia la formación de ácido sulfihidrico por la formación de un precipitado negro. Esto se logra mediante las siguientes etapas: Liberación de sulfuro a partir del tiosulfato por acción enzimática de la bacteria. Acoplamiento del sulfuro (S-2) con el ion hidrogeno (H+) para formar gas H2S. Detección del gas H2S mediante sales de metales pesados como hierro, logrando la forma de sulfuro del hierro, que es un precipitado negro. Este medio de cultivo permite comprobar la formación de sulfuro, la producción de indol y observar la movilidad. Agar Urea INTRODUCCIÓN: Esta prueba detecta la presencia de la enzima ureasa en los microorganismos a través de una prueba en la que se observa la alcalinización del medio. La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea dando lugar a carbonato amóniaco, con lo que el medio se alcaliniza, a través del cambio de color del indicador de pH, por acción de la ureasa sobre la urea. REACCION: Urea Ureasa Anhidrido + Amoníaco + Carbonato carbónico amónico TECNICA: Sembrar, el microorganismo en un tubo con agar urea de Christensen inclinado. Incubar a 37ºC hasta detectar cambio de color del indicador. INTERPETACION Urea positiva: color rojo rosado debido al cambio de color del indicador rojo fenol. Urea negativa: No se produce viraje de color. FENILALANINA DESAMINASA INTRODUCCION La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación forma un cetoácido. El ácido fenilpirúvico. De las enterobacterias sólo los miembros de los grupos Proteusy Providencia poseen la enzima fenilalanina desaminasa, necesaria para esta conversión. PRINCIPIO La prueba de fenilalanina se basa en la detección de ácido fenilpirúvico en el medio, tras el desarrollo del organismo en estudio. La prueba es positiva si aparece un color verde visible por adición de una solución cloruro férrico al 10%. El agar se vuelca en un tubo y se deja solidificar en pico de flauta. No se pueden utilizar extractos de carne ni hidrolizados de proteínas debido a su contenido natural variable de fenilalanina. El extracto de levadura sirve como fuente de carbono y nitrógeno. Al añadir FeCl, un color verde en la superficie del medio, como puede verse en el tubo de la izquierda, indica la presencia de ácido fenilpirúvico (un producto de degradación de la fenilalanina del medio) por acción de la fenilalanina desaminasa. INDOL INTRODUCCION: El indol, un bencilpirrol, es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofáno. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofáno con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. La prueba de indol esta basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo del p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de Kovac y Erlich. Debe emplearse un medio rico en triptofáno. COMPOSICION: REACTIVO DE KOVAC Alcohol amílico o isoamílico puro 150 ml p-dimetilaminobenzaldehido 10 g HCl concentrado 50 ml TECNICA: Inocular el caldo peptonado e incubar a 37ºC por 24 horas. Luego añadir 5 gotas del reactivo por la pared del tubo. INTERPRETACION: Positivo: El desarrollo de un color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, indica la presencia del indol. Voges Proskauer V.P. INTRODUCCION El ácido pirúvico, componente fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a través de varias vías, de acuerdo con los sistemas enzimáticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vías lleva a la producción de acetoína (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reacción neutra de la vía Butilenglicol. Los organismos que producen acetoína como principal subproducto del metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de ácidos mixtos. En presencia de oxígeno atmosférico e KOH al 40% , la acetoina se convierte en diacetilo y el alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo. COMPOSICION ALFA-NAFTOL KOH Alfa naftol 5 g KOH 40 g Alcohol etílico absoluto 100 ml Agua 100 ml TECNICA Inocular caldo MRVP e incubar a 37ºC por 24 horas. Luego añadir alfa naftol e KOH al 40%. agitar el tubo y dejarlo en reposo por l0 minutos. INTERPRETACION Positivo: desarrollo de un color rojo a los l0 minutos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. Hidrólisis de la Gelatina Medio con gelatina de Kohn Gelatina nutriente Carbón inactivado en polvo fino Agua destilada TRIPLE AZUCAR HIERRO T.S.I. A. INTRODUCCION La configuración del medio en pico de flauta (Pico y Fondo) determina la existencia de 2 compartimientos : - La porción inclinada, expuesta al oxígeno atmosférico es aerobia. - La porción inferior llamada fondo esta protegida del aire y es relativamente anaerobia. La porción expuesta al oxigeno (INCLINADA), tiende a tornarse alcalina por la descarboxilación oxidativa de proteínas, y se desarrolla un pH alcalino y se vuelve rojo. En el fondo del tubo donde no hay oxígeno , la degradación proteica es mínima y se pueden detectar incluso pequeñas cantidades de ácido por la aparición de un color amarillo. La producción de H2S se manifiesta por la producción de un color negro. La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio. La acidez del medio se pone de manifiesto por un color amarillo y se representa por la letra A. La alcalinidad del medio se pone de manifiesto por un color rojo y se representa por la letra K Manitol Salado Fermentación del manitol La fermentación de manitol es producida por el S. aureus y es útil para diferenciarlo del S. epidermidis. La utilización del Manitol formando ácido es una característica del S. Aureus. Esta propiedad puede evidenciarse convenientemente cultivando el microorganismo sobre un medio de cultivo que involucre manitol. Este medio es selectivo para el Staphylococus debido a la alta concentración de ClNa 7.5%. El indicador es rojo de Fenol, a pH ácido (amarillo) y pH alcalino (Rojo) Los hidratos de carbono más utilizados son: Glucosa Sacarosa Manosa Melibiosa Inositol Amgdaliana Sorbitol Arabinosa Rammnosa Se emplea caldo con indicador de pH Metabolismo de los hidratos de carbono son ácidos orgánicos HIDRATOS DE CARBONO PRUEBA DE LA OXIDASA A. INTRODUCCION La enzima citocromo oxidasa participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno. O2 -------------H2O O2 -------------H2O2 Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella. Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de ATP, el oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrogeno según la especia microbiana. PRUEBA DE LA OXIDASA Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia de la enzima “Citocromo Oxidasa” en el microorganismo, el cual cataliza el último paso de transferencia de electrones desde un substrato inorgánico (azúcares, polipeptidos, etc) al oxígeno. Para ello se observará el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando está reducido y coloreado cuando se oxida. Entre los indicadore más utilizados se encuentra la p-fenilendiamina, que por acción de la enzima citocromo oxidasa da un compuesto químico indofenol que tiene color. PRUEBA DE LA OXIDASA TECNICA: Se cultiva en una placa petri con agar sangre el microorganismo problema. Los medios que contengan glucosa pueden inducir a falsos resultados negativos debido a que la fermentación de la glucosa inhibe la actividad de la oxidasa. Sobre una placa petri vacía, colocar un trozo de papel de filtro. La tira de papel de filtro impregnada con el reactivo de Kovacs. Con una asa se toma una colonia de la placa con el cultivo del microorganismo y se extiende en el papel. Se lee el resultado a los 30 a 60 segundos. REACCION: p-fenilendiamina Oxidasa Indofenol coloreado O2 atmosférico INTERPRETACION Oxidasa (+): aparece un color purpúreo en el papel a lo s 30 - 60 seg. Oxidasa (-): No aparece un color. CALDO NITRATO AGAR NITRATO 1. COMPOSICION Peptona 8.6 g Extracto de carne 3 g Cloruro de sodio 6.4 g Peptona 5 g Agua destilada 1000 ml Nitrato de potasio 1 g Nitrato de potasio 10 g Agar 12 g Agua destilada 1000 ml 2. DESCRIPCION DEL MEDIO A. Requerimiento energético: B. Requerimiento no energético C. Según su proporción en agua D. Según su uso o utilización E. Según la composición que presenta F. Según su presentación NITRATO REDUCTASA REDUCCION DE NITRATOS INTRODUCCIÓN La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la identificación de especies de muchos microorganismos. Estos microorganismos poseen la enzima nitrato reductasa o nitratasa. Todas la enterobacterias, excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans y Erwinia, reducen nitratos. Está presente en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos los cuales utilizan nitrógeno como un último aceptor de electrones en el proceso metabolico PRINCIPIO Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La ecuación química es: Nitrato (NO3-) +2e- + 2H ----- Nitrito (NO2-) + H2O La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo alfa-naftilamina y ácido sulfánílico, con la formación de un colorante rojo de diazonio p-sulfobenceno azo-alfa-naftilamania. REDUCCION DE NITRATOS INTERPRETACIÓN El desarrrollo de un color rojo a los 30 seg de añadir los reactivos indica la presencia de nitritos y representa una reacción positiva para la reducción de nitratos. La ausencia de color tras el agregado de los reactivos puede indicar una reacción negativa o que han sido reducidos a productos distintos de los nitritos, como amoníaco, nitrógeno molecular (desnitrificación), óxido nítrico (NO) u óxido nitroso (N2O), e hidroxilamina. La reducción de nitratos ha sido llevada hasta la formación de nitrógeno molecular; éste se observa en el interior de la campana de Durham si el medio es líquido o por la aparición de grietas o burbujas en el caso de que el medio fuera sólido. En caso de ser negativo, debe agregarse una pequeña cantidad de zinc. Los iones Zinc reducen los nitratos a nitritos y el desarrollo de un color rojo tras el agregado de Zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa. REDUCCION DE NITRATOS INTERPRETACIÓN (MEDIO LIQUIDO) Hay tres casos en los que la prueba se considera positiva. Cuando aparece color rojo o rosado al añadir el reactivo A y B indica reducción de nitratos a nitritos. Cuando aparece gas en la campana de Durham indica reducción de nitratos a nitrógeno molecular. Cuando al añadir zinc en polvo no se desarrolla color indica formación de otros productos nitrogenados como: óxido nítrico, amoníaco, hidroxilamina, etc. La prueba es negativa cuando: Se forma color rojo o rosado al añadir polvo zinc en menos de 30 segundos. No se ha reducido el nitrato. Para comprobarlo se añade polvo de Zinc que actúa como reductor y se desencadena la reacción colorimétrica. Metodos computarizados API Permite investigar la degradación de hidratos de carbono, utilización de aminoácidos, y la presencia de enzimas con lo cual se puede identificar el género y la especie. Metodos computarizados DADE SCAN Permite investigar la degradación de hidratos de carbono, utilización de aminoácidos, y la presencia de enzimas con lo cual se puede identificar el género y la especie. Además permite investigar la sensibilidad y resitencia antimicrobiana.