ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Σύνθεση, χαρακτηρισμός και αποδέσμευση βιοδραστικών ουσιών από οστικά τσιμέντα με βάση το φωσφορικό ασβέστιο» ΜΥΣΤΗΡΙΔΟΥ ΕΜΜΑΝΟΥΕΛΑ Α.Μ. 861 Επιβλέπων Καθηγητής: Νικόλαος Μπουρόπουλος Επίκουρος Καθηγητής Πάτρα, Οκτώβριος 2013 3 Σύνθεση, χαρακτηρισμός και αποδέσμευση βιοδραστικών ουσιών από οστικά τσιμέντα με βάση το φωσφορικό ασβέστιο Περίληψη Με τη χρήση οστικών τσιμέντων μπορούν να αντιμετωπιστούν αρκετά ιατρικά περιστατικά που αφορούν την αποκατάσταση και ίαση οστών λόγω τραυματισμού ή άλλων παθήσεων. Τα υλικά αυτά παρουσιάζουν μεγάλο επιστημονικό και τεχνολογικό ενδιαφέρον χάρη στη σύσταση και στη βιοενεργότητά τους. Η χρήση βιοδραστικών ουσιών βοηθά την ίαση της πάσχουσας περιοχής. Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε σύνθεση και χαρακτηρισμός οστικών τσιμέντων με βάση το α-φωσφορικό τριασβέστιο (α-TCP) και τη γύψο. Επίσης, μελετήθηκε η απελευθέρωση ενός δυσδιάλυτου στο νερό αντιφλεγμονώδους φαρμάκου (ιβουπροφαίνη - ibuprofen) και μιας υδατοδιαλυτής φθορίζουσας χρωστικής ουσίας (ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη - FITC) από τα τσιμέντα αυτά. Στο πρώτο κεφάλαιο της διπλωματικής παρουσιάζονται, οι τύποι, η ταξινόμηση και ορισμένες εφαρμογές γενικά των βιοϋλικών. Στο δεύτερο, γίνεται αναφορά στα συστήματα τοπικής μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκων. Στη συνέχεια, στο τρίτο και τέταρτο κεφάλαιο, αναλύονται τα χαρακτηριστικά τόσο των τσιμέντων φωσφορικού ασβεστίου και γύψου όσο και οι βιοδραστικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Στο πέμπτο κεφάλαιο αναφέρονται οι αρχές των ενόργανων τεχνικών που εφαρμόστηκαν και πιο συγκεκριμένα οι τεχνικές XRD, SEM, ATR, φασματοσκοπία UV/Vis και Raman. Στο έκτο και τελευταίο κεφάλαιο παρουσιάζονται όλα τα πειραματικά δεδομένα που αφορούν τη σύνθεση και το δομικό, μηχανικό και μορφολογικό χαρακτηρισμό των αμιγών και σύνθετων οστκών τσιμέντων που παρασκευάστηκαν. Τέλος παρουσιάζονται τα αποτελέσματα σχετικά με την ικανότητα των τσιμέντων που παρασκευάσθησαν να χρησιμοποιηθούν ως συστήματα απελευθέρωσης δύο βιοδραστικών ενώσεων. Εικόνα εξωφύλλου: Φωτογραφία από μικροσκόπιο SEM που απεικονίζει βελονοειδείς κρυστάλλους α-TCP. Synthesis, characterization and release of bioactive compounds from calcium phosphate bone cements Abstract Use of bone cements is beneficial for the treatment of many bone diseases caused by injuries or other factors. There is great interest in using bone cements in clinical practice due to their composition and bioactivity. The presence of bioactive compounds can help the clinical management of the diseased area. The present Diploma Thesis is on the synthesis and characterization of bone cements composed of a-tricalcium phosphate (α-TCP) and gypsum. Furthermore the release of a sparingly soluble drug (ibuprofen) and a water soluble pigment (FITC) from cement matrices were studied. In the first chapter, the different types, the classification and some applications of biomaterials are presented. Next chapter is on the topical and controlled drug delivery systems. In the third and fourth chapters the specifications of calcium phosphate bone cements and gypsum and the bioactive substances used in the present study are presented. In the fifth chapter the fundamental principles of instrumental analytical methods used in the present work such as XRD, SEM, UV/Vis spectroscopy and Raman spectroscopy are described. Finally, in the last chapter all the experimental results are shown and discussed. The results are on the synthesis and structural, mechanical and morphological characterization of different cements formulations. Finally this chapter reports on the ability of the prepared formulations as a controlled release system of two bioactive compounds. 5 Ευχαριστίες Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή μου κ. Νικόλαο Μπουρόπουλο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και για την πολύτιμη βοήθειά του σε θέματα που αφορούσαν την ολοκλήρωση της διπλωματικής μου εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για τις σημαντικές και εύστοχες παρατηρήσεις του οι οποίες με βοήθησαν να διευρύνω τους ορίζοντές μου και να καθορίσω τους μελλοντικούς μου στόχους, καθώς επίσης και για τη βοήθειά του σε ζητήματα εκτός σχολής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την ομάδα του κ. Σ. Γιαννόπουλου (κύριος Ερευνητής του ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ) για τη χρήση της φασματοσκοπικής τεχνκής Raman και για τη λήψη εικόνων SEM και φασμάτων XRD τον κ. Β. Δρακόπουλο (κύριος Ε.Λ.Ε. του ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ). Ιδιαίτερες ευχαριστίες θέλω να απευθύνω στη συνεργάτη και φίλη μου Ιωάννα Κοντοπούλου για τη βοήθεια που μου παρείχε τόσο σε πρακτικό όσο και σε ψυχολογικό επίπεδο κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας. Η βοήθεια και η συμπαράστασή της αυτόν τον ένα χρόνο που συνεργαζόμαστε ήταν ουσιαστική και πολύτιμη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου Δήμητρα και Γιάννη για την αμέριστη συμπαράσταση και στήριξη που μου προσφέρουν όλα αυτά τα χρόνια της φοίτησής μου, που πέρα απο οικονομική είναι συναισθηματική και ψυχολογική. Επίσης, ευχαριστώ τον Πέτρο Μαρκάδα για τους ίδιους λόγους. 7 Περιεχόμενα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1. Βιοϋλικά............. ................................................................................................................ 15 1.1 Κριτήρια επιλογής των βιοϋλικών ....................................................................... 15 1.2 Τύποι βιοϋλικών ....................................................................................................... 16 1.3 Ταξινόμηση των βιοϋλικών ................................................................................... 18 1.4 Εφαρμογές των βιοϋλικών ..................................................................................... 19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2. Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου 21 2.1 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των CDDS ............................................... 22 2.2 Υλικά που χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρμάκων ....................................... 23 2.3 Χαρακτηριστικά των CDDS ................................................................................... 25 2.4 Μηχανισμοί ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκου από CDDS ................. 26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 3. Υλικά Οστικής Αποκατάστασης .................................................................................. 29 3.1 Τσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου (CPCs) ........................................................... 30 3.1.1 Σύσταση των CPCs ............................................................................................. 31 3.1.2 Μετασχηματισμοί μεταξύ των φάσεων των CPCs ..................................... 33 3.1.2.1 Υδροξυαπατίτης ...................................................................................... 34 3.1.2.2 Βρουσίτης .................................................................................................. 36 3.1.3 Μηχανισμός σκλήρυνσης των CPCs .............................................................. 37 3.1.4 Μικροδομή και πορώδες των CPCs ................................................................. 37 3.1.5 Βιοενεργότητα και απορρόφηση των CPCs .................................................. 39 3.1.6 Δυνατότητα ενέσιμης έγχυσης των CPCs ..................................................... 40 3.1.7 CPCs ως μεταφορείς φαρμάκων ..................................................................... 41 3.1.7.1 Ενσωμάτωση φαρμάκου σε CPCs ....................................................... 41 3.1.7.2 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ CPC και φαρμάκου ................................. 43 3.1.7.3 Κινητική απελευθέρωσης φαρμάκου από CPCs ............................. 43 3.2 Γύψος ........................................................................................................................... 45 3.2.1 Προϊόντα όπτησης της φυσικής γύψου ......................................................... 45 3.2.2 Ημιένυδρη γύψος ................................................................................................ 46 3.2.2.1 Παρασκευή ............................................................................................... 46 3.2.2.2 Φυσικές ιδιότητες .................................................................................... 46 3.2.2.3 Πήξη και σκλήρυνση της πλαστικής γύψου ..................................... 46 3.2.2.4 Είδη ............................................................................................................ 47 3.2.2.5 Εφαρμογές ................................................................................................ 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 4. Βιοδραστικές Ουσίες ........................................................................................................ 49 4.1 Ιβουπροφαίνη ............................................................................................................ 49 4.1.1 Καφέ σύνθεση ..................................................................................................... 50 4.1.2 Πράσινη σύνθεση ............................................................................................... 51 4.2 Ισοθειοκυανική Φλουορεσκεΐνη ............................................................................ 51 4.2.1 Ανοσοφθορισμός ................................................................................................ 52 4.2.1.1 Τύποι ανοσοφθορισμού ......................................................................... 52 4.2.1.2 Εφαρμογές ανοσοφθορισμού ............................................................... 53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 5. Τεχνικές Ενόργανης Ανάλυσης .................................................................................... 55 5.1 Περίθλαση Ακτίνων-Χ (XRD) ................................................................................ 55 5.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) ...................................................... 58 5.3 Φασματοσκοπία Αποσβενύμενης Ολικής Ανακλαστικότητας (ATR) ......... 64 5.4 Φασματομετρία Μοριακής Απορρόφησης Υπεριώδους/Ορατού (UV/Vis) .. 67 5.5 Φασματοσκοπία RAMAN....................................................................................... 70 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 6. Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα ................................................................ 75 6.1 Πειραματική διαδικασία ......................................................................................... 75 9 6.1.1 Παρασκευή του α-TCP ....................................................................................... 75 6.1.2 Παρασκευή δοκιμίων για μετρήσεις αντοχής σε θλίψη ............................ 77 6.1.3 Παρασκευή δισκίων για μετρήσεις αποδέσμευσης βιοδρ/κών ουσιών .. 79 6.2 Χαρακτηρισμός του α-TCP με περίθλαση ακτίνων-Χ ...................................... 80 6.3 Χαρακτηρισμός α-TCP και ώριμων τσιμέντων με φασματοσκοπία Raman 82 6.4 Δοκιμές αντοχής σε θλίψη ..................................................................................... 83 6.4.1 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) ………………………… 85 6.4.2 SEM ……………………………………………………………………………… 88 6.5 Αποδέσμευση βιοδραστικών ουσιών από τα τσιμέντα ................................... 90 6.5.1 Ιβουπροφαίνη ………………………………………………………………….. 90 6.5.1.1 Ποσοτικός Προσδιορισμός .................................................................... 90 6.5.1.2 Χαρακτηρισμός με φασματοσκοπία FTIR/ATR ............................... 93 6.5.1.3 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) ............................ 96 6.5.1.4 SEM ............................................................................................................ 98 6.5.2 Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη .....................................................................100 6.5.2.1 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) .......................... 102 6.6 Συμπεράσματα ....................................................................................................... 104 6.7 Προτάσεις για μελλοντική έρευνα .......................................................................105 Βιβλιογραφία ..................................................................................................................... 107 Περιεχόμενα Εικόνων Εικόνα 1: Παραδείγματα εφαρμογών των βιοϋλικών . ................................................ 20 Εικόνα 2: Συγκέντρωση φαρμάκου στο αίμα με Α) συμβατικές μεθόδους χορήγησης και Β) CDDS .................................................................................. 26 Εικόνα 3: Μεταφορά και απελευθέρωση φαρμάκου από ένα τυπικό CDDS α) τύπου μήτρας με διάχυση, β) τύπου δεξαμενής με διάχυση, γ) με διόγκωση, δ) με βιοαποικοδόμηση ............................................................... 28 Εικόνα 4: Κατηγοριοποίηση των CPCs ............................................................................ 33 Εικόνα 5: Διάγραμμα φάσης διαλυτότητας για το τριαδικό σύστημα Ca(OH)2 - H3PO4 - H2O στους 37oC. Μεταβολή του λογαρίθμου της συγκέντρωσης του ασβεστίου και του λογαρίθμου της συγκέντρωσης του φωσφόρου συναρτήσει του pH του διαλύματος ............................................................. 34 Εικόνα 6: Κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά του υδροξυαπατίτη ........................ 35 Εικόνα 7: Αλυσίδες ασβεστίου και φωσφόρου στη δομή του DCPD .......................... 36 Εικόνα 8: Παράμετροι που επηρεάζουν τη μικροδομή και το πορώδες των CPCs. 38 Εικόνα 9: Μέθοδοι ενσωμάτωσης του φαρμάκου σε CPCs .......................................... 42 Εικόνα 10: Απεικόνιση των διαφορετικών τρόπων εγκλωβισμού του φαρμάκου .. 44 Εικόνα 11: Καφέ σύνθεση ιβουπροφαίνης. ..................................................................... 50 Εικόνα 12: Πράσινη σύνθεση ιβουπροφαίνης ................................................................ 51 Εικόνα 13: Έμμεσος ανοσοφθορισμός. ............................................................................. 52 Εικόνα 14: Άμεσος ανοσοφθορισμός. ............................................................................... 53 Εικόνα 15: Ανοσοφθορισμός με προσθήκη διπλής φθορίζουσαςουσίας .................. 53 Εικόνα 16: Περίθλαση των ακτίνων-Χ από κρυσταλλικό πλέγμα ............................. 56 Εικόνα 17: Οργανολογία περιθλασίμετρου ακτίνων-Χ ................................................ 57 Εικόνα 18: Περιθλασίμετρο Bruker D8. ............................................................................ 58 Εικόνα 19: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης LEO SUPRA 35VP. ......................... 59 Εικόνα 20: Φαινόμενα αλληλεπίδρασης δέσμης – δείγματος ..................................... 60 Εικόνα 21: Σχηματικό διάγραμμα μικροσκοπίου SEM. ................................................ 62 11 Εικόνα 22: Σύστημα sputtering που χρησιμοποιήθηκε. Τα δείγματα πριν και μετά από το sputtering. .............................................................................................. 63 Εικόνα 23: Ενδεικτική τομή διάταξης ΑΤR ...................................................................... 65 Εικόνα 24: Πρόσπτωση ακτινοβολίας και δημιουργία αποσβενόμενου κύματος στο δείγμα. .......................................................................................................... 65 Εικόνα 25: Φασματόμετρο FTIR με εξάρτημα ATR ....................................................... 67 Εικόνα 26: Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους/ορατού διπλής δέσμης ........................ 69 Εικόνα 27: Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτομέτρου UV/VIS διπλής δέσμης. 69 Εικόνα 28: Είδη σκεδάσεων του φωτός. ............................................................................ 71 Εικόνα 29: Σχηματική απεικόνιση του φαινομένου Raman. ....................................... 72 Εικόνα 30: Σχηματική πειραματική διάταξη Raman. .................................................... 72 Εικόνα 31: Φασματοφωτόμετρο Micro-Raman (Labram HR-800) ............................... 74 Εικόνα 32: Σφαιρόμυλος, δοχείο και σφαίρες διαμετρου 1cm απο αχάτη................ 76 Εικόνα 33: Χωνευτήρια αλούμινας τοποθετημένα στο φούρνο. ................................ 76 Εικόνα 34: Φωτογραφίες του δείγματος αμέσως μετά την έξοδό του από το φούρνο (αριστερά) και της αποκόλλησής του από το χωνευτήριο ........ 77 Εικόνα 35: Φωτογραφία του καλουπιού που χρησιμοποιήθηκε. ................................ 78 Εικόνα 36: Φωτογραφία των δοκιμίων αμέσως μετά την αφαίρεσή τους απο το καλούπι. .............................................................................................................. 78 Εικόνα 37: Φωτογραφία των καλουπιών που χρησιμοποιήθηκαν. ........................... 79 Εικόνα 38: Σχηματική αναπαράσταση της δειγματοληπτικής διαδικασίας. .......... 80 Εικόνα 39: Mηχανή θλίψης-εφελκυσμού Hounsfield H20K-W. .................................. 84 Εικόνα 40: Αρπάγες θλίψης με δοκίμιο τσιμέντου. ....................................................... 84 Εικόνα 41: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων α-TCP πριν από την εισαγωγή (A) και έπειτα από την παραμονή τους σε διάλυμα Ringer για 7 (Β) και 340 (Γ) ώρες. ................................................................................. 88 Εικόνα 42:Εικόνες από μικροσκόπιο SEM σύνθετων τσιμέντων 90% α-TCP και 10% γύψου έπειτα από την παραμονή τους σε διάλυμα Ringer για 7 (Α,Β) και 340 (Γ) ώρες .................................................................................................. 89 Εικόνα 43: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων γύψου πριν από την εισαγωγή (A) και έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 340 (Β) ώρες ...................................................................................................................... 90 Εικόνα 44: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων α-TCP με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή τους στο διάλυμα PBS. .............. 99 Εικόνα 45:Εικόνες από μικροσκόπιο SEM σύνθετων τσιμέντων 88% α-TCP και 10% γύψου με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή τους στο διάλυμα PBS ........................................................................................................................ 99 Εικόνα 46: Εικόνα από μικροσκόπιο SEM καθαρού τσιμέντου γύψου με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή του στο διάλυμα PBS ................. 99 Περιεχόμενα Πινάκων Πίνακας 1: Φάσεις των αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου: γραμμομοριακός λόγος ασβεστίου προς φωσφορικά και αρνητικός λογάριθμος των ιοντικών γινομένων διαλυτότητας στο νερό στους 25οC ........................ 32 Πίνακας 2: Συστάσεις των δοκιμίων τσιμέντου που παρασκευάστηκαν.................. 78 Πίνακας 3: Σύσταση του διαλύματος Ringer ................................................................... 78 Πίνακας 4: Συστάσεις δοκιμίων τσιμέντου που κατασκευάστηκαν .......................... 79 Πίνακας 5: Σύσταση του διαλύματος PBS ........................................................................ 80 Περιεχόμενα Σχημάτων Σχήμα 1: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για την παρασκευασμένη στερεά φάση και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP και απατίτη (HAP). ... 81 Σχήμα 2: Φάσμα Raman σκόνης α-TCP και β-TCP καθώς και καθαρού ώριμου τσιμέντου α-TCP (200-825 cm-1). ..................................................................... 82 Σχήμα 3: Φάσμα Raman σκόνης α-TCP και β-TCP καθώς και καθαρού ώριμου τσιμέντου α-TCP (825-1200 cm-1) .................................................................... 83 Σχήμα 4: Αντοχή σε θλίψη συναρτήσει του χρόνου σκλήρυνσης για τα τρία είδη τσιμέντων που παρασκευάσθηκαν ............................................................... 85 Σχήμα 5: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 100% α- TCP έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP και HAP ........................................ 86 Σχήμα 6: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 90% α- TCP και 10% γύψο έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και των πρότυπων καρτών για τα α-TCP, β-TCP, HAP και γύψου. .................................................................................................................. 87 Σχήμα 7: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 100% γύψο έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και πρότυπα φάσματα της γύψου και του ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) ................................................................................................ 87 Σχήμα 8: Φάσματα αποορρόφησης γνωστών συγκεντρώσεων ιβουπροφαίνης. . 90 Σχήμα 9: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης της ιβουπροφαίνης για περιοχή συγκεντρώσεων 3 – 120 ppm. ......................................................................... 91 Σχήμα 10: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ιβουπροφαίνης (1%) συναρτήσει του χρόνου (Α: 99% α-TCP, Β: 89% α-TCP και 10% γύψος, Γ: 99% γύψος).92 Σχήμα 11: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ιβουπροφαίνης (2%) συναρτήσει του χρόνου (Δ: 98% α-TCP, Ε: 88% α-TCP και 10% γύψος, Ζ: 98% γύψος).93 Σχήμα 12: Φάσματα FTIR/ATR των δύο αμιγών παρασκευασμένων τσιμέντων α- TCP, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου ............ 94 Σχήμα 13: Φάσματα FTIR/ATR των δύο σύνθετων τσιμέντων α-TCP και 10% γύψου, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου. ....... 95 Σχήμα 14: Φάσματα FTIR/ATR των δύο αμιγών παρασκευασμένων τσιμέντων γύψου, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου. ....... 95 Σχήμα 15: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 98% α- TCP και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP, CDHA και ιβουπροφαίνης ........................................... 96 Σχήμα 16: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 88% α- TCP, 10% γύψο και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, γύψου, CDHA και ιβουπροφαίνης ........................................... 97 Σχήμα 17: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 98% γύψο και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των γύψου, ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) και ιβουπροφαίνης. ...................... 98 Σχήμα 18: Φάσματα αποορρόφησης γνωστών συγκεντρώσεων ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης ............................................................................................... 100 Σχήμα 19: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης για περιοχή συγκεντρώσεων 1 - 12ppm ...................... 101 Σχήμα 20: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (0,2%) συναρτήσει του χρόνου (Η: 99,8% α-TCP, Θ: 89,8% α-TCP και 10% γύψος, Ι: 99,8% γύψος) .................................................................................... 102 Σχήμα 21: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 99,8% α- TCP και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP, HAP και FITC .............................................. 103 Σχήμα 22: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 89,8% α- TCP, 10% γύψο και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, γύψου, HAP και FITC. ........................... 103 Σχήμα 23: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 99,8% γύψο και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των γύψου, ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) και FITC.104 15 Κεφάλαιο 1: Βιοϋλικά Παρά το γεγονός ότι πάνω από μισό αιώνα επιστήμονες ασχολούνται με την ανάπτυξη και τη μελέτη των βιοϋλικών, είναι δύσκολο να αποδοθεί ένας ακριβής ορισμός που θα τα χαρακτηρίζει πλήρως. Ωστόσο, ένας ευρέως αποδεκτός ορισμός που δίνεται από το «Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας» των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής είναι ο εξής: Βιοϋλικό είναι κάθε ουσία (μη φαρμακευτική) ή συνδυασμός ουσιών, συνθετικής ή φυσικής προέλευσης, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κάποιο χρονικό διάστημα είτε αυτόνομο είτε ως τμήμα ενός συστήματος για τη θεραπεία, υποβοήθηση ή αντικατάσταση κάποιου ιστού, οργάνου ή λειτουργίας μέσα στο σώμα. Το 1986, ο ορισμός απλοποιήθηκε από την «Ευρωπαϊκή Κοινωνία Βιοϋλικών», σύμφωνα με την οποία: Βιοϋλικό είναι ένα μη βιώσιμο υλικό που χρησιμοποιείται σε μια ιατρική διάταξη με σκοπό την αλληλεπίδρασή του με τα βιολογικά συστήματα [1][2]. 1.1 Κριτήρια επιλογής των βιοϋλικών Για την κατασκευή και την ορθή λειτουργία ενός βιοϋλικού καθοριστικό ρόλο παίζει η επιλογή του υλικού, το οποίο θα πρέπει να πληρεί κάποιες βασικές προϋποθέσεις [2]: 1. Βιοσυμβατότητα: Πρόκειται για την ικανότητα του υλικού να γίνεται αποδεκτό από το ανθρώπινο σώμα κι έτσι αυτό να μην το απορρίπτει εκλαμβάνοντάς το ως ξένο σώμα. Ένας γενικά αποδεκτός ορισμός της διατυπώθηκε από τον Williams το 1987: «Βιοσυμβατότητα καλείται η ικανότητα ενός υλικού να λειτουργεί και να αποδίδει με μια κατάλληλη ανταπόκριση σε μια συγκεκριμένη εφαρμογή». Μια άλλη ερμηνεία βασίζεται στην αλληλεπίδραση των συνθετικών συστατικών και των τοπικών και γενικών ιστών, η οποία σχετίζεται με συνθήκες ελάχιστης βλαπτικότητας ή αλλαγής είτε στον ξενιστή είτε στη διάταξη συναρμολόγησης. Αρχικά, διατυπώθηκε η άποψη ότι αυτό οφείλεται, εν μέρει, στις συνθήκες σχετικής χημικής και βιολογικής αδράνειας. Αργότερα, όμως, δόθηκε έμφαση στις ελεγχόμενες αλληλεπιδράσεις Κεφάλαιο 1 Βιοϋλικά μεταξύ των συνθετικών βιοϋλικών και των απευθείας συσχετιζόμενων ιστών και από το 1990 και μετά εφαρμόζονται συνθήκες χημικής και μηχανικής ανισοτροπίας κατά την κατασκευή συνθετικών βιοϋλικών προκειμένου να αυξηθεί η βιοσυμβατότητά τους. Γενικά, ένα πλήρως βιοσυμβατό υλικό δεν προκαλεί θρομβωτικές, τοξικές, φλεφμονώδεις ή αλλεργιογόνες αντιδράσεις ούτε είναι καρκινογενές, τερατογενές ή μεταλλαξιογόνο. 2. Βιοενεργό 3. Βιοδιαθέσιμο 4. Μηχανικές και φυσικές ιδιότητες: Τα βιοϋλικά κατασκευάζονται ως αντικαταστάτες φυσικών ιστών και γι’ αυτό θα πρέπει κατά το σχεδιασμό τους να λαμβάνονται υπόψη οι παρακάτω παράμετροι: Αντοχή και ικανότητα παραμόρφωσης Αντοχή σε καταπόνηση και ερπυσμό Αντοχή σε φθορά και τριβή Σκληρότητα Ιξώδες Πίεση 5. Δυνατότητα μορφοποίησης ή επεξεργασίας του για το σχηματισμό διαφόρων σχημάτων. 6. Σχετικά μικρό κόστος. Αυτά τα χαρακτηριστικά πρέπει να συγκεκριμενοποιούνται σε σχέση με τον επιδιωκόμενο μηχανισμό της εφαρμογής, να ελέγχονται και να αξιολογούνται μέσα από in vivo και in vitro πειράματα. Σημειώνεται ότι μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν γνωστά υλικά τα οποία ικανοποιούν πλήρως όλα αυτά τα κριτήρια. 1.2 Τύποι βιοϋλικών Η ποικιλία των εφαρμογών των βιοϋλικών είναι μεγάλη και δικαιολογεί το πλήθος των διαφορετικών τύπων υλικών που χρησιμοποιούνται, όπως φαίνεται παρακάτω [2][3]: Μεταλλικά: Καθώς φέρουν μοναδικές διευθετήσεις ατόμων και χαρακτηριστικούς δεσμούς, εμφανίζουν σημαντικές μηχανικές, θερμικές και ηλεκτρικές ιδιότητες (μηχανική αντοχή, ολκιμότητα, αντοχή στην τριβή, αγωγιμότητα κ.α.) που τα καθιστούν ιδανικά για ποικίλες ιατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιούνται σε εφαρμογές με υψηλές 17 Κεφάλαιο 1: Βιοϋλικά απαιτήσεις σε φόρτιση και γι’ αυτό πρέπει να έχουν επαρκή αντοχή κοπώσεως προκειμένου να ανταπεξέρχονται στις απαιτήσεις των καθημερινών δραστηριοτήτων, όπως περπάτημα, μάσημα κ.α.. Για παράδειγμα, μία από τις πιο κοινές ορθοπεδικές χειρουργικές επεμβάσεις περιλαμβάνει την τοποθέτηση μεταλλικών εμφυτευμάτων. Ωστόσο, εμφανίζουν και κάποιες αδυναμίες όπως χαμηλή βιοσυμβατότητα, διάβρωση, υψηλή δυσκαμψία σε σχέση με τους ιστούς, υψηλή πυκνότητα και απελευθέρωση μεταλλικών ιόντων που μπορεί να προκαλέσει αλλεργικές αντιδράσεις. Κεραμικά: Είναι γνωστά για την υψηλή βιοσυμβατότητα, την αντοχή στη φθορά και σε θλίψη, το υψηλό σημείο τήξεως και τη χαμηλή ηλεκτρική και θερμική αγωγιμότητα. Χρησιμοποιούνται ευρέως στις συναρθρωτικές επιφάνειες, στα δόντια και στις οστέινες συνδετικές επιφάνειες εμφυτευμάτων. Ωστόσο, η ευθραυστότητα, η έλλειψη ελαστικότητας, η υψηλή πυκνότητα και η δυσκολία κατασκευής τους περιορίζει τη χρήση τους αποκλείοντας εφαρμογές όπου απαιτείται υψηλή φόρτιση. Πολυμερή: Συνήθως χρησιμοποιούνται για την ευκαμψία και τη σταθερότητά τους, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για χαμηλής τριβής συναρθρωτικές επιφάνειες. Επιπλέον βασικά τους πλεονεκτήματα είναι η ευκολία κατασκευής πολύπλοκων σχημάτων και δομών, το σχετικά χαμηλό κόστος, η μεγάλη ποικιλία συστάσεων, ιδιοτήτων και μορφών. Οι εφαρμογές τους κυμαίνονται από εμφυτεύματα μέχρι τραχειακά αγγεία και CDDS. Σύνθετα: Προκύπτουν από το συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων υλικών προκειμένου να συνδυαστούν οι ιδιότητές τους προκειμένου το τελικό προϊόν να φέρει βελτιωμένες ιδιότητες. Συνήθως, συνθέτονται από τουλάχιστον μία ασυνεχή, ακινητοποιημένη φάση ή εμπεδισμένη συνεχή φάση (μήτρα). Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι σύνθετων βιοϋλικών, τα ινώδη, που είναι ίνες ακινητοποιημένες σε μήτρα, και τα επιμερισμένα, που είναι ισοτροπικά με αυξημένη ανθεκτικότητα. Τα πιο επιτυχημένα σύνθετα βιοϋλικά χρησιμοποιούνται στην οδοντιατρική ως υλικά συγκόλλησης ή αποκατάστασης. Φυσικά: Υπάρχουν μερικά υλικά που προέρχονται από τα ζώα ή τα φυτά που συνιστώνται για χρήση ως βιοϋλικά τα οποία αξίζουν προσοχής αφού ομοιάζουν με του ανθρώπινου σώματος. Τα φυσικά υλικά δεν προκαλούν προβλήματα τοξικότητας, μπορούν να μεταφέρουν ειδικές πρωτεΐνες και άλλα βιοχημικά εναύσματα, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ίαση των τραυμάτων ή στην ενσωμάτωση. Ωστόσο, μπορεί να προκαλέσουν προβλήματα στο ανοσολογικό σύστημα. Επιπλέον, μειονέκτημά τους είναι η τάση τους να αλλοιώνονται ή να αποσυντίθεται σε θερμοκρασίες κάτω από το σημείο τήξης τους. Ένα παράδειγμα φυσικού υλικού αποτελεί το κολλαγόνο υπό μορφή ινιδίου, το οποίο είναι μία βασική, ζωική πρωτεΐνη. 1.3 Ταξινόμηση των βιοϋλικών Όταν ένα συνθετικό υλικό τοποθετείται στο ανθρώπινο σώμα, ο ιστός αντιδρά με το εμφύτευμα με διάφορους τρόπους ανάλογα με τον τύπο του υλικού. Ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης των ιστών εξαρτάται από την αντίδραση του ιστού στην επιφάνεια του εμφυτεύματος. Γενικά, υπάρχουν τέσσερις ομάδες κατά τις οποίες ένα βιοϋλικό μπορεί να περιγραφεί ή να κατηγοριοποιηθεί αντιπροσωπεύοντας τις αντιδράσεις των περιβαλλόντων ιστών [4]: Βιοαδρανές: Ο όρος βιοαδρανές αναφέρεται σε κάθε υλικό που τοποθετείται στο ανθρώπινο σώμα και έχει ελάχιστη αλληλεπίδραση με τον ιστό που το περιβάλλει. Τέτοια υλικά είναι τα μέταλλα, όπως ο ανοξείδωτος χάλυβας και το τιτάνιο, η αλούμινα, μερικές φορές το ζιρκόνιο και το υψηλού μοριακού βάρους πολυαιθυλένιο. Βιοενεργό: Βιοενεργό είναι το υλικό που προκαλεί μια συγκεκριμένη βιολογική αντίδραση στη σύνδεσή του που έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία βιοχημικών συνδέσμων μεταξύ της επιφάνειας του υλικού και του ιστού. Έτσι δημιουργεί ένα περιβάλλον συμβατό για οστεογένεση με την ανάπτυξη του ασβεστοποιημένου συνδέσμου ως ένα φυσικό δεσμό μεταξύ ζωντανού και μη ζωντανού υλικού. Αυτή η γενική ιδέα έχει επεκταθεί προκειμένου να συμπεριλάβει ένα μεγάλο αριθμό βιοενεργών υλικών με μεγάλου εύρους αναλογιών συνδεσιμότητας και λεπτότητα συνδέσμων στρωμάτων, όπως βιοενεργές υάλους, υαλοκεραμικά, πυκνά κεραμικά φωσφορικού ασβεστίου (π.χ. συνθετικός HAp), βιοενεργά σύνθετα όπως μείγμα Pt- HAp και μια σειρά βιοενεργών επικαλυπτικών υλικών. Ο μηχανισμός, ο χρόνος, η αντοχή και το πάχος της σύνδεσης ποικίλουν ανάλογα με το υλικό. Βιοαποικοδομήσιμο: Πρόκειται για τα υλικά που μετά την τοποθέτησή τους στο ανθρώπινο σώμα αρχίζουν αργά και βαθμιαία να διαλύονται και μετέπειτα να αντικαθίστανται από ανεπτυγμένους ιστούς (όπως οστά) χωρίς τοξικότητα και απόρριψη. Τυπικά παραδείγματα βιο- αποικοδομήσιμων υλικών είναι το φωσφορικό τριασβέστιο (Ca3(PO)4) και 19 Κεφάλαιο 1: Βιοϋλικά το συμπολυμερές πολυλακτικού - πολυγλυκολικού οξέως. Το οξείδιο του ασβεστίου, το ανθρακικό ασβέστιο και o γύψος είναι άλλα γνωστά υλικά τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί κατά τις τελευταίες τρεις δεκαετίες. Βιοτοξικό: Προκαλούν διάφορες χημικές ή γαλβανικές διεργασίες και αντιδράσεις με αποτέλεσμα την ατροφία, την παθολογική μεταβολή ή και την απόρριψη των ζωντανών ιστών που βρίσκονται κοντά τους. Τέτοια υλικά είναι τα κράματα καδμίου, βαναδίου και άλλων τοξικών στοιχείων, ο ανθρακούχος χάλυβας και τα καρβίδια. 1.4 Εφαρμογές των βιοϋλικών Τις τελευταίες δεκαετίες, έχει επιτευχθεί αξιόλογη πρόοδος στην ανάπτυξη διάφορων βιοϋλικών για ποικίλες ιατρικές εφαρμογές, καθώς είναι υλικά τα οποία μπορούν να έρθουν σε επαφή με σωματικά υγρά και ιστούς με ελάχιστες επιδράσεις αντίδρασης ή απόρριψης από το σώμα. Στόχος των ερευνών είναι η ανάπτυξη τεχνητών υλικών για χρήση στο ανθρώπινο σώμα προκειμένου να αναστυλώσουν και να αναπτύξουν τη φυσιολογική λειτουργία και να βελτιώσουν την ποιότητα ζωής. Ορισμένες από τις σημαντικότερες εφαρμογές των βιοϋλικών είναι [4]: Ορθοπεδική: Όλοι οι τύποι βιοϋλικών χρησιμοποιούνται σε ορθοπεδικές εφαρμογές. Τα μεταλλικά υλικά χρησιμοποιούνται συνήθως για μέλη που υπόκεινται σε υψηλές φορτίσεις (περόνη, ισχίο, τεχνητές οδοντοστοιχίες κ.α.) Τα κεραμικά, όπως η αλούμινα και το ζιρκόνιο, χρησιμοποιούνται για εφαρμογές που απαιτούν ανθεκτικότητα (π.χ. αντικαταστάσεις αρθρώσεων), ενώ ο υδροξυαπατίτης χρησιμοποιείται στις αρθρώσεις των οστών για καλύτερη ενσωμάτωση των εμφυτευμάτων. Τα πολυμερή, όπως το υψηλού μοριακού βάρους πολυαιθυλένιο, χρησιμοποιούνται ως ευκρινείς επιφάνειες έναντι των κεραμικών συστατικών στις αντικαταστάσεις των αρθρώσεων. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η πορώδης αλούμινα για την αντικατάσταση μεγάλων τμημάτων των οστών που πρέπει να απομακρυνθούν λόγω ασθένειας. Καρδιολογική: Πολλά διαφορετικά βιοϋλικά χρησιμοποιούνται στις καρδιαγγειακές εφαρμογές εξαιτίας των ειδικών ιδιοτήτων και του σχεδιασμού, όπως ο άνθρακας στις τεχνητές βαλβίδες της καρδιάς. Οδοντιατρική: Τα μεταλλικά βιοϋλικά έχουν χρησιμοποιηθεί ως βελόνα στα οδοντικά εμφυτεύματα και ως μέρη ορθοδοντικών μηχανισμών. Τα κεραμικά, όπως η αλούμινα και η οδοντιατρική πορσελάνη χρησιμοποιούνται ως οδοντικά εμφυτεύματα, ενώ ο υδροξυαπατίτης ως επικάλυψη των μεταλλικών βελονών και ως πληρωτικό των μεγάλων οστέινων πόρων που προέκυψαν από ασθένεια ή από τραύμα. Τα πολυμερή έχουν, επίσης, ορθοδοντική εφαρμογή στις τεχνητές οδοντοστοιχίες και στις μασέλες. Πλαστική χειρουργική: Υλικά όπως η σιλικόνη έχουν χρησιμοποιηθεί στην πλαστική χειρουργική σε διάφορες περιπτώσεις (π.χ. αύξηση στήθους, ανάπλαση της επιδερμίδας, αντικατάστασης του κοχλία των αυτιών κ.α.). Οφθαλμολογία: Φακοί επαφής. Ιατρικές συγκολλητικές χειρουργικές ραφές. Συνθετικά αιμοφόρα αγγεία. Συστήματα τοπικής μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκων. Βιοτεχνολογία: Ανάπτυξη κυττάρων, σχηματισμός μορίων, διατήρηση της γονιμότητας των εμφυτευμάτων στα βοοειδή, διάγνωση γενετικών παρατάξεων και ανάπτυξη κυττάρων σιλικόνης «βιογοφών». Η ομοιότητα αυτών των εφαρμογών είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ των βιολογικών συστημάτων και των συνθετικών ή τροποποιημένων φυσικών υλικών. Εικόνα 1: Παραδείγματα εφαρμογών των βιοϋλικών [2]. 21 Κεφάλαιο 2: Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου Η διαρκής προσπάθεια των ερευνητών ως προς τις διάφορες θεραπευτικές αγωγές είναι η μεγιστοποίηση της θεραπευτικής δράσης των φαρμάκων και παράλληλα, η ελαχιστοποίηση των παρενεργειών τους. Τα φάρμακα που χορηγούνται με τις συμβατικές μεθόδους (στοματική, ρινική, πρωκτική, διαδερμική ή ενέσιμη χορήγηση) διασπείρονται σε όλο το ανθρώπινο σώμα και όχι αποκλειστικά στο μέλος που νοσεί επιβαρύνοντας ολόκληρο τον οργανισμό. Επιπλέον, πολλές ασθένειες (π.χ. καρκίνος, θρομβώσεις, οστεομυελίτιδα, τοπικές λοιμώξεις, γλαύκωμα κ.α.) είναι δύσκολο να θεραπευτούν με συστηματική αγωγή καθώς υπάρχουν περιορισμοί λόγω της πολυπλοκότητας και των σοβαρών συνεπειών τους. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά φάρμακα που μπορούν να χορηγηθούν με έναν τρόπο που, όχι μόνο βελτιώνει την αποτελεσματικότητα και ασφάλειά τους, αλλά σε μερικές περιπτώσεις καταλήγει σε νέες θεραπείες. Τα τελευταία χρονιά ένας μεγάλος αριθμός ερευνητών επικεντρώθηκε στο σχεδιασμό και τη δημιουργία νέων συστημάτων τοπικής μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης των φαρμάκων (control drug delivery system, CDDS). Τα CDDS διαφέρουν στο ότι παραμένουν στην περιοχή του σώματος για μία παρατεταμένη περίοδο και απελευθερώνουν το φάρμακο με συνεχή, κυμαινόμενο, συνεχώς μειούμενο ή ακόμα και περιοδικά παλμικό τρόπο. Ο όρος «συστήματα τοπικής μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκου» αναφέρεται τόσο στο σχεδιασμό του φαρμάκου όσο και στον τρόπο χορήγησής του. Πρόκειται για σχηματισμούς ή διατάξεις που μεταφέρουν θεραπευτικές ουσίες σε επιλεγμένες περιοχές του σώματος παρέχοντας, παράλληλα, την έγκαιρη και τη βέλτιστη απελευθέρωσή τους. Σημειώνεται ότι το σύστημα από μόνο του δε θεραπεύει, αλλά βελτιώνει την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια των θεραπευτικών ουσιών που μεταφέρει [5]. Κεφάλαιο 2 Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου 2.1 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των CDDS Ενώ η έρευνα για νέες θεραπευτικές μεθόδους και φάρμακα είναι συνεχής, η αύξηση της αποτελεσματικότητας των ήδη υπαρχόντων φαρμάκων μπορεί να επιφέρει σημαντική βελτίωση στη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Μια ελκυστική εκδοχή για τη μεταφορά των φαρμακολογικά ενεργών συστατικών είναι η ελεγχόμενη απελευθέρωσή τους από κατάλληλα CDDS τα οποία εμφυτεύονται κοντά στο όργανο που νοσεί καθώς εμφανίζουν πληθώρα πλεονεκτημάτων [6]: Υψηλές τοπικές συγκεντρώσεις των θεραπευτικών ουσιών με παρατεταμένη διάρκεια. Ορισμένα συστήματα έχουν τη δυνατότητα να εγκαθίστανται και να διατηρούν την τοπική φαρμακευτική δράση είτε αποτρέποντας την έκχυση του φαρμάκου από τα τοιχώματα των αρτηριών είτε χρησιμοποιώντας φορείς που παρατείνουν τη διάρκεια της απελευθέρωσης. Βελτίωση της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου καθώς παρατείνεται η δράση του και ελέγχεται η αποδέσμευσή του στον οργανισμό. Ελαχιστοποίηση των ανεπιθύμητων παρενεργειών. Βελτιστοποίηση της δοσολογίας, καθώς απαιτούνται μικρότερες και λιγότερες σε πλήθος δόσεις. Μείωση της διαφορετικότητας της φαρμακοκινητικής από ασθενή σε ασθενή. Περιορισμός της προληπτικής φαρμακευτικής αγωγής για φάρμακα που χορηγούνται συστηματικά. Απλούστευση και αριστοποίηση της θεραπευτικής αγωγής. Καλύτερη συμμόρφωση των ασθενών. Τοπική μεταφορά θεραπευτικών ουσιών με σχετικά μικρό χρόνο ημιζωής, όπως οι πρωτεΐνες και τα λιπίδια, και άλλων βιολογικών ευμετάβλητων βιομορίων, όπως τα νουκλεϊκά οξέα και τα ολιγονεουκλεοτίδια, με ελάχιστες απώλειες στη θεραπευτική τους δράση. Διευκόλυνση της μεταφοράς μακρομορίων και συστατικών χαμηλής διαλυτότητας. Προστασία του φαρμάκου από την οξείδωση, λόγω φωτός και ατμοσφαιρικού οξυγόνου. Μείωση της τοξικότητας των ουσιών. Μείωση της πτητικότητας των ουσιών. 23 Κεφάλαιο 2: Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου Αποφυγή ερεθισμού είτε του γαστρεντερικού συστήματος από προϊόντα εσωτερικής λήψης, είτε του δέρματος από προϊόντα εξωτερικής χρήσης. Κάλυψη δυσάρεστων οσμών ή γεύσεων πολλών ουσιών. Τροποποίηση των φυσικών ιδιοτήτων χημικών ουσιών, όπως μετατροπή υγρής ουσίας σε ψευδοστερεά μορφή. Μείωση των υγροσκοπικών ιδιοτήτων των υλικών. Αλλαγή των επιφανειακών ιδιοτήτων μίας ουσίας. Βελτίωση των ιδιοτήτων ροής. Αύξηση της σταθερότητας διαφόρων ουσιών. Αντιμετώπιση προβλημάτων ασυμβατότητας μεταξύ ενεργών συστατικών και διαχωρισμός ουσιών με ασύμβατες ιδιότητες. Ευκολία στην αποθήκευση. Ωστόσο κατά το σχεδιασμό και κυρίως κατά την εφαρμογή τέτοιων συστημάτων θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή και στα μειονεκτήματά τους που είναι: Πιθανή τοξικότητα και μη βιοσυμβατότητα του υλικού. Παραπροϊόντα της χημικής αποικοδόμησης. Πιθανή απαίτηση χειρουργικής επέμβασης για την απομάκρυνσή τους. Πιθανή σωματική δυσφορία του ασθενούς λόγω του εμφυτευμένου συστήματος. Υψηλό κόστος σε σχέση με τις παραδοσιακές φαρμακευτικές μεθόδους. 2.2 Υλικά που χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρμάκων Κάποιοι από τους κυριότερους φορείς φαρμάκων είναι [5]: Λιποσώματα: Τα λιποσώματα είναι κλειστές δομές που αποτελούνται από μία ή από περισσότερες διπλοστοιβάδες οι οποίες εναλλάσσονται με υδατικά τμήματα. Οι διπλοστοιβάδες αυτές έχουν ως κύριο συστατικό τα φωσφολιπίδια καθώς και άλλες αμφίφιλες ουσίες. Σχηματίζονται μόλις τα λιπίδια διασπαρθούν σε υδατικά μέσα δίνοντας πληθυσμούς σωματιδίων που το μέγεθος τους κυμαίνεται από δέκα νανόμετρα ως αρκετά μικρόμετρα. Η μορφολογία των λιποσωμάτων τους επιτρέπει τον εγκλωβισμό διαφόρων ουσιών τόσο στα υδατικά διαμερίσματα όσο και στην μεμβράνη αυτών. Η αξία των λιποσωμάτων ως μοντέλα μεμβρανών έγκειται στο γεγονός ότι τα λιποσώματα παρασκευάζονται από φυσικά συστατικά και η λιποσωμική μεμβράνη σχηματίζει διπλοστοιβάδα η οποία σε βασικές γραμμές είναι όμοια με τις φυσικές κυτταρικές μεμβράνες. Η ομοιότητα μεταξύ λιποσωμάτων και φυσικών μεμβρανών μπορεί να αυξηθεί με εκτεταμένη χημική τροποποίηση της λιποσωμικής μεμβράνης έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για στόχευση φαρμάκων ή για ανοσοδιαμορφώσεις τόσο in vitro όσο και in vivo [7]. Οργανικά και συνθετικά πολυμερή: Τα πολυμερή κατασκευάζονται σε ποικίλα σχήματα και μεγέθη, γεγονός που διευκολύνει τη χρήση τους ως φορείς φαρμάκων, αφού το φάρμακο μπορεί να συνδεθεί με το πολυμερές αν αυτό είναι σε μορφή ράβδου ή να εισχωρήσει στη δομή του αν αυτό είναι κυκλικό. Επίσης, είναι δυνατόν να σχεδιαστούν έτσι ώστε να απελευθερώνουν το φάρμακο με σταθερό ρυθμό για μεγάλο χρονικό διάστημα ή μετά από παρατεταμένα χρονικά διαστήματα. Ακόμη, μπορεί να συνδεθούν με αντισώματα και να μεταφέρουν το φάρμακο σε συγκεκριμένη περιοχή του σώματος. Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται ως CDDS μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: βιοαποικοδομήσιμα και μη βιοαποικοδομήσιμα. Τα βιοαποικοδομήσιμα πλεονεκτούν λόγω της αυτοεξουδετέρωσης, παρέχοντας τη δυνατότητα μη απομάκρυνσής τους από την περιοχή της εμφύτευσης μετά τη χρήση τους. Η βιοαποικοδόμηση μπορεί να είναι ενζυμικής, χημικής ή μικροβιακής προέλευσης και να ελέγχεται με την ενσωμάτωση μιας ποικιλίας ασταθών ομάδων [8]. Κεραμικά: Επειδή τα κεραμικά είναι βιοσυμβατά, επαναπορροφήσιμα και πορώδη, γίνονται προσπάθειες να χρησιμοποιηθούν ως CDDS κυρίως για τη θεραπεία σκελετικών ασθενειών. Σε αυτό συμβάλει και το γεγονός ότι η κατασκευή τους είναι εύκολη και χαμηλού κόστους. Σήμερα υπάρχουν τουλάχιστον 5 διαφορετικοί τύποι κεραμικών CDDS σε χρήση με πιο συνήθεις τους: ανόργανο οστεάλευρο, κεραμικό σύστημα οξειδίων αργιλίου, ασβεστίου και φωσφόρου, υδροξυαπατίτης, φωσφορικό τριασβέστιο και σύνθετα συστήματα φωσφορικού τριασβεστίου, αμινοξέων και αντιβιοτικών. Επίσης, άλλα κεραμικά συστήματα που έχουν μελετηθεί ως εμφυτεύσιμα CDDS είναι τα κεραμικά οξείδια ψευδαργύρου, ασβεστίου και φωσφόρου, τα υαλοκεραμικά και τα εμποτισμένα με πολυμερή κεραμικά. Σημειώνεται ότι, ενώ στα κεραμικά ασβεστίου και φωσφόρου CDDS το φάρμακο απορροφάται, συνήθως, στην επιφάνειά τους, ενώ στα αντίστοιχα τσιμέντα ενσωματώνεται σε όλο τον 25 Κεφάλαιο 2: Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου όγκο τους, αφού προστίθεται σε μία από τις δύο φάσεις, παρατείνοντας με αυτόν το τρόπο το χρόνο απελευθέρωσής του. Μονοκλωνικά αντισώματα: Πρόκειται για αντισώματα εργαστηριακά κατασκευασμένα έτσι ώστε να στοχεύουν αντιγόνα με τεράστια ακρίβεια. Συγκεκριμένα συνδέονται με το φάρμακο και το καθοδηγούν στο κατάλληλο κύτταρο. Έξυπνα φάρμακα: Ονομάζονται και «προφάρμακα» (prodrugs) και έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να δρουν μόνο όταν ενεργοποιούνται από βασικά συστατικά του σώματος, όπως τα ένζυμα. Πρόκειται για συστατικά που υφίστανται βιομεταμόρφωση πριν εκδηλώσουν τη φαρμακευτική τους επίδραση. 2.3 Χαρακτηριστικά των CDDS Σκοπός όλων των σχεδιασμών CDDS είναι να καθοδηγούν τα φάρμακα άθικτα σε συγκεκριμένα μέρη του σώματος διαμέσου ενός μέσου που μπορεί να ελέγξει τη θεραπευτική αγωγή μέσω ενός φυσικού ή χημικού διεγέρτη. Κατά συνέπεια για να είναι αποτελεσματικό ένα CDDS θα πρέπει να είναι ικανό [6]: να αποκρύπτει τις δραστικές ουσίες ώστε να αποφεύγεται η βιοχημική τους διάσπαση, η αναρρόφησή τους από τα ενδοθηλιακά δίκτυα και η καταστροφή των υγιών κυττάρων και να κατευθύνει και να συσσωρεύει γύρω από την περιοχή που νοσεί τις δραστικές ουσίες, να διαπερνά τα ασθενή κύτταρα και να τα θεραπεύει ή να τα καταστρέφει, ανάλογα με τον τύπο της ασθένειας. Το ιδανικό, λοιπόν, CDDS θα πρέπει να είναι: αδρανές, βιοσυμβατό, αυξημένης μηχανικής αντοχής, ικανό να μεταφέρει υψηλές συγκεντρώσεις φαρμάκου, ανεκτό από τον ασθενή, κατάλληλου μεγέθους και σχήματος, ασφαλές από τυχαία απελευθέρωση, απλό στην εφαρμογή και στην απομάκρυνση και εύκολο στην κατασκευή και στην αποστείρωση. 2.4 Μηχανισμοί ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκου από CDDS Ο σκοπός των περισσότερων CDDS είναι η επίτευξη ενός τρόπου μεταφοράς και απόδοσης του φαρμάκου που θα επιφέρει ένα υψηλό επίπεδο συγκέντρωσής του στο αίμα για μεγάλη χρονική περίοδο. Στην Εικόνα 2: φαίνεται σχηματικά η μεταβολή της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο αίμα με την πάροδο του χρόνου. Παρατηρείται ότι με τις συμβατικές μεθόδους χορήγησης φαρμάκων (ενέσεις, χάπια κ.α.), η συγκέντρωση αυξάνεται έντονα αμέσως μετά τη χορήγηση μέχρι μία μέγιστη τιμή, ανώτερη των επιθυμητών επιπέδων που μπορεί να είναι και τοξική. Στη συνέχεια μειώνεται μέχρι την επόμενη χορήγηση σε τιμές μικρότερες από αυτές στις οποίες το φάρμακο είναι αποτελεσματικό. Αντίθετα, όταν το φάρμακο χορηγείται μέσω κάποιου CDDS, τα επίπεδά του παραμένουν σταθερά μεταξύ της επιθυμητής μέγιστης και ελάχιστης περιοχής για μία παρατεταμένη χρονική περίοδο, που ανάλογα με την κατασκευή του CDDS και τις απαιτήσεις της χορήγησης μπορεί να είναι από μερικές ώρες ή μήνες έως και χρόνια [10]. Εικόνα 2: Συγκέντρωση φαρμάκου στο αίμα με Α) συμβατικές μεθόδους χορήγησης και Β) CDDS [9] Τα σύγχρονα CDDS είναι ικανά, εκτός από το να παρατείνουν το χρόνο απόδοσης του φαρμάκου, να το καθοδηγούν σε στοχευμένο, συγκεκριμένο κύτταρο, ιστό ή περιοχή αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο την αποτελεσματικότητά του. Δύο είναι οι κύριοι μηχανισμοί που καθορίζουν τη διεύθυνση απελευθέρωσης του φαρμάκου: η παθητική και η ενεργητική 27 Κεφάλαιο 2: Συστήματα Τοπικής Μεταφοράς και Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Φαρμάκου στόχευση. Παράδειγμα της παθητικής στόχευσης αποτελεί η επιλεκτική συσσώρευση των χημειοθεραπευτικών αντιδραστηρίων σε διαλυτούς όγκους ως αποτέλεσμα της ενισχυμένης αγγειακής διαπερατότητας των ιστών του όγκου σε σχέση με τους υγιείς ιστούς. Από την άλλη, ενεργή στόχευση μπορεί να επιτευχθεί με χρήση της λειτουργικής επιφάνειας του φορέα του φαρμάκου που έχει περιφερειακούς υποκαταστάτες, οι οποίοι αναγνωρίζονται επιλεκτικά από τους υποδοχείς της επιφάνειας των στοχευμένων κυττάρων επιτρέποντας μια πιο ακριβή στόχευση. Ακόμη, η απόδοση του φαρμάκου μπορεί να είναι συνεχόμενη ή παλμική ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο φορέα. Η συνεχόμενη, παρατεταμένη απελευθέρωση με ελεγχόμενο ρυθμό επιτυγχάνεται με διάχυσή του από το φορέα ή σταδιακή διάσπαση του φορέα. Η παλμική απελευθέρωση μιμείται τον τρόπο που το σώμα παράγει ορμόνες και επιτυγχάνεται με φορείς που ανταποκρίνονται σε συγκεκριμένα ερεθίσματα. Οι μηχανισμοί απελευθέρωσης του φαρμάκου είναι [10]: Εκρόφηση στην περίπτωση επιφανειακά συνδεδεμένων ή προσροφημένων φαρμάκων. Διάχυση διαμέσου της μήτρας που λειτουργεί ως φορέας με το ρυθμό απελευθέρωσης να μειώνεται με το πέρασμα του χρόνου καθώς η δραστική ουσία έχει μία προοδευτικά μεγαλύτερη απόσταση να διανύσει και συνεπώς απαιτείται μεγαλύτερης διάρκειας διάχυση (Εικόνα 3:α). Διάχυση διαμέσου του εξωτερικού επιστρώματος του φορέα στην περίπτωση συστήματος τύπου δεξαμενής με το ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου να παραμένει σχεδόν σταθερός (Εικόνα 3:β). Διάβρωση της μήτρας που λειτουργεί ως φορέας. Συνδυασμός της διαδικασίας διάχυσης και διάβρωσης. Διόγκωση του συστήματος με απορρόφηση νερού ή άλλων σωματικών υγρών, που το εξαναγκάζει να διαχύσει το φάρμακο στο εξωτερικό περιβάλλον. Η διόγκωση μπορεί να ενεργοποιηθεί από εξωτερικούς παράγοντες όπως το pH, η θερμοκρασία και η ιονική ισχύς (Εικόνα 3:γ). Βιοαποικοδόμηση του φορέα μέσα στο σώμα εξαιτίας κάποιας φυσικής, βιολογικής διαδικασίας, όπως η υδρόλυση, γεγονός που εξαλείφει και την ανάγκη απομάκρυνσής του μετά το πέρας της δράσης του φαρμάκου (Εικόνα 3:δ). Εικόνα 3: Μεταφορά και απελευθέρωση φαρμάκου από ένα τυπικό CDDS α) τύπου μήτρας με διάχυση, β) τύπου δεξαμενής με διάχυση, γ) με διόγκωση, δ) με βιοαποικοδόμηση [10]. 29 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης Οστικά ελλείμματα είναι δυνατόν να επέλθουν από τραυματισμούς, κατάγματα, αφαίρεση μεγάλων όγκων ή από άλλες παθολογικές καταστάσεις. Η χρήση υλικών σε αυτές τις περιπτώσεις έχει σκοπό τόσο τη λειτουργική (μηχανική υποστήριξη και διατήρηση της συνοχής του οστού) όσο και την αισθητική αποκατάσταση. Η στρατηγική αντιμετώπιση τέτοιων καταστάσεων περιλαμβάνει τη χρήση οστικών μοσχευμάτων, μετάλλων, πολυμερών, κεραμικών ή και την καλλιέργεια κυττάρων σε συνθετικές τρισδιάστατες μήτρες με σκοπό την αναγέννηση των οστών. Σκοπός των υλικών οστικής αποκατάστασης είναι η ανακατασκευή των οστών είτε προσωρινά είτε μόνιμα. Στην πρώτη περίπτωση το υλικό οστικής αποκατάστασης πρέπει να αποικοδομείται και στη συνέχεια να αντικαθίσταται από οστό, ενώ στη δεύτερη, πρέπει να αποκαταστήσει μόνιμα το οστό. Το ιδανικό οστικό μόσχευμα παρουσιάζει τέσσερα κύρια χαρακτηριστικά: 1. Οστεοενσωμάτωση (Osteointegration): η ικανότητα ανάπτυξης χημικών δεσμών με την επιφάνεια του οστού χωρίς την παρέμβαση στρώματος από ινώδη ιστό. 2. Οστεοαγωγιμότητα (Osteoconduction): η ικανότητα του υλικού μεταμόσχευσης να υποστηρίζει την ανάπτυξη οστού πάνω στην επιφάνειά του. 3. Oστεοεπαγωγή (Osteoinduction): η ικανότητα του μοσχεύματος να προκαλεί τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων από τους υπερκείμενους ιστούς σε οστεοβλαστικά φαινότυπα. 4. Oστεογένεση (Osteogenesis): η ικανότητα του μοσχεύματος να δημιουργεί καινούργιο οστό από οστεοαναπαραγωγικά κύτταρα που είναι ενσωματωμένα σε αυτό. Όλες οι παραπάνω ιδιότητες απαντιούνται μόνο στα αυτομοσχεύματα, δηλαδή από μοσχεύματα που προέρχονται από τμήματα οστού που λαμβάνεται Κεφάλαιο 3 Υλικά Οστικής Αποκατάστασης από το σώμα του ίδιου του ασθενούς. Στα αλλομοσχεύματα συναντάμε την ικανότητα της οστεοενσωμάτωσης και της οστεοαγωγιμότητας. Μερικές φορές παρουσιάζουν και την ικανότητα της οστεοεπαγωγής, αλλά ποτέ αυτή της οστεογένεσης γιατί από τα υλικά αυτά έχουν αφαιρεθεί όλα τα ζωντανά κυτταροειδή συστατικά μέρη. Τα συνθετικά οστικά μοσχεύματα φωσφορικού ασβεστίου πληρούν τη δυνατότητα της οστεοενσωμάτωσης και της οστεοαγωγιμότητας. Από μηχανικής άποψης, τα συνθετικά υλικά αποκατάστασης είναι απαραίτητο να παρουσιάζουν αντοχή ανάλογη αυτής του φλοιώδη/σπογγώδους οστού που πρέπει να αντικατασταθεί. Για αυτό πρέπει το υλικό του μοσχεύματος να παρουσιάζει ένα συντελεστή ελαστικότητας ανάλογο με αυτόν του οστού, έτσι ώστε να αποτρέπεται η εμφάνιση αστοχίας λόγω φόρτισης. Επίσης, είναι αναγκαίο να διαθέτει επαρκή σκληρότητα, έτσι ώστε να αποφεύγεται η θραύση από κόπωση λόγω κυκλικών φορτίσεων [7]. 3.1 Τσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου (CPCs) Τα τσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου ανακαλύφθηκαν από την R.Z. LeGeros το 1982 και το πρώτο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας απονεμήθηκε στους W.E. Brown και L.C. Chow το 1986 [1]. Το πρώτο εμπορικό προϊόν τσιμέντου φωσφορικού ασβεστίου εισήχθηκε στην αγορά το 1990 για τη θεραπεία γναθοπροσωπικών ατελειών και καταγμάτων. Από τότε έχουν χρησιμοποιηθεί και σε άλλες εφαρμογές, όπως αυξητική οστού, ενίσχυση οστεοπορωτικών καταγμάτων, στερέωση μεταλλικών εμφυτευμάτων σε αποδυναμωμένα οστά, σε κατάγματα σπονδυλικής στήλης και σπονδυλοπλαστική. Τα κύρια πλεονεκτήματά τους προκύπτουν από την ικανότητά τους να σκληραίνουν in vivo μέσω της διαδικασίας πήξης σε χαμηλή θερμοκρασία. Το γεγονός ότι μετά από ανάμειξη το CPC σχηματίζει μία παχύρευστη εύπλαστη πάστα, η οποία σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να είναι ενέσιμη κατά τη διάρκεια μιας εγχείρησης, τα καθιστά οφέλημα σε μια πληθώρα κλινικών περιπτώσεων. Αυτό είναι και το πλεονέκτημά τους έναντι των συμβατικών κεραμικών φωσφορικού ασβεστίου. Λόγω του ότι η αντίδραση πήξης των CPCs δεν είναι εξώθερμη, μπορούν να ενσωματωθούν διάφορα φάρμακα και βιολογικά μόρια και για αυτό θεωρούνται καλοί υποψήφιοι για συστήματα μεταφοράς και αποδέσμευσης φαρμάκων, όπως αντιβιοτικά, αντικαρκινικά, αντιφλεγμονώδη κτλ. Συγκριτικά με άλλα ενέσιμα βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται ως μεταφορείς φαρμάκων, τα CPCs έχουν κάποια ξεχωριστά χαρακτηριστικά κατά τη στόχευση των οστών: 31 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης εξαιρετική βιοδραστικότητα και οστεαγωγιμότητα, ικανότητα δημιουργίας ισχυρού δεσμού με το οστό και μπορούν να εγκλωβίζουν δραστικές ενώσεις (με ένα ποσοστό φόρτωσης που εξαρτάται από τη σύνθεση και τη μικροδομή τους). Ωστόσο, τα CPCs έχουν και ορισμένα μειονεκτήματα, που σχετίζονται κυρίως με την κακή μηχανική απόδοσή τους, που περιορίζει το πεδίο εφαρμογής τους σε περιπτώσεις μηδενικού ή ελάχιστου φορτίου. Λόγω του εγγενούς πορώδους των CPCs, η αντοχή τους είναι μικρότερη από αυτή των κεραμικών φωσφορικού ασβεστίου. Η έλλειψη ικανοποιητικής ικανότητας εγχύσεως και σε ορισμένες περιπτώσεις ο αργός ρυθμός απορρόφησής τους είναι άλλοι περιορισμοί των CPCs με συνέπεια να απαιτείται περαιτέρω βελτίωση των υλικών αυτών. Τις τελευταίες δεκαετίες, σημαντική προσπάθεια και μεγάλος αριθμός μελετών έχουν αφιερωθεί στο συνδυασμό της δυνατότητας των CPCs να αναγεννούν εγγενή οστό με την ικανότητά τους να ενσωματώνουν φάρμακα ή άλλα δραστικά μόρια. 3.1.1 Σύσταση των CPCs Τα CPCs παρασκευάζονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες με ανάμειξη σκόνης (κονία) με μια υδατική φάση. Σε αυτό οφείλουν και την εμπειρική τους ονομασία «τσιμέντα». Η στερεά φάση αποτελείται από δύο ή και περισσότερα άλατα που περιέχουν στη σύστασή τους φωσφορικά και ασβέστιο και η υγρή φάση είναι συνήθως το νερό ή κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα μονόξινου (Na2HPO4) ή δισόξινου (NaH2PO4) φωσφορικού νατρίου. Σε αντίθεση με τα ακρυλικά οστικά τσιμέντα, τα οποία σκληραίνουν με μια αντίδραση πολυμερισμού, για τη σκλήρυνση των CPCs είναι υπεύθυνη η σύμπλεξη των βελονοειδών κρυστάλλων υδροξυαπατίτη που προκύπτουν από την αντίδραση υδρόλυσης της ένωσης του φωσφορικού ασβεστίου που περιέχεται στη σκόνη (Εικόνα 4:). Η διαδικασία σχηματισμού κρυστάλλων υδροξυαπατίτη κατά την ανάμειξη είναι η εξής: όταν φωσφορικά άλατα αναμιχθούν σε υδάτινο περιβάλλον, παρατηρούνται μηχανισμοί διάλυσης, καθίζησης και τέλος ακολουθεί μια διεργασία μετασχηματισμού φάσης η οποία οδηγεί σε σχηματισμό διαφόρων τύπων φωσφορικών αλάτων, ανάλογα με τη σταθερά διαλυτότητας των διαφόρων αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου και με το pH που πραγματοποιείται η διαδικασία. Η σταθερά διαλυτότητας και το pΗ των διαφόρων αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου καθορίζει και το ιξώδες του τελικού προϊόντος [11]. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται αρκετοί τύποι ενώσεων του φωσφορικού ασβεστίου, οι οποίοι κατά καιρούς έχουν χρησιμοποιηθεί ως πρώτες ύλες για την παραγωγή ποικίλων τύπων βιοϋλικών. Οι πιο γνωστοί είναι: υδροξυαπατίτης (ΗΑp), ανθρακικός απατίτης (CA), β-φωσφορικό τριασβέστιο (β-TCP), α- φωσφορικό τριασβέστιο (α-TCP), φωσφορικό τετρασβέστιο (TTCP), άνυδρο φωσφορικό διασβέστιο (DCPA), μονοένυδρο φωσφορικό ασβέστιο (MCPM), διένυδρο φωσφορικό διασβέστιο ή βρουσίτης (DCPD) και φωσφορικό οκτασβέστιο (OCP). Τα HAp, β-TCP, CA χρησιμοποιούνται ως υποκατάστατα οστών. Τα a-TCP, TΤCP, DCPD, OCP χρησιμοποιούνται ευρέως ως συστατικά των CPCs [12]. Πίνακας 1: Φάσεις των αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου: γραμμομοριακός λόγος ασβεστίου προς φωσφορικά και αρνητικός λογάριθμος των ιοντικών γινομένων διαλυτότητας στο νερό στους 25οC [13]. Ονομασία Χημικός τύπος Συντ/φία Ca/P Log(Kip) Μονοένυδρο φωσφορικό ασβέστιο Ca(H2PO4)2∙H2O MCPM 0,50 1,14 Διένυδρο δισόξινο φωσφορικό ασβέστιο CaHPO4∙2H2O DCPD 1,00 6,59 Άνυδρο δισόξινο φωσφορικό ασβέστιο CaHPO4 DCPA 1,00 6,9 α-φωσφορικό τριασβέστιο α-Ca3(PO4)2 α-TCP 1,50 25,5 β-φωσφορικό τριασβέστιο β-Ca3(PO4)2 β-TCP 1,50 28,9 Φωσφορικό οκτασβέστιο Ca8H2(PO4)6∙5H2O OCP 1,3 96,6 Υδροξυαπατίτης Ca10(PO4)6(OH)2 ΗΑp 1,6 118,8 Φωσφορικό τετρασβέστιο Ca4P2O9 TTCP 2 38-40 Ανθρακικός απατίτης Ca10(PO4)6-x(CO3)x(OH)2 CA - - Παρά το μεγάλο αριθμό των πιθανών συνθέσεων, τα CPCs που εχουν αναπτυχθεί μέχρι τώρα έχουν κυρίως δύο διαφορετικά τελικά προϊόντα: καταβυθισμένο υδροξυαπατίτη (ΗΑp) ή βρουσίτη (DCPD). Αυτό στη πραγματικότητα είναι μια προβλέψιμη κατάσταση επειδή ο υδροξυαπατίτης 33 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης είναι το πιο σταθερό φωσφορικό ασβέστιο σε pΗ > 4.2 ενώ ο βρουσίτης το πλέον σταθερό σε pH < 4.2. Εικόνα 4: Κατηγοριοποίηση των CPCs [11]. 3.1.2 Μετασχηματισμοί μεταξύ των φάσεων των CPCs Παρά το γεγονός ότι ο υδροξυαπατίτης (HAp) είναι η πλέον ευσταθής φάση του φωσφορικού ασβεστίου, όταν οι συνθήκες είναι τέτοιες ώστε να πληρείται η συνθήκη υπερκορεσμού και για τις φάσεις των DCPD και OCP έχει αποδειχτεί ότι αυτές σχηματίζονται σαν πρόδρομες φάσεις οι οποίες στη συνέχεια μετασχηματίζονται σε HAp. Η τιμή του pH, η θερμοκρασία και ο υπερκορεσμός του διαλύματος έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν την καταβύθιση των διαφόρων φάσεων. Εν γένει, σε διαλύματα με pH μεταξύ 4 και 6 έχει βρεθεί πειραματικά ότι καταβυθίζεται κυρίως DCPD, ενώ σε pH μεταξύ 6 και 7 η φάση που επικρατεί είναι αυτή του OCP. Αυτό όμως δεν σημαίνει ότι αποκλείεται οι δύο φάσεις να σχηματίζονται σε περιοχές του pH που με βάση τα παραπάνω ανήκουν σε άλλες. Για ακόμα μεγαλύτερες τιμές του pH (7.0–8.5) η φάση που καταβυθίζεται είναι αυτή του HAp (Εικόνα 5:). Εικόνα 5: Διάγραμμα φάσης διαλυτότητας για το τριαδικό σύστημα Ca(OH)2 -H3PO4 - H2O στους 37oC. Μεταβολή του λογαρίθμου της συγκέντρωσης του ασβεστίου και του λογαρίθμου της συγκέντρωσης του φωσφόρου συναρτήσει του pH του διαλύματος. Επειδή το DCPD και το OCP είναι ασθενείς φάσεις, τη δημιουργία των κρυστάλλων τους ακολουθεί η υδρόλυσή τους σε κρυστάλλους HAp. Επίσης, μετασχηματισμοί μεταξύ των δύο ασταθών φάσεων έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία. Παρ’ όλα αυτά, υπάρχουν ορισμένες ουσίες οι οποίες έχουν βρεθεί ότι αναστέλλουν τη διεργασία μετασχηματισμού. Έτσι για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι το μαγνήσιο ακόμα και σε συγκεντρώσεις της τάξεως του 10-3 mol/L αναστέλλει την υδρόλυση του OCP. Αυτή η παρεμπόδιση οφείλεται πιθανότατα στο σχηματισμό συμπλόκων του μαγνησίου στα άκρα των κρυστάλλων που εμποδίζουν την απομάκρυνση μορίων νερού και ιόντων. Η δράση του μαγνησίου σαν σταθεροποιητή φάσεων επεκτείνεται και στην περίπτωση μετασχηματισμού του DCPD σε OCP. Έχει βρεθεί ότι η παρουσία των ιόντων μαγνησίου στο διάλυμα έχει ως συνέπεια την αναστολή της παραπάνω διεργασίας μετασχηματισμού. Αξίζει να σημειωθεί ότι η παρουσία του μαγνησίου σε υπέρκορο διάλυμα (πριν, δηλαδή, ξεκινήσει η καταβύθιση) έχει βρεθεί ότι ευνοεί τον σχηματισμό του DCPD, λιγότερο την καταβύθιση του OCP, ενώ αναστέλλει πλήρως τον σχηματισμό του HAp [14]. 3.1.2.1 Υδροξυαπατίτης Ο υδροξυαπατίτης (ΗΑp) είναι ένα άλας του φωσφορικού ασβεστίου στο οποίο κάποια από τα φωσφορικά ιόντα έχουν αντικατασταθεί από υδροξύλια, με 35 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης αποτέλεσμα το σχηματισμό της ένωσης Ca10(PO4)6(OH)2. Κρυσταλλογραφικά ανήκει σε ομάδα συμμετρίας εξαγωνικού πρίσματος με τέσσερις άξονες συμμετρίας. Μορφολογία Τέσσερεις μοναδιαίες κυψελίδες Παράμετροι πλέγματος Εικόνα 6: Κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά του υδροξυαπατίτη [16][17]. O υδροξυαπατίτης έχει βρει σημαντικές εμπορικές εφαρμογές. Xρησιμοποιείται σε λιπάσματα ως μείγμα με άλλα φωσφορικά άλατα, ενώ έχει αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλο υλικό πλήρωσης χρωματογραφικών στηλών. Με βάση το γεγονός ότι έχει διαφορετικές σταθερές συγγένειας με ένα πλήθος μακρομορίων χρησιμοποιείται ευρύτατα για το διαχωρισμό και την απομόνωση πρωτεϊνών, ενζύμων και άλλων μορίων από μείγματά τους. Επίσης, ο υδροξυαπατίτης έχει χρησιμοποιηθεί ως καταλύτης και ως υλικό στήριξης καταλυτών σε βιοαντιδραστήρες με εξαιρετικά πλεονεκτήματα. Έχει, επίσης, αναφερθεί η χρήση του σε διαδικασίες καθαρισμού υδάτινων μαζών από τοξικές ουσίες αποβλήτων [14]. Μία ακόμα σημαντική χρήση του είναι ως υποκατάστατο των οστών, καθώς η χημική σύνθεση και το μέγεθος των κρυστάλλων του μπορούν να διαμορφωθούν έτσι ώστε να μοιάζουν με αυτά του βιολογικού απατίτη που υπάρχει στα οστά, την οδοντίνη, την αδαμαντίνη και την οστεΐνη. Κλινικά χρησιμοποιήθηκε σε εφαρμογές αποκατάστασης οστικών ελλειμμάτων και στις αρχές της δεκαετίας του 1970 πρωτοαναφέρεται η εμπορική του χρήση για ιατρικές εφαρμογές. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν εμφυτεύματα κεραμικού ΗΑp τα οποία όμως απαιτούσαν μια πολύπλοκη και χρονοβόρα διαδικασία προπαρασκευής. Η διαδικασία αυτή περιελάμβανε συμπύκνωση, τήξη σε θερμοκρασίες 400-700οC και σταθεροποίηση σε όξινο pΗ. Έτσι σχηματιζόταν ένα μη-απορροφήσιμο υλικό. Σήμερα πλέον χρησιμοποιούνται μη-κεραμικά υλικά, όπως είναι τα CPCs, τα οποία ευνοούν το σχηματισμό ΗΑp in vivo. Τα υλικά αυτά διαφέρουν στο γεγονός ότι δεν είναι απαραίτητη η θέρμανσή τους ώστε να επιτευχθεί σταθερότητα δομής. 3.1.2.2 Βρουσίτης Σε αντίθεση με τον υδροξυαπατίτη, το διένυδρο φωσφορικόδιασβέστιο (DCPD) ή βρουσίτης, είναι μετασταθής υπό φυσιολογικές συνθήκες, και γι’ αυτό το λόγο τα CPCs από βρουσίτη απορροφώνται πολύ γρηγορότερα από αυτά του απατίτη, παρόλο που έχει αποδειχθεί ότι in vivo ο βρουσίτης τείνει να μετατραπεί σε υδροξυαπατίτη. Όλοι οι βρουσίτες λαμβάνονται ως αποτέλεσμα μιας αντίδρασης οξύ με βάση. Διάφοροι τρόποι σύνθεσης έχουν προταθεί για τσιμέντα από βρουσίτη, τα περισσότερα από αυτά περιέχουν β-TCP και ένα οξικό συστατικό, κυρίως μονοένυδρο φωσφορικό ασβέστιο (MCPM) ή φωσφορικό οξύ (Εικόνα 4:δεξιά). Σε περίσσεια β-TCP η τελική σύνθεση είναι επί της ουσίας ένα μείγμα από βρουσίτη και το β-TCP που δεν αντέδρασε [11]. Η δομή του DCPD είναι σχεδόν η ίδια με αυτή του γύψου, με παρόμοιες διαστάσεις μοναδιαίας κυψελίδας και κρυσταλλώνεται στο μονοκλινές σύστημα. Η δομή του DCPD αποτελείται από άτομα ασβεστίου και φωσφόρου που εναλλάσονται και σχηματίζουν αλυσίδες έχοντας απο κοινού ιόντα οξυγόνου (τα τέσσερα άτομα οξυγόνου των φωσφορικών ιόντων). Αυτές οι αλυσίδες είναι κάθετες στον άξονα b στο επίπεδο που ορίζουν οι άξονες a και c, όπως φαίνεται στην Εικόνα 7: που ακολουθεί [14]. Εικόνα 7: Αλυσίδες ασβεστίου και φωσφόρου στη δομή του DCPD. 37 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης Η παρουσία του έχει διαπιστωθεί σε δείγματα οδοντικής τρυγίας, σε οστά ηλικίας 800 ετών καθώς και σε οστά εμβρύων. Το DCPD έχει προταθεί ως πρόδρομη φάση του υδροξυαπατίτη και έχει διατυπωθεί η άποψη ότι αποτελεί τον κρίσιμο πυρήνα για τον σχηματισμό φωσφορικών και οξαλικών νεφρικών λίθων. Αποτελεί όμως μια από τις πιο ασταθείς φάσεις, οπότε με την πάροδο του χρόνου (3 με 5 μήνες) μετασχηματίζεται σε κάποιες λιγότερο διαλυτές αλλά πιο σταθερές θερμοδυναμικά φάσεις του φωσφορικού ασβεστίου. Έχουν επίσης αναφερθεί χρήσεις του ως συστατικού σε οδοντόπαστες καθώς και σε φάρμακα για την παροχή ασβεστίου σε ασθενείς. 3.1.3 Μηχανισμός σκλήρυνσης των CPCs Η αντίδραση πήξης που διαμορφώνει το στερεό αποτελείται από 3 στάδια: 1) διάλυση των αντιδρώντων, 2) πυρηνογένεση της νέας φάσης (είτε απατίτη είτε βρουσίτη) και 3) κρυσταλλική ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, η αντίδραση πήξης είναι μία διαδικασία διάλυσης-καθίζησης. Κατά τη διάρκεια της διάλυσης, τα αντιδρώντα που είναι σε μορφή σκόνης απελευθερώνουν ιόντα ασβεστίου και φωσφόρου δημιουργώντας ένα υπέρκορο διάλυμα. Όταν η συγκέντρωση των ιόντων φτάσει μία κρίσιμη τιμή, ξεκινάει η πυρηνογένεση της νέας φάσης γύρω από τα σωματίδια της ήδη υπάρχουσας σκόνης. Καθώς εξελίσσεται η διάλυση των αντιδραστηρίων μέσα στο διάλυμα, αυξάνεται η νέα φάση. Κατά τη διάρκεια των πρώτων ωρών, η διαδικασία καθίζησης ελέγχεται από την κινητική της διάλυσης των ακατέργαστων υλικών, αλλά μόλις η νέα φάση εγκλωβίσει τα αντιδρώντα η διαδικασία ελέγχεται απο τη διάχυση κατά μήκος της επιφάνειας της νέας φάσης. 3.1.4 Μικροδομή και πορώδες των CPCs Τα CPCs είναι υλικά με υψηλό πορώδες λόγω των κενών μεταξύ των σχηματισθέντων κρυστάλλων, με μέγεθος πόρων στη νανοκλίμακα. Παρόλο που το πορώδες περιορίζει τη χρήση αυτών των υλικών σε εφαρμογές καταπόνησης υψηλού φορτίου, είναι χρήσιμα για άλλου είδους εφαρμογές διότι το πορώδες ενισχύει την απορρόφηση και το βαθμό της βιοδραστικότητας των υλικών καθώς αυξάνει την ειδική επιφάνεια η οποία είναι διαθέσιμη για την αντίδραση. Για παράδειγμα, τα υλικά αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μεταφορά φαρμάκων σε συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Η φόρτωση και η μεταφορά των φαρμάκων σχετίζεται όχι μόνο με τον ολικό όγκο των ενδοδιασυνδεδεμένων πόρων αλλά και με την κατανομή μεγέθους των πόρων και την ειδική επιφάνεια. Αυτοί οι παράμετροι ποικίλουν ανάλογα με το μέγεθος των σωματιδίων της αρχικής φάσης καθώς και το λόγο υγρού/σκόνης (L/P). Όταν αυξάνεται ο λόγος L/P, αυξάνεται και το ολικό πορώδες (Εικόνα 8:β2). Επίσης, το μέγεθος των σωματιδίων της αρχικής σκόνης καθορίζει το σχήμα και το μέγεθος των σχηματισθέντων κρυστάλλων. Όταν η αρχική σκόνη είναι λεπτόκκοκη παράγονται βελονοειδείς κρύσταλλοι με υψηλή ειδική επιφάνεια, ενώ όταν η σκόνη είναι μεγαλύτερου μεγέθους παρατηρούνται πεπλατυσμένοι κρύσταλλοι (Εικόνα 8:α1 και 8α2 αντίστοιχα). Συνεπώς, είναι σημαντικό να χαρακτηριστεί λεπτομερέστερα η υφή των CPCs για να εξασφαλισθεί ο έλεγχος της κινητικής της αποδέσμευσης του φαρμάκου [11]. α) Μέγεθος σωματιδίων β) Αναλογία υγρού/σκόνης Εικόνα 8: Παράμετροι που επηρεάζουν τη μικροδομή και το πορώδες των CPCs. 39 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης 3.1.5 Βιοενεργότητα και απορρόφηση των CPCs Μία από τις σημαντικότερες ιδιότητες των CPCs είναι η βιοενεργότητα. Όταν αναφερόμαστε σε υποκατάστατα οστών, βιοενεργό υλικό είναι αυτό που έχει την ικανότητα να συνδέεται άμεσα με το περιβάλλον οστό χωρίς το σχηματισμό ινώδους ιστού. Η βιοενεργότητα μαζί με την τέλεια προσαρμοστικότητα της πάστας του τσιμέντου κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης οδηγεί σε σταθερή σύνδεση του εμφυτεύματος και του οστού, επιταχύνοντας τη διαδικασία επούλωσης του οστού. Η απορρόφηση των CPCs μπορεί να γίνει με 2 μηχανισμούς: α) παθητική απορρόφηση μέσω χημικής διάλυσης ή υδρόλυσης στα σωματικά υγρά, η οποία καθορίζεται από το πορώδες, τη κρυσταλλικότητα και το pΗ της διεπιφάνειας τσιμέντου - ιστού και β) ενεργή απορρόφηση που ελέγχεται από κύτταρα όπως τα μακροφάγα και οι οστεοκλάστες. Αυτά τα κύτταρα παράγουν pΗ κοντά στο 5.5, το οποίο αυξάνει το ρυθμό διάλυσης του εμφυτεύματος. Συνήθως αυτό το είδος της επαναρρόφησης συμβαίνει μόνο στην επιφάνεια του τσιμέντου, επειδή οι πόροι που υπάρχουν στα τσιμέντα δεν επιτρέπουν τη διείσδυση των κυττάρων ή των αιμοφόρων αγγείων στο υλικό. Για παράδειγμα, η απορρόφηση του βρουσίτη γίνεται μέσω του πρώτου μηχανισμού καθώς είναι διαλυτός σε ουδέτερο pH. Από την άλλη πλευρά, ο απατίτης (ο οποίος είναι σταθερός σε ουδέτερο pH) απορροφάται λόγω της διάλυσής του από τα οξέα που παράγουν οι οστεοκλάστες και τα μακροφάγα. Ενας άλλος μηχανισμός αποσύνθεσης των CPCs είναι μέσω της ενσωμάτωσης ιονικών υποκατάστατων. Για παράδειγμα, η ενσωμάτωση ανθρακικών αυξάνει την αταξία της κρυσταλλικής δομής του απατίτη, βοηθώντας τη κρυσταλλική διάλυση. Άλλοι παράγοντες που ρυθμίζουν την απορρόφηση των CPCs είναι: η ηλικία, το φύλλο, η υγεία, ο μεταβολισμός, οι κοινωνικές συνήθειες του ασθενούς το πορώδες η κρυσταλλικότητα το μέρος εμφύτευσης η αιμάτωση του οστού η μηχανική καταπόνηση. Υπό ιδανικές συνθήκες, όταν το CPC απορροφάται, αντικαθίσταται προοδευτικά από νέο οστό in vivo. Η αντικατάσταση γίνεται με διάλυση του τσιμέντου παράλληλα με την ανάπτυξη του οστού, αποφεύγοντας έτσι κενά μεταξύ του εμφυτεύματος και του ιστού, και καθοδηγώντας με αυτόν το τρόπο το σχηματισμό του οστού (οστεοαγωγιμότητα) [11]. 3.1.6 Δυνατότητα ενέσιμης έγχυσης των CPCs Υπάρχουν περιπτώσεις κατά τις οποίες η έγχυση του τσιμέντου στην επιθυμητή περιοχή πρέπει να γίνει με σύριγγα (ενέσιμη προσθήκη). Τα CPCs λοιπόν πρέπει να έχουν ιξώδες τέτοιο ώστε, αφενός να είναι δυνατή η ροή τους μέσω της λεπτής βελόνας της σύριγγας, αφετέρου κατά τη διάρκεια της εξώθησης να διατηρούν τη συνοχή τους, η οποία είναι δυνατό να διαταραχθεί. Όταν σε ένα ανομοιογενές μείγμα (όπως τα CPCs τα οποία αποτελούνται από υγρή και στερεά φάση πριν τη στερεοποίηση) ασκηθεί πίεση για να εκχυθεί μέσω μιας αρκετά μικρής διατομής, παρατηρείται διαχωρισμός της υγρής από τη στερεά φάση του μείγματος. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται filter-pressing phenomenon (διαχωρισμός με πίεση) και κατά τη διάρκεια του φαινομένου το υγρό εξωθείται από την περιοχή ανάμεσα στους νέο-σχηματιζόμενους κρυστάλλους την οποία καταλαμβάνει, σε περιοχή χαμηλότερης πίεσης. Δηλαδή έξω από το συρίγγιο. Αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν εργαστεί προσπαθώντας να λύσουν το πρόβλημα αυτό και να καταστήσουν εφικτή την ενέσιμη εφαρμογή του τσιμέντου. Ένας τρόπος είναι το μείγμα να έχει υψηλό ιξώδες ώστε να διατηρείται ομοιογενές κατά την εξώθηση. Τόσο δε υψηλό ώστε να είναι παράλληλα δυνατή και η ροή του μέσω της βελόνας. Κάτι τέτοιο επιτυγχάνεται μεταβάλλοντας την αναλογία υγρού/στερεό (L/P). Έχουν αναφερθεί μελέτες κατά τις οποίες επιτεύχθηκε εξώθηση τσιμέντου βρουσίτη με αναλογία L/P = 1,3- 2,5 g/ml μέσω βελόνας, αλλά η διάμετρος της βελόνας (περίπου 2-3 mm) θεωρείται αρκετά μεγάλη. Έτσι ο χαρακτηρισμός ενός τσιμέντου ως ενέσιμου που εξωθείται επιτυχώς από μια τέτοιας διαμέτρου βελόνα μπορεί να θεωρηθεί αδόκιμος. Αφετέρου η μείωση της αναλογίας L/P συχνά έχει επίπτωση στις μηχανικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη βελτίωση των ενέσιμων ιδιοτήτων των CPCs είναι η ιοντική τροποποίηση της υγρής φάσης του τσιμέντου με χρήση διαλύματος κιτρικού νατρίου ή κιτρικού οξέος. Τσιμέντα αποτελούμενα από φωσφορικό τετρασβέστιο (TTCP) και άνυδρο φωσφορικό διασβέστιο (DCPA) ως στερεά φάση και νερό ως υγρή σε αναλογία L/P = 3,3 g/ml παρουσίασαν δυνατότητα έκχυσης ενέσιμης προσθήκης σε ποσοστό περίπου 60%. Η χρήση όμως 500 mM διαλύματος κιτρικού νατρίου 41 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης μείωσε δραματικά το ιξώδες του πρώιμου τσιμέντου (πάστας) σε σημείο που να είναι εφικτή πλήρως η εξώθησή του (injectability > 95%) μέσω υποδερμικής βελόνας διαμέτρου 800 μm. Τα ιόντα των κιτρικών αλάτων έχουν μικρή τοξικότητα και έχουν βρεθεί στα ανθρώπινα οστά. Μελέτες έδειξαν ότι το κιτρικό οξύ επιβραδύνει το σχηματισμό HA. Εξαιτίας δε του χαμηλού pH (500 mM, pH=1.32) τα σωματίδια φωσφορικού ασβεστίου διαλύονται κατά τη διάρκεια της αρχικής αντίδρασης μέχρις ότου εξουδετερωθεί πλήρως το οξύ και για το λόγο αυτό οι συγκεντρώσεις ιόντων ασβεστίου και φωσφόρου στο πρώιμο τσιμέντο (υγρή πάστα) είναι αισθητά μεγάλες. Έχει αναφερθεί ότι παρουσία ιόντων κιτρικών αλάτων παρατηρείται αύξηση του επιπέδου υπερκορεσμού, το οποίο είναι απαραίτητο για να υπάρξει καθίζηση ΗΑp, από 10,93 σε 11,73 [18]. 3.1.7 CPCs ως μεταφορείς φαρμάκων 3.1.7.1 Ενσωμάτωση φαρμάκου σε CPCs Η σκλήρυνση του CPC λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή σώματος. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με το εγγενές τους πορώδες, επιτρέπει την ενσωμάτωση φαρμάκων, βιολογικά ενεργών μορίων ή ακόμα και κυττάρων χωρίς θερμική μετουσίωση ή απώλεια της δραστικότητάς τους κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας ή της εμφύτευσης. Αυτό έχει ως συνέπεια τα CPCs να μπορούν να χρησιμοποιηθούν όχι μόνο ως οστεoαγώγιμα οστικά μοσχεύματα αλλά και ως τοπικά συστήματα ελεγχόμενης μεταφοράς φαρμάκου. Για παράδειγμα, η ενσωμάτωση βιοενεργών μορίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αυξηθεί η ικανότητα οστικής αναγέννησης του υλικού ή για την αντιμετώπιση συγκεκριμένων σκελετικών δυσλειτουργιών ή παθήσεων. Η αποτελεσματικότητα οποιουδήποτε μέσου μεταφοράς φαρμάκων εξαρτάται από διαφορετικούς παράγοντες, όπως: μικροδομή (π.χ. ειδική επιφάνεια, διαπερατότητα, πορώδες) πιθανή αποσύνθεση της μήτρας διαλυτότητα φαρμάκου αλληλεπιδράσεις μεταξύ φαρμάκου και μήτρας Στην περίπτωση των CPCs, η κατανομή του φαρμάκου και η αλληλεπίδρασή του με το τσιμέντο εξαρτάται από τη μέθοδο ενσωμάτωσης του φαρμάκου στο τσιμέντο (Εικόνα 9:). Εικόνα 9: Μέθοδοι ενσωμάτωσης του φαρμάκου σε CPCs [11]. Συνήθως, τα φάρμακα ενσωματώνονται στο τσιμέντο είτε με ανάμιξή τους με τη στερεά φάση είτε με διάλυσή τους στην υγρή φάση. Και στις δύο περιπτώσεις το φάρμακο ενσωματώνεται σε όλο τον όγκο του υλικού, παρόλο που με την ενσωμάτωση του φαρμάκου επιτυγχάνεται καλύτερη ομογενοποίηση. Μια διαφορετική μέθοδος είναι ο εμποτισμός του φαρμάκου σε προσχηματισμένα CPCs. Αν και στα προσχηματισμένα τσιμέντα η δυνατότητα έγχυσής τους είναι περιορισμένη, πλεονεκτούν σε σχέση με τα κεραμικά φωσφορικού ασβεστίου, τα οποία δεν είναι δυνατόν να μορφοποιηθούν περαιτέρω. Σε αυτήν την περίπτωση, η στερεοποίηση του υλικού μέσω μιας διαδικασίας διάλυσης-καθίζησης σε χαμηλή θερμοκρασία δημιουργεί περιοχές μεγάλης ειδικής επιφάνειας και συγκεκριμένης μικροδομής που ευνοούν τους μηχανισμούς φόρτωσης και απελευθέρωσης του φαρμάκου. Οι δύο παραπάνω τρόποι ενσωμάτωσης του φαρμάκου σε τσιμέντα είναι πολύ διαφορετικοί σε ότι αφορά τις ιδιότητες υφής της μήτρας του λήπτη. Αν το φάρμακο είναι ενσωματωμένο στα αντιδραστήρια του τσιμέντου, θα τοποθετηθεί σε μια μήτρα που εξελίσσεται. Κατά τη διαδικασία πήξης, η μικροδομή του τσιμέντου εξελίσσεται από ένα εναιώρημα σωματιδίων σε ένα δίκτυο αλληλοεμπλεκόμενων κρυστάλλων (Εικόνα 4:). Αντίθετα, αν το φάρμακο προστεθεί στο προσχηματισμένο τσιμέντο, η μικροδομή θα είναι σταθερή σε όλη την περίοδο της απελευθέρωσης. Αυτό αναδεικνύει την ανάγκη να διενεργούνται οι μελέτες απελευθέρωσης του εκάστοτε φαρμάκου σύμφωνα με τις πραγματικές χειρουργικές συνθήκες. Μια εναλλακτική προσέγγιση για φόρτωση του φαρμάκου είναι να ενσωματώνεται σε πολυμερικές μικροσφαίρες πριν την ανάμιξή τoυ με το CPC. Αυτή η μέθοδος παρουσιάζει δύο επιπρόσθετα πλεονεκτήματα από τις 43 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης προαναφερθείσες μεθόδους: α) επιτρέπει τροποποίηση της κινητικής της απελευθέρωσης των φαρμάκων (π.χ. μετριάζει τη μαζική απελευθέρωση) και β) η αποσύνθεση των μικροσφαιρών δημιουργεί μία πορώδη μήτρα η οποία όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ευνοεί την απορρόφησή του και συνεπώς την οστική ανακατασκευή [11]. 3.1.7.2 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ CPC και φαρμάκου Η διαδικασία πήξης του CPC μπορεί να επηρεαστεί από την παρουσία του φαρμάκου είτε σε υγρή φάση είτε σε μορφή σκόνης, επηρεάζοντας τα τελικά χαρακτηριστικά του υλικού. Έτσι, η προσθήκη ενός φαρμάκου μπορεί να τροποποιήσει την κινητική της πήξης, τις ρεολογικές ιδιότητες, την ανάπτυξη της μικροδομής των CPCs και τις μηχανικές ιδιότητες των CPCs. Πρέπει επίσης να ενταθεί η ανάγκη να μελετηθεί η σταθερότητα του φαρμάκου ή του βιοενεργού μορίου όταν ενσωματώνεται σε CPC. Η δυναμική φύση των διαδικασιών διάλυσης-καθίζησης που λαμβάνουν χώρα κατά την πήξη οδηγεί σε αλλαγές στο τοπικό pH και στις συγκεντρώσεις των ιόντων στο διάλυμα που μπορεί να έχει επίδραση στη λειτουργικότητα του φαρμάκου, επηρεάζοντας με τη σειρά του την απελευθέρωσή του. Ως εκ τούτου, η απελευθέρωση φαρμάκου από τα CPCs θα πρέπει να μελετάται κυρίως από προπαρασκευασμένα τσιμέντα [11]. 3.1.7.3 Κινητική απελευθέρωσης φαρμάκου από CPCs Τα CPCs μπορούν να συμπεριληφθούν στην κατηγορία των μη- διογκούμενων μονολιθικών συστημάτων. Επίσης, στις περισσότερες περιπτώσεις μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως μη-διαβρώσιμες ή μη-απορροφήσιμες μήτρες, αφού, αν και μερικά CPCs είναι απορροφήσιμα, στα περισσότερα από αυτά ο ρυθμός αποσύνθεσης μπορεί να θεωρηθεί πολύ μικρότερος από το ρυθμό απελευθέρωσης του φαρμάκου. Για αυτούς τους λόγους έχει θεωρηθεί ότι η απελευθέρωση του φαρμάκου ελέγχεται κυρίως από τη διαδικασία διάχυσης μέσα στη μήτρα του τσιμέντου. Ένας σημαντικός παράγοντας που καθορίζει την κινητική της απελευθέρωσης του φαρμάκου είναι η κατανομή του φαρμάκου μέσα στο CPC. Όπως προαναφέρθηκε, το φάρμακο μπορεί να ενσωματωθεί στο τσιμέντο είτε με ανάμιξή του με τη σκόνη είτε με διάλυσή του στην υγρή φάση. Στην πρώτη περίπτωση θα συμβεί μερική διάλυση των σωματιδίων του φαρμάκου στην υγρή φάση του CPC. Στη δεύτερη περίπτωση, το φάρμακο δεν αναμένεται να ενσωματωθεί μέσα στο κρυσταλλικό πλέγμα των σχηματισθέντων κρυστάλλων (ΗΑp ή βρουσίτη). Το περισσότερο φάρμακο θα παραμείνει παγιδευμένο ανάμεσα στους πεπλεγμένους κρυστάλλους, με έναν από τους ακόλουθους τρόπους, όπως παρουσιάζονται στην Εικόνα 10: 1. Διαλυμένο στην υγρή φάση μεταξύ των κρυστάλλων, 2. Προσροφημένο ή χημικά συνδεδεμένο στην επιφάνεια των νεοσχηματισθέντων ανόργανων κρυστάλλων ή 3. Σε στερεά μορφή, στην περίπτωση που η συγκέντρωση που προστέθηκε ήταν μεγαλύτερη από τη διαλυτότητα του φαρμάκου στην υδατική φάση του τσιμέντου. Τότε τα διαλυμένα μόρια του φαρμάκου συνυπάρχουν με τα άμορφα σωματίδια ή τους κρυστάλλους του ίδιου φαρμάκου. Εικόνα 10: Απεικόνιση των διαφορετικών τρόπων εγκλωβισμού του φαρμάκου σε CPCs [11]. Πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη ότι, εξαιτίας της διάλυσης των αντιδρώντων, είναι πιθανό να αλλάξει σημαντικά το pH και η ιονική ισχύς της υγρής φάσης, και μπορεί να προκληθεί καθίζηση του φαρμάκου που ήταν αρχικά διαλυμένο στην υγρή φάση του CPC. Γι’ αυτό η μήτρα διαθέτει πόρους οι οποίοι μπορούν να διαπεραστούν από τα περιβάλλοντα υγρά, και η 45 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης απελευθέρωση του φαρμάκου μπορεί να θεωρηθεί ότι συμβαίνει κυρίως με διάχυση στο υγρό που έχει διεισδύσει τους πόρους (Εικόνα 10:α). Πολυάριθμες μελέτες ερμηνεύουν την απελευθέρωση του φαρμάκου από CPCs με βάση του μοντέλου του Higuchi, το οποίο αναπτύχθηκε αρχικά για λεπτά φιλμ και αργότερα επεκτάθηκε σε άλλα συστήματα, ιδιαίτερα για απελευθέρωση στερεών φαρμάκων διασκορπισμένα μέσα σε στερεές κοκκώδεις μήτρες τα οποία απελευθερώνονται με την έκλυση που προκαλεί ένας διαλύτης που διεισδύει. Το μοντέλο αυτό μπορεί να εφαρμοστεί μόνο αν [20]: 1. η αρχική συγκέντρωση του φαρμάκου στο σύστημα είναι αρκετά μεγαλύτερη από τη διαλυτότητά του και έτσι το φάρμακο είναι σε στερεά μορφή διασκορπισμένο μέσα στη μήτρα, 2. το μέγεθος των μορίων του φαρμάκου είναι αρκετά μικρότερο από τα μόρια του μέσου απελευθέρωσης, 3. το υλικό του φορέα δε διογκώνεται ή διαλύεται και 4. ο συντελεστής διάχυσης του φαρμάκου είναι σταθερός (δεν εξαρτάται από το χρόνο ή τη θέση). 3.2 Γύψος Η γύψος παράγεται από τη μερική ή ολική αφυδάτωση της φυσικής γύψου, έπειτα από κατάλληλη όπτηση. Φυσική γύψος είναι το ένυδρο θειϊκό ασβέστιο, CαSO4∙2H2O. Τα 3/2 του κρυσταλλικού νερού της φυσικής γύψου αφυδατώνονται σε θερμοκρασία μικρότερη από εκείνη που απαιτείται για το υπόλοιπο 1/2 [23]. 3.2.1 Προϊόντα όπτησης της φυσικής γύψου Η αφυδάτωση της φυσικής γύψου, δηλαδή η απόσπαση των κρυσταλλικών μορίων του νερού, επιτυγχάνεται με όπτηση σε διάφορες θερμοκρασίες, οπότε και λαμβάνονται κατά σειρά τα παρακάτω προϊόντα [23]: 500οC: Αρχίζει η αφυδάτωση της φυσικής γύψου. 1000 - 1200οC: Παρατηρείται έντονος κοχλασμός. 1800οC: Μειώνεται το ποσοστό του περιεχόμενου νερού από 20,9% σε 6,2% και λαμβάνεται η ημιένυδρη ή πλαστική γύψος, CαSO4. ½ H2O, η οποία χησιμοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική εργασία. 1900 - 2200οC: Λαμβάνεται ο τεχνητός διαλυτός ανυδρίτης ο οποίος χρησιμοποιείται στην οδοντοτεχνία. 3000οC: Ο διαλυτός ανυδρίτης μετατρέπεται σε αδιάλυτος. 5000 - 6000οC: Λαμβάνεται ο τεχνητός αδιάλυτος ανυδρίτης, CαSO4, ο οποίος ονομάζεται και νεκρά γύψος. 10000οC: Λαμβάνεται η άνυδρος ή τραχεία γύψος μαζί με δευτερεύοντα προϊόντα, CαO, CαSO4 , λόγω της διάσπασης: CαSO4 CαO + SO3 3.2.2 Ημιένυδρη γύψος Στην παρούσα διπλωματική εργασία, μία από τις πρώτες ύλες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των οστικών τσιμέντων ήταν η ημιένυδρη γύψος σε σκόνη, τα χαρακτηριστικά της οποίας παρουσιάζονται παρακάτω. 3.2.2.1 Παρασκευή Η ημιένυδρη γύψος λαμβάνεται με μερική αφυδάτωση της φυσικής γύψου. Η φυσική γύψος θραύεται, κονιοποιείται και τοποθετείται σε ειδικά καμίνια όπτησης. Μετά την όπτηση ακολουθεί ψύξη σε ειδικά silos, άλεση και συσκευασία. 3.2.2.2 Φυσικές ιδιότητες Η ημιένυδρη γύψος είναι σκόνη υπόλευκη μέχρι λευκή, η οποία πήζει πολύ γρήγορα μετά την ενυδάτωσή της, ενώ συγχρόνως εμφανίζεται αισθητή ανύψωση της θερμοκρασίας. Παρουσιάζει μεγάλη διαλυτότητα στο νερό και έχει μικρό συντελεστή θερμοαγωγιμότητας. Με την ανάμειξη της ημιένυδρης γύψου με διάφορες προσμίξεις, σε μικρές ποσότητες, είναι δυνατόν να ρυθμιστούν οι εξής ιδιότητές της [23]: 1. ο χρόνος πήξης, 2. η αύξηση της πλαστικότητας, 3. η συνεκτικότητα και 4. η σκληρότητα. 3.2.2.3 Πήξη και σκλήρυνση της πλαστικής γύψου Η ημιένυδρη γύψος όταν αναμιχθεί με νερό μεταρέπεται σε φυσική γύψο με έκλυση θερμότητας κατά την αντίδραση : 47 Κεφάλαιο 3: Υλικά Οστικής Αποκατάστασης CaSO4 ∙ H2O + H2O CaSO4 ⋅2H2O + Q H πήξη οφείλεται στην ενυδάτωση του ημιένυδρου άλατος και την εναπόθεση κρυστάλλων από υπέρκορα διαλύματα. Ακολούθως, οι κρύσταλλοι συμπλέκονται και προσφύονται μεταξύ τους, το υλικό αποκτά συνεκτικότητα και μηχανικές αντοχές, οι οποίες συνεχώς αυξάνουν καθώς περνά από το στάδιο της πήξης στο στάδιο της σκλήρυνσης. Στην πήξη και στην σκλήρυνση της ημιένυδρης γύψου δεν συμμετέχει το CO2 της ατμόσφαιρας και συνεπώς η ημιένυδρη γύψος θα μπορούσε να θεωρηθεί ως υδραυλική κονία. Επειδή, όμως, δεν διατηρείται σε υγρό περιβάλλον κατατάσσεται στις αερικές κονίες. Ο συνηθισμένος χρόνος πήξης είναι 5 – 30 min περίπου και εξαρτάται από : 1. την ποσότητα του νερού επεξεργασίας, 2. την κανονικότητα της όπτησή της, 3. την λεπτότητα άλεσής της και 4. την περιεκτικότητα σε ξένες προσμίξεις. Η πήξη και η σκλήρυνση είναι δυνατόν να επιταχυνθούν ή να επιβραδυνθούν με τη χρήση προσθέτων υλικών. Η προσθήκη λεπτοαλεσμένης φυσικής γύψου ή ανόργανων οξέων επιταχύνει την πήξη και την σκλήρυνση της ημιένυδρης γύψου, ενώ η προσθήκη ζωικής κόλλας ή διάφορων αδρανών στο γυψοπολτό, κατά το στάδιο της επεξεργασίας, τις επιβραδύνει [23]. 3.2.2.4 Είδη Η πλαστική γύψος διακρίνεται σε: 1. Δομική. 2. Διακοσμητική. 3. Οδοντοτεχνίας. 4. Ορθοπεδική. 5. Οινοποιίας. 3.2.2.5 Εφαρμογές Η ημιένυδρη γύψος χρησιμοποιείται κυρίως ως δομικό υλικό για την παρασκευή γυψοκονιαμάτων, πλακών επένδυσης και γυψοσανίδων, όπως και στην κατασκευή αντικειμένων, τα οποία μορφοποιούνται σε καλούπια. Λόγω της διαλυτότητάς της στο νερό χρησιμοποιείται μόνο σε εσωτερικές κατασκευές και όχι σε έργα, τα οποία είναι εκτεθειμένα στην υγρασία και στο νερό της βροχής, γιατί θα καταστραφούν. Ως μέτρα προφύλαξης χρησιμοποιούνται η βαφή, ο επιφανειακός εμποτισμός και τα πρόσθετα μάζας [23]. Επίσης, η ημιένυδρη γύψος χρησιμοποιείται για την κάλυψη οστικών ελλειμμάτων από το 1892 [24]. Τελευταία, έχει χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο συνθετικό οστικό μόσχευμα η γύψος (θειϊκό ασβέστιο) ιατρικού τύπου. Η διαδικασία προετοιμασίας του χειρουργικού βαθμού θειϊκού ασβεστίου ελαττώνει όλα τα ιχνοστοιχεία και παρέχει μια ενιαία άλφα κρυσταλλοειδή δομή με ένα προβλέψιμο βαθμό απορρόφησης in vivo. Ο τρόπος δράσης αυτού του συμπιεσμένου σε ταμπλέτες κρυσταλλικού θειϊκού ασβεστίου είναι άγνωστος [25]. Σε πειραματικές μελέτες έχει παρατηρηθεί ότι οι διαμορφωμένες δοκίδες οστικού ελλείμματος είναι ποιοτικά ίδιες με αυτές του αυτομοσχεύματος [26]. Ο βαθμός απορρόφησης ταμπλετών θειϊκού ασβεστίου αντιστοιχεί με το βαθμό του νεοσχηματιζόμενου οστού. Η γύψος ιατρικού τύπου είναι φιλική προς το περιβάλλον του ξενιστή, ένα βιοϋλικό το οποίο επηρεάζει ικανοποιητικά τη δημιουργία οστού. Το θειϊκό ασβέστιο είναι οστεοκαθοδηγητικό υποκατάστατο οστικό μόσχευμα. Εικάζεται πως οι ταμπλέτες θειϊκού ασβεστίου ενδέχεται να διεγείρουν τον ανασχηματισμό οστίτη ιστού και δε δρουν μόνο διευκολύνοντας και κατευθύνοντας την αναγέννηση ιστού για την κάλυψη οστικών ελλειμμάτων [27]. Πρόσφατες κλινικές μελέτες υποστηρίζουν τη χρήση της γύψου ως ένα κατάλληλο υποκατάστατο οστικό μόσχευμα [26]. Στις περιπτώσεις σηπτικών οστικών ελλειμμάτων η γύψος μπορεί να χρησιμοποιηθεί αναμεμειγμένο με αντιβιοτικά [28]. 49 Κεφάλαιο 4: Βιοδραστικές Ουσίες Στην παρούσα διπλωματική εργασία εξετάστηκαν οστικά τσιμέντα διαφόρων συστάσεων τα οποία περιείχαν ένα αντιφλεγμονώδες φάρμακο, την ιβουπροφαίνη (Ibuprofen) το οποίο είναι δυσδιάλυτο σε υδατικά διαλύματα και μία υδατοδιαλυτή ουσία, την ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (Fluorescein Isothiocyanate - FITC). Πρέπει να σημειωθεί ότι η ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη δεν κατατάσεται από μόνη της στις βιοδραστικές ουσίες αλλά προσκολλάται σε αυτές ώστε να μπορούν να ανιχνευτούν και γι’αυτό μελετάται στην παρούσα διπλωματική εργασία ο ρυθμός αποδέσμευσής της από οστικά τσιμέντα. 4.1 Ιβουπροφαίνη Η ιβουπροφαίνη ήταν το πρώτο μέλος των παραγώγων του προπιονικού οξέος που εισήχθη το 1969 ως μια εναλλακτική λύση από την ασπιρίνη. Ανήκει σε μια ομάδα φαρμάκων που ονομάζονται μη-στεροειδή αντιφλεγμονώ- δη φάρμακα (ΜΣΑΦ) και προμηθεύεται με ή χωρίς ιατρική συνταγή. Χρησιμοποιείται για να α) ανακουφίσει τον ήπιο πόνο, όπως ημικρανίες, πονόδοντο και τους πόνους της περιόδου, β) περιορίσει το οίδημα που προκαλείται από διαστρέμματα και αθλητικές κακώσεις, καθώς και τη φλεγμονή που προκαλείται από ρευματικές νόσους και μυοσκελετικές διαταραχές, όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η οστεοαρθρίτιδα, γ) ελέγχει τον πυρετό και δ) διεγείρει το κλείσιμο του αρτηριακού πόρου (ductus arteriosus) στα νεογνά, σε περίπτωση που δεν επιτευχθεί με φυσιολογικό τρόπο. Η αναλγητική δράση της ιβουπροφαίνης έχει άμεσα αποτελέσματα, αλλά η αντιφλεγμονώδης δράση μπορεί να πάρει περισσότερο μέχρι την επίτευξη των επιθυμητών αποτελεσμάτων. Οι πιο συχνές παρενέργειες που έχουν παρατηρηθεί από τη χρήση της ιβουπροφαίνης είναι η ναυτία και ο έμετος. Επίσης, θα πρέπει να αποφεύγεται η χρήση της από άτομα που πάσχουν από πεπτικό έλκος, άσθμα, νεφρικά ή ηπατικά προβλήματα και από εγκύους. Το σημείο τήξης της είναι στους 74-77 °C. Παρουσιάζει καλή διαλυτότητα σε οργανικούς διαλύτες όπως η αιθανόλη και είναι ελαφρώς διαλυτή στο νερό [29]. Κεφάλαιο 4 Βιοδραστικές Ουσίες Αρχικά η ιβουπροφαίνη παρήχθηκε τη δεκαετία του 1960 από την εταιρεία Boots της Αγγλίας. Η «Σύνθεση Boots», ή αλλιώς «Καφέ Σύνθεση», της ιβουπροφαίνης περιλαμβάνει μία διαδικασία 6 βημάτων και έχει ως μειονέκτημα την παραγωγή πολλών ανεπιθύμητων παραπροϊόντων. Το παραπάνω πρόβλημα λύθηκε από την εταιρεία BHC το 1991 η οποία εισήγαγε τη «Πράσινη Σύνθεση» της ιβουπροφαίνης η οποία απαιτούσε 3 στάδια. Αυτή η διαδικασία ενσωμάτωνε τα περισσότερα από τα αντιδρώντα μέσα στο τελικό προϊόν μειώνοντας ή εξαλείφοντας τα απόβλητα υποπροϊόντα [30]. 4.1.1 Καφέ σύνθεση Η παρασκευή της ιβουπροφαίνης ξεκινά με την ένωση ισοβουτύλιο βενζολίου. Βήμα 1: Friedel-Crafts ακυλίωση με καταλύτη χλωριούχο αργίλιο, που παράγει ως απόβλητο υποπροϊόν ένυδρο τριχλωριούχο αλουμίνιο. Βήμα 2: Aντίδραση Darzens με αιθυλ-χλωροακετόνη που οδηγεί σε μία ένωση εποξικού εστέρα. Βήμα 3: Aποκαρβοξυλίωση και υδρόλυση προς σχηματισμό μιας αλδεΰδης. Βήμα 4: Aντίδραση με υδροξυλαμίνη και παραγωγή οξίμης. Βήμα 5: Mετατροπή της οξίμης σε νιτρίλιο. Βήμα 6: Yδρόλυση του νιτριλίου που οδηγεί σε 2,4-ισοβουτυλοφαινυλο- προπανοϊκό οξύ, δηλαδή ιβουπροφαίνη. Από αυτήν τη διαδικασία το 60% είναι απόβλητα προϊόντα. Εικόνα 11: Καφέ σύνθεση ιβουπροφαίνης. 51 Κεφάλαιο 4: Βιοδραστικές Ουσίες 4.1.2 Πράσινη σύνθεση Η πράσινη σύνθεση της ιβουπροφαίνης ξεκινάει επίσης με ισοβουτύλιο βενζολίου. Βήμα 1: Friedel-Crafts ακυλίωση που χρησιμοποιεί ως καταλύτη υδροφθόριο το οποίο μπορεί να ανακτηθεί και να επαναχρησιμοποιηθεί. Βήμα 2: Υδρογόνωση με νικέλιο Raney, το οποίο ανακτάται και επαναχρησιμο-ποιείται, για να παραχθεί μία αλκοόλη. Βήμα 3: Υποβολή αλκοόλης σε καρβονυλίωση με καταλύτη το παλλάδιο, το οποίο είναι επανακτήσιμο και επαναχρησιμοποιήσιμο, προς παραγωγή της ιβουπροφαίνης. Από αυτήν τη διαδικασία μόνο το 1% είναι απόβλητα προϊόντα. Εικόνα 12: Πράσινη σύνθεση ιβουπροφαίνης. 4.2 Ισοθειοκυανική Φλουορεσκεΐνη Η ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) ανήκει στην κατηγορία των φθοριοχρωμάτων ή φθορίζουσων χρωστικών. Τα φθοριοχρώματα είναι ειδικές χημικές ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν και χρησιμοποιούνται στον ανοσοφθορισμό κυρίως για τη σήμανση των αντισωμάτων. Κάθε φθοριόχρωμα απελευθερώνει φθορίζον φως συγκεκριμένου μήκους κύματος το οποίο καθορίζεται από το ποσό της ενέργειας που καταναλώνεται κατά τη διέγερση των ηλεκτρονίων του. Τα σημαντικότερα φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται στον ανοσοφθορισμό είναι τα: 1. Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), εκπέμπει πράσινο χρώμα. 2. Ισοθειοκυανική τετραμεθυλοραδαμίνη (TMRITC), εκπέμπει κόκκινο χρώμα. 3. Φυκοερυθρίνη (RΕ), εκπέμπει πορτοκαλί χρώμα. 4.2.1 Ανοσοφθορισμός Ο ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος κατά την οποία χρησιμοποιούνται φθορίζοντα αντισώματα για την ανίχνευση και εντόπιση αντιγόνου ή αντισώματος σε ιστούς ή κύτταρα. Χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων στα ανοσολογικά εργαστήρια [31]. 4.2.1.1 Τύποι ανοσοφθορισµού Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα στάδια: Στάδιο 1: Ο ορός του ασθενούς του οποίου τα αντισώματα που ψάχνουμε τοποθετείται πάνω σε τομή ιστού που περιέχειτο αντιγόνο. Στάδιο 2: Ακολουθεί έκπλυση με φωσφορούχο διάλυμα για την απομάκρυνση του ασύνδετου αντισώματος. Στάδιο 3: Κατόπιν προστίθεται το φθορίζον αντίσωμα. Στάδιο 4: Ακολουθεί νέα πλύση για την απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου φθορίζοντος αντισώματος. Στάδιο 5: Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Εικόνα 13: Έμμεσος ανοσοφθορισμός. Ο άμεσος ανοσοφθορισμός (DFA) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα στάδια: Στάδιο 1: Πάνω σε τομή ιστού που περιέχει τα αντιγόνα που ψάχνουμε προστίθεται φθορίζον αντίσωμα. Στάδιο 2: Ακολουθεί πλύση με φωσφορούχο διάλυμα και απομάκρυνση του πλεονάζοντος αντισώματος. Στάδιο 3: Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. 53 Κεφάλαιο 4: Βιοδραστικές Ουσίες Εικόνα 14: Άμεσος ανοσοφθορισμός. Όπως φαίνεται από την περιγραφή των δύο μεθόδων IFA, DFA ο έμμεσος ανοσοφθορισμός χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό των ασθενών ενώ ο άμεσος ανοσοφθορισμός για την ανίχνευση αντιγόνων του ασθενή πάνω σε υλικό βιοψίας. Ανοσοφθορισμός με διπλή φθορίζουσα χρώση Στην τεχνική αυτή γίνεται ταυτόχρονα χρήση δύο αντιορών σημασμένων με διαφορετικά φθοριοχρώματα για την ανίχνευση δύο διαφορετικών αντιγόνων στο ίδιο υπόστρωμα. Εικόνα 15: Ανοσοφθορισμός με προσθήκη διπλής φθορίζουσαςουσίας. 4.2.1.2 Εφαρµογές ανοσοφθορισµού 1. Ανίχνευση μικροοργανισμών Βακτήρια, παράσιτα, μύκητες, ρικέτσιες, ιοί ανιχνεύονται σε ιστούς, βιολογικά υγρά και καλλιέργειες με την μέθοδο του άμεσου ή του έμμεσου ανοσοφθορισμού. 2. Ανίχνευση αντισωμάτων έναντι μικροοργανισμών Η ανίχνευση αυτή γίνεται στον ορό πασχόντων με την μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού. 3. Ανίχνευση φυσικών αντιγόνων Τέτοια αντιγόνα είναι: ορμόνες, ένζυμα, οργανοειδικά αντιγόνα, εμβρυϊκά αντιγόνα, αντιγόνα όγκων, αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων, ερυθρών αιμοσφαιρίων καθώς και τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας. Πραγματοποιείται σε ιστούς και μεμονωμένα κύτταρα με την μέθοδο του άμεσου και του έμμεσου ανοσοφθορισμού. 4. Ανίχνευση μικροοργανισμών και συμπληρώματος στους ιστούς. Χρησιμοποιείται για τη διάγνωση των αυτοάνοσων νόσων. Πραγματοποιείται με άμμεσο ανοσοφθορισμό. 5. Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων Χρησιμοποιείται για τη διάγνωση των αυτοάνοσων νόσων. Πραγματοποιείται με έμμεσο ανοσοφθορισμό. 55 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης 5.1 Περίθλαση Ακτίνων-Χ (XRD) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τη μελέτη διαφόρων παραμέτρων της κρυσταλλικότητας ενός υλικού, όπως οι πλεγματικές σταθερές, ο προσανατολισμός μονοκρυστάλλων, ο επιθυμητός προσανατολισμός πολυ- κρυστάλλων, οι ατέλειες κτλ. Επίσης, με την XRD μπορεί να γίνει και ταυτοποίηση ενός άγνωστου υλικού. Ο πιο συνηθισμένος τρόπος παραγωγής ακτίνων-Χ είναι μέσω επιτάχυνσης ηλεκτρονίων από δυναμικό τάξης μεγέθους των δεκάδων χιλιάδων βολτ και πρόσπτωσή τους σε στόχο, ο οποίος αποτελείται από μεταλλικό υλικό σχετικά μεγάλου ατομικού αριθμού. Τα ηλεκτρόνια που προσπίπτουν στο στόχο χάνουν σταδιακά την ενέργειά τους, εφόσον υφίστανται επιβράδυνση από τα άτομα του υλικού του στόχου. Η ενέργεια που αποδίδουν στα άτομα του στόχου είναι αρκετή για να διεγείρει και ηλεκτρόνια των εσωτερικών στοιβάδων των ατόμων. Αποτέλεσμα αυτού είναι η συμπλήρωση αυτών των στοιβάδων με ηλεκτρόνια από υψηλότερη στάθμη και έτσι παράγονται χαρακτηριστικές ακτίνες Χ. Σε ένα κρυσταλλικό πλέγμα η διάταξη των ατόμων είναι περιοδική. Όταν ακτίνες Χ πέσουν πάνω σε παράλληλα πλεγματικά επίπεδα ενός κρυστάλλου, κάποιες από αυτές περιθλώνται από το πρώτο επίπεδο (πρώτης τάξης σκέδαση), κάποιες από το δεύτερο (δεύτερης τάξης σκέδαση) και κάποιες από τα χαμηλότερα επίπεδα (σκέδαση ανώτερης τάξης). Από τις ακτίνες που εξέρχονται από το δείγμα ανιχνεύονται μόνο αυτές που βρίσκονται σε συμφωνία φάσης, δηλαδή αυτές που συμβάλλουν ενισχυτικά, παράγοντας έτσι δέσμη περίθλασης ισχυρότερη από την αρχική. Η συνθήκη για ενισχυτική συμβολή των περιθλώμενων ακτίνων είναι η διαφορά πορείας τους στο εσωτερικό του κρυστάλλου να είναι ακέραιο πολλαπλάσιο, n, του μήκους κύματος των ακτίνων. Σε κάθε άλλη περίπτωση συμβάλλουν αποσβεστικά και η έντασή τους μηδενίζεται Κεφάλαιο 5 Τεχνικές Ενόργανης Ανάλυσης Εικόνα 16: Περίθλαση των ακτίνων-Χ από κρυσταλλικό πλέγμα. Η απαραίτητη συνθήκη για την εμφάνιση του φαινομένου της περίθλασης εκφράστηκε από τον Bragg και η μαθηματική έκφραση αυτής δίνεται από την παρακάτω σχέση, γνωστή και ως νόμος του Bragg: όπου n είναι ακέραιος αριθμός που δηλώνει την τάξη της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας, λ το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, d η απόσταση μεταξύ των πλεγματικών επιπέδων στην εξεταζόμενη κρυσταλλική διεύθυνση και θ η γωνία πρόσπτωσης. Οργανολογία Η συσκευή που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της κρυσταλλικότητας αποτελείται από μια πηγή ακτίνων-Χ, με ακτινοβολία η οποία συνήθως προέρχεται από μια λυχνία Cu ή Mo, έναν δειγματοφορέα, έναν ανιχνευτή στερεάς κατάστασης και ένα σύστημα επεξεργασίας και ανάγνωσης του σήματος. Η διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος περιλαμβάνει την κονιοποίηση του δείγματος με στόχο τον προσανατολισμό των μικροκρυσταλλιτών του δείγματος προς κάθε δυνατή κατεύθυνση. Έτσι διασφαλίζεται η ανάκλαση κατά Bragg της δέσμης από μεγάλο αριθμό μικροκρυσταλλιτών. Το δείγμα τοποθετείται πάνω σε δειγματοφορέα από μη κρυσταλλικό υλικό, ώστε να μην επηρεάζει τη μέτρηση, μέσα σε έναν ειδικό θάλαμο και αρχίζει να περιστρέφεται με τη βοήθεια ενός γωνιομέτρου με σταθερό ρυθμό. Με τον τρόπο αυτό οι ακτίνες-Χ δε ακτινοβολούν το δείγμα μόνο υπό μία γωνία, αλλά το σαρώνουν σε ένα φάσμα γωνιών που επιλέγεται. Μετά την περίθλασή τους από τους 57 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης κρυσταλλίτες του δείγματος οι ακτίνες εστιάζονται στον ευθυγραμμιστή εξόδου, ο οποίος βρίσκεται σε γωνία θ γύρω από τον άξονα του περιθλασίμετρου. Έτσι η απόκλιση της προσπίπτουσας σε σχέση με την περιθλώμενη είναι συνολικά 2θ. Ο ανιχνευτής με ταυτόχρονη στροφή κατά γωνία 2θ συλλέγει τις διάφορες περιθλάσεις [13]. Εικόνα 17: Οργανολογία περιθλασίμετρου ακτίνων-Χ. Η δέσμη των ακτίνων που περιθλάται, συλλέγεται μέσω του ανιχνευτή και αναλύεται, δίνοντας το τελικό φάσμα περίθλασης, το οποίο αποτυπώνεται στην οθόνη ενός ηλεκτρονικού υπολογιστή. Από τα φάσματα περίθλασης, εξάγεται η κρυσταλλική μορφή του στερεού υλικού. Όσο πιο οξείες είναι οι κορυφές, δηλαδή όσο μεγαλύτερη είναι η ένταση, τόσο μεγαλύτεροι είναι και οι κρύσταλλοι του υλικού. Για τη λήψη φασμάτων περίθλασης ακτίνων-Χ χρησιμοποιήθηκε περιθλασίμετρο (Bruker D8) που βρίσκεται στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Επιστημών Χημικής Μηχανικής (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ) σε γεωμετρία Bragg-Brentano το οποίο είναι ικανό να μετρά από ελάχιστη γωνία 0ο έως 160ο (Εικόνα 18:). Τα δείγματα που ήταν σε μορφή σκόνης αλέσθησαν σε γουδί από αχάτη και το κονιοποιημένο στερεό τοποθετήθηκε σε ειδικό δειγματοφορέα και συμπιέσθηκε με υάλινο πλακίδιο, ώστε να επιτευχθεί επίπεδη επιφάνεια. Η ακτινοβολία προέρχονταν από αντικάθοδο Cu (λ = 1.5421 Å) και φίλτρο από φύλλο Ni. Η γωνιακή ταχύτητα σάρωσης ήταν 0.35 sec/step. Για την παραγωγή της δέσμης των ακτίνων-Χ η τάση που εφαρμόστηκε ήταν 40 kV και η ένταση του ρεύματος ήταν 40 mA. Εικόνα 18: Περιθλασίμετρο Bruker D8. 5.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM) είναι μία από τις σύγχρονες και ευέλικτες μεθόδους ανάλυσης της μικροδομής στερεών δειγμάτων και δίνει εικόνες υψηλού βαθμού διείσδυσης. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης είναι ένα όργανο που λειτουργεί όπως περίπου και ένα οπτικό μικροσκόπιο μόνο που χρησιμοποιεί δέσμη ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας αντί για φως, για να εξετάσει αντικείμενα σε λεπτομερή κλίμακα. Τα ηλεκτρόνια λόγω της κυματικής τους φύσης μπορούν να εστιαστούν όπως και τα φωτεινά κύματα αλλά σε πολύ μικρότερη επιφάνεια (π.χ. κόκκος υλικού). Η δέσμη ηλεκτρονίων σαρώνει την επιφάνεια του δείγματος με το οποίο αλληλεπιδρά. Από την αλληλεπίδραση αυτή προκύπτουν πληροφορίες σε σχέση με τα άτομα των στοιχείων που απαρτίζουν το εξεταζόμενο υλικό. Από τα άτομα των στοιχείων εκπέμπονται κυρίως δευτερογενή και οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια καθώς και ακτίνες Χ και ηλεκτρόνια Auger. Η ένταση των εκπεμπόμενων ηλεκτρονίων επηρεάζεται από τα χαρακτηριστικά της επιφάνειας. Έτσι το SEM δίνει πληροφορίες που αφορούν κυρίως στη μορφολογία και στη σύσταση της επιφανείας. Οι κοίλες περιοχές φαίνονται σκοτεινές ενώ αυτές που προεξέχουν φαίνονται φωτεινές. Εφαρμόζοντας ένα σύστημα ανίχνευσης της διασποράς των ενεργειών των 59 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης ακτίνων Χ που δημιουργούνται στην επιφάνεια από την προσπίπτουσα δέσμη, μπορεί να γίνει ημιποσοτική στοιχειακή ανάλυση του υλικού. Η παρατήρηση των δειγμάτων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης SEM πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Επιστημών Χημικής Μηχανικής (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ) στην Πάτρα με μικροσκόπιο LEO SUPRA 35VP (Εικόνα 19:) εφοδιασμένο με λογισμικό σύστημα στοιχειακής ανάλυσης των δειγμάτων. Αρχικά τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε δειγματοφορείς από Al στους οποίους είχε επικολληθεί αγώγιμη αυτοκόλλητη ταινία άνθρακα διπλής όψης (PELCO Image Tabs). Επειδή τα δείγματα που μελετήθηκαν δεν ήταν καλοί αγωγοί του ηλεκτρισμού και για να αποφευχθεί η συσσώρευση φορτίων κατά την παραμονή του στο μικροσκόπιο, επιχρυσώθηκαν. Η επιχρύσωση έγινε με τη μέθοδο sputtering υπό υψηλό κενό (~5×10-2 mbar) σε συσκευή BAL-TEC SCD-004. Εικόνα 19: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης LEO SUPRA 35VP. Αλληλεπιδράσεις Δέσμης – Δείγματος Η βασική αρχή λειτουργίας περιλαμβάνει την ακτινοβολία του δείγματος με μια καλά εστιασμένη δέσμη ηλεκτρονίων. Η περιοχή όπου ενεργητικά ηλεκτρόνια αλληλεπιδρούν με το στερεό, εναποθέτοντας ενέργεια και παράγοντας εκείνες τις μορφές δευτερεύουσας ακτινοβολίας που μετράμε ονομάζεται όγκος αλληλεπίδρασης [7]. Η διείσδυση της δέσμης στο δείγμα καθορίζεται από α) τον αριθμό των ηλεκτρονίων που υπάρχουν στη δέσμη, β) τη διάμετρο της δέσμης, γ) την ταχύτητα και την ενέργεια των ηλεκτρονίων και δ) το είδος του δείγματος. Εικόνα 20: Φαινόμενα αλληλεπίδρασης δέσμης – δείγματος [32]. Οι αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν ανάμεσα στο δείγμα και τα ηλεκτρόνια της δέσμης παρουσιάζονται στην Εικόνα 20: και περιλαμβάνουν: 1. Φόρτιση: Συσσώρευση φορτίου ηλεκτρονίων στο δείγμα. Για να αποφευχθεί η φόρτιση θα πρέπει το δείγμα να είναι αγώγιμο και συνδεδεμένο με γείωση ή να χρησιμοποιείται χαμηλό δυναμικό επιτάχυνσης. 2. Θέρμανση του δείγματος. 3. Ελαστική σκέδαση ηλεκτρονίων: α) Ελαστικά σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια δέσμης τα οποία δεν ανιχνεύονται από το σύστημα και β) οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια τα οποία είναι αυτά που σκεδάζονται προς τα πίσω με γωνία 180ο, έχουν μεγαλύτερη ενέργεια και εκπέμπονται από μεγαλύτερο βάθος από το δείγμα. 4. Μη ελαστική σκέδαση ηλεκτρονίων: α) Μη ελαστικά σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια τα οποία δεν ανιχνεύονται από το σύστημα και β) δευτερογενή ηλεκτρόνια τα οποία είναι τα ηλεκτρόνια που συγκρατούνται στο άτομο με ασθενείς δεσμούς και φεύγουν όταν συγκρουστούν με τα ηλεκτρόνια της δέσμης. Κάθε προσπίπτον ηλεκτρόνιο μπορεί να παράγει αρκετά δευτερογενή. 61 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης 5. Ακτίνες-Χ (X-Rays): α) Συνεχείς και β) Χαρακτηριστικές α) Συνεχές φάσμα Όταν ένα ηλεκτρόνιο σκεδάζεται μη ελαστικά σε αλληλεπίδραση με τον πυρήνα ενός ατόμου, επιβραδύνεται και μέρος (έως και το σύνολο) της ενέργειάς του αποδίδεται σαν ακτίνες-Χ που ονομάζονται Bremsstahlung. Αποτέλεσμα αυτού είναι ένα ευρύ φάσμα ακτίνων-Χ με μέγιστη ενέργεια εκείνη του προσπίπτοντος ηλεκτρονίου. Το φάσμα αυτό δεν χρησιμεύει στην στοιχειακή ανάλυση γιατί δεν είναι χαρακτηριστικό του στοιχείου. β) Χαρακτηριστικό φάσμα Οι χαρακτηριστικές ακτίνες-Χ δημιουργούνται με έναν τελείως διαφορετικό μηχανισμό. Όταν φεύγει ένα ηλεκτρόνιο από εσωτερική στοιβάδα, τότε ένα ηλεκτρόνιο από υψηλότερη ενεργειακή στοιβάδα καλύπτει το κενό πέφτοντας στη χαμηλότερη στοιβάδα και εκπέμποντας τη διαφορά ενεργείας σαν ακτίνες-Χ. Η ενέργεια αυτών των ακτίνων είναι χαρακτηριστική της μετάπτωσης και κατά συνέπεια του ατόμου. 6. Auger ηλεκτρόνια: Τα ηλεκτρόνια Auger παράγονται όταν οι εκπεμπόμενες από το δείγμα ακτίνες-Χ εκδιώξουν ηλεκτρόνια από άλλη στιβάδα κατά την έξοδό τους από το δείγμα. Οργανολογία Η λειτουργία του SEM στηρίζεται στις αλληλεπιδράσεις του προς εξέταση δείγματος και της προσπίπτουσας σε αυτό δέσμης ηλεκτρονίων. Οι βασικές διατάξεις που υπάρχουν στο μικροσκόπιο είναι το σύστημα παραγωγής δέσμης ηλεκτρονίων, το σύστημα κατεύθυνσης της δέσμης, το σύστημα πληροφοριών και τέλος το σύστημα κενού. Τα βασικά στάδια λειτουργίας ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου είναι: 1. Σχηματίζεται μια δέσμη ηλεκτρονίων από την πηγή η οποία επιταχύνεται προς το δείγμα μέσω ενός θετικού ηλεκτρικού δυναμικού. 2. Χρησιμοποιώντας μεταλλικά ανοίγματα, ηλεκτρομαγνητικούς φακούς και πηνία σάρωσης, επιτυγχάνεται μια λεπτή εστιασμένη μονοχρωματική δέσμη η οποία σαρώνει την επιφάνεια του δείγματος. 3. Οι αλληλεπιδράσεις δέσμης δείγματος καταγράφονται από τους ανιχνευτές και μετατρέπονται σε εικόνα. Τα παραπάνω στάδια ισχύουν για όλους τους τύπους ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. Εικόνα 21: Σχηματικό διάγραμμα μικροσκοπίου SEM. Σύστημα παραγωγής και κατεύθυνσης της δέσμης ηλεκτρονίων Τα ηλεκτρόνια παράγονται από ένα νήμα βολφραμίου (υπάρχουν και άλλα υλικά), το οποίο λειτουργεί σαν κάθοδος. Μέσα από το νήμα περνάει ρεύμα (filament current). Καθώς το ρεύμα αυξάνεται, εκπέμπονται ηλεκτρόνια τα οποία κατευθύνονται προς την άνοδο στην οποία εφαρμόζεται ένα δυναμικό 1-30 kV (accelerating voltage). Η άνοδος που είναι θετική, όπως και το κύκλωμα, δημιουργεί ισχυρές ελκτικές δυνάμεις στα ηλεκτρόνια. Αποτέλεσμα αυτού είναι ότι η άνοδος κατευθύνει και επιταχύνει τα ηλεκτρόνια, ελέγχει δηλαδή την ενέργειά τους. Καθώς αυξάνεται το ρεύμα του νήματος, φθάνει σε ένα σημείο που δεν εκπέμπονται πλέον άλλα ηλεκτρόνια. Αυτή η κατάσταση ονομάζεται κορεσμός του νήματος (filament saturation). Αν το ρεύμα του νήματος αυξηθεί επιπλέον, έχουμε υπερθέρμανση και εξάχνωση του βολφραμίου, δηλαδή το νήμα καίγεται. Ακόμα όμως και στο σημείο κορεσμού, μέρος του βολφραμίου εξαχνώνεται και γι’ αυτό με την πάροδο του χρόνου το νήμα λεπταίνει. Τα ηλεκτρόνια επιταχύνονται από την άνοδο και περνούν μέσα από ένα ηλεκτρομαγνητικό φακό συμπύκνωσης που τα μετατρέπει σε δέσμη. Η ισχύς αυτού του φακού καθορίζει τη διάμετρο της δέσμης. Σύστημα κενού Κατά τη χρήση του SEM η στήλη πρέπει να βρίσκεται υπό κενό για να μπορεί να παραχθεί και διατηρηθεί σταθερή η ακτίνα των ηλεκτρονίων. 63 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης Ειδάλλως, τα ηλεκτρόνια συγκρούονται με τα μόρια του αέρα και απορροφώνται. Το κενό επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλιών κενού. Σύστημα ανίχνευσης Περιλαμβάνει τους διαφόρους ανιχνευτές που δέχονται τα σήματα που παράγονται από την αλληλεπίδραση της δέσμης ηλεκτρονίων με το δείγμα και το σύστημα παρουσίασης (μεγέθυνση-παρουσίαση-καταγραφή). Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι ανιχνευτές δευτερογενών ηλεκτρονίων. Προετοιμασία του δείγματος Για την παρατήρηση ενός δείγματος απαιτείται εναπόθεση λεπτών υμενίων ενός αγώγιμου υλικού με την τεχνική Sputtering (Εικόνα 22:). Το υπό εξέταση υλικό, εάν κρίνεται απαραίτητο, τέμνεται με μικροτόμο ώστε το δείγμα να έχει αρκετά μικρές διαστάσεις. Στη συνέχεια τοποθετείται στη συσκευή Sputtering. Εικόνα 22: Σύστημα sputtering που χρησιμοποιήθηκε (αριστερά). Τα δείγματα πριν (πάνω-δεξιά) και μετά (κάτω-δεξιά) από το sputtering. Τρόπος λειτουργίας του συστήματος sputtering: 1. Στην κάθοδο προσαρμόζεται ένα λεπτό φύλλο χρυσού το οποίο παράγει ιόντα χρυσού. Λόγω διαφοράς δυναμικού αυτά θα κινηθούν προς την άνοδο. 2. Το δείγμα τοποθετείται στην άνοδο. 3. Η όλη διάταξη βρίσκεται σε ατμόσφαιρα αργού. 4. Η κάθοδος ιονίζει τα άτομα αργού σε κατιόντα και ελεύθερα ηλεκτρόνια. 5. Τα ιόντα αργού (θετικά φορτισμένα) επιταχύνονται προς την κάθοδο. 6. Λόγω σύγκρουσης των ιόντων με το φύλλο χρυσού (που είναι τοποθετημένο στην κάθοδο) απελευθερώνονται άτομα χρυσού και ηλεκτρόνια. 7. Τελικά, τα άτομα χρυσού συγκρούονται με τα ιόντα αργού με αποτέλεσμα να εναποτεθούν στο δείγμα υπό ποικίλες γωνίες. Έτσι επιτυγχάνεται ομοιόμορφη κάλυψη του δείγματος (coating) με άτομα χρυσού της τάξης των 10-30 nm [1]. 5.3 Φασματοσκοπία Αποσβενύμενης Ολικής Ανακλαστικότητας (ATR) Ο συνηθέστερος τρόπος συλλογής φασμάτων IR είναι με τη διάταξη της διαπερατότητας. Ωστόσο μόνο ορισμένα υλικά είναι αρκετά διαφανή και λεπτά ώστε να επιτρέπουν την διέλευση της δέσμης υπερύθρου και τη συλλογή αξιόπιστου φάσματος. Εναλλακτικά, προβαίνουμε στην αραίωση του δείγματος με βρωμιούχο κάλιο (KBr) και την παρασκευή δείγματος σε μορφή δισκίου (πελέτας). Η διαδικασία ενέχει σοβαρά μειονεκτήματα όπως το ότι δεν εφαρμόζεται σε υδατογενή δείγματα λόγω της υγροσκοπικότητας του KBr και δεν εφαρμόζεται σε κηρώδεις ουσίες επειδή αυτές δεν μπορούν να λειοτριβηθούν. Επίσης, είναι χρονοβόρα και είναι δυνατόν να προκαλέσει υδρόλυση ή ιονεναλλαγή του δείγματος και δεν είναι επαναλήψιμη καθώς το δείγμα δεν είναι ανακτήσιμο μετά την μέτρηση. Η ιδανική μέτρηση του φάσματος υπερύθρου πρέπει να μην απαιτεί προετοιμασία του δείγματος, να εφαρμόζεται εξ ίσου σε στερεά, κόνεις και υγρά, να είναι επαναλήψιμη και μη καταστροφική για το δείγμα. Η κατ’ εξοχήν μέθοδος συλλογής φασμάτων που συνδυάζει όλα τα παραπάνω πλεονεκτήματα είναι γνωστή ως Αποσβενύμενη Ολική Ανακλαστικότητα (Attenuated Total Reflectance, ATR). Συνοπτικά, το δείγμα έρχεται σε επαφή με κρύσταλλο υψηλού δείκτη διάθλασης, περατό στο υπέρυθρο, μέσα από τον οποίο διέρχεται η οπτική δέσμη υπό γωνία ολικής ανάκλασης. Η δέσμη δημιουργεί ένα στάσιμο κύμα στην μεσεπιφάνεια κρυστάλλου δείγματος το οποίο συλλέγει το φάσμα του υλικού από ένα εξαιρετικά μικρό «βάθος διείσδυσης» της τάξης των λίγων μικρών. Δείγματα σε μορφή σκόνης ή υμένια συγκρατούνται σε επαφή με τον κρύσταλλο με την βοήθεια ειδικής πρέσας η οποία ασκεί πίεση περίπου 75 psi (Εικόνα 23:). 65 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης Εικόνα 23: Ενδεικτική τομή διάταξης ΑΤR. Τυπικά, τα φάσματα που συλλέγονται με την τεχνική ATR απαιτούν χρόνο συλλογής λιγότερο από 1 λεπτό και μηδενικό χρόνο προετοιμασίας. Είναι συνεπώς δυνατή η συλλογή μεγάλου αριθμού φασμάτων με ασφάλεια, ταχύτητα και υψηλή επαναληψιμότητα [35]. Μαθηματική προσέγγιση Η προσπίπτουσα δέσμη ανακλάται ολικά στην μεσεπιφάνεια (Εικόνα 24:), δηλαδή η γωνία πρόσπτωσης θ είναι μεγαλύτερη από την χαρακτηριστική γωνία θc (critical angle), για την οποία ισχύει: (5.1) όπου n2 ο δείκτης διάθλασης του δείγματος και n1 ο δείκτης διάθλασης του κρυστάλλου. Το βάθος διείσδυσης (penetration depth), dp, ορίζεται ως εκείνο στο οποίο η ένταση της ακτινοβολίας υπερύθρου ελαττώνεται στο Io/e (όπου Ιο είναι ή ένταση της ακτινοβολίας στην μεσεπιφάνεια κρυστάλλου/δείγματος και e είναι η βάση των νεπέρειων λογαρίθμων ίση με 2,718). Το βάθος διείσδυσης συναρτήσει των δεικτών διάθλασης n1 και n2, της γωνίας πρόσπτωσης θ και του μήκους κύματος της ακτινοβολίας στον αέρα λο, δίδεται από τη σχέση: √ ( ) (5.2) Εικόνα 24: Πρόσπτωση ακτινοβολίας και δημιουργία αποσβενόμενου κύματος στο δείγμα. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι οι παράγοντες που επηρεάζουν μία ανάλυση με τη μέθοδο ATR είναι: το μήκος κύματος της ακτινοβολίας λ, ο δείκτης διάθλασης τoυ δείγματος n2 και του κρυστάλλου n1, η γωνία πρόσπτωσης της ακτινοβολίας θ, το βάθος διείσδυσης dp και η επαφή δείγματος με τον κρύσταλλο. (5.3) Όπου Ιev η ένταση του αποσβενόμενου κύματος, z είναι η κανονική απόσταση προς την οπτική μεσεπιφάνεια , και Ιo είναι η ένταση όταν z=0. Η ένταση του εξασθενημένου κύματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του δείγματος. Η τεχνική ATR είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απόκτηση IR φασμάτων, δύσκολων δειγμάτων τα οποία δεν μπορούν εύκολα να εξετασθούν με την κανονική μέθοδο. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της τεχνικής ATR που είναι η δυνατότητα μη καταστροφικής ανάλυσης υμενίων με σχετικά μεγάλο πάχος, ή με πολύ υψηλούς συντελεστές μοριακής απορροφητικότητας και η δυνατότητα ανάλυσης πολυστρωματικών δειγμάτων. Η ευαισθησία της τεχνικής ATR αυξάνει σημαντικά με αύξηση του αριθμού εσωτερικών ανακλάσεων, Ν>1. Αυτό επιτυγχάνεται με χρήση μεγαλύτερου κρυστάλλου με σχήμα τραπεζίου ή παραλλεπιπέδου. Σε αυτή την περίπτωση, το φαινόμενο βάθος διείσδυσης (effective penetration depth) ισούται με Νdp και η ποιότητα του σήματος ενισχύεται σημαντικά. Η παραλλαγή της απλής ανάκλασης εφαρμόζεται μέσω φακοειδών κρυστάλλων σε μικρά δείγματα ή σε αυτά με πορώδεις ή ανώμαλες επιφάνειες τα οποία δεν θα εφάπτονταν αποτελεσματικά στους συνηθισμένους πρισματικούς κρυστάλλους. Τα φάσματα της τεχνικής FT-ATR είναι πανομοιότυπα με αυτά της FT-IR ως προς τη θέση απορρόφησης αλλά διαφέρουν στις σχετικές εντάσεις των δεσμών. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό στερεού, μπορούμε να πούμε ότι η τεχνική της φασματομετρίας ATR, είναι μία αξιόπιστη μέθοδος, λαμβάνοντας όμως υπόψη όλες τις παραμέτρους που μπορούν να επηρεάσουν το αποτέλεσμα, όπως η γωνία πρόσπτωσης, η καλή επαφή δείγματος και κρυστάλλου, καθώς και το είδος του κρυστάλλου [35]. Οργανολογία Τα βασικά τμήματα του φασματομέτρου υπερύθρου αποτελούν η πηγή υπέρυθρης ακτινοβολίας, ο μονοχρωμάτορας που διαχωρίζει την ακτινοβολία στα επιμέρους μήκη κύματος, ο ανιχνευτής που συλλέγει την ακτινοβολία που 67 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης δεν απορροφήθηκε από το δείγμα και ο φωτοπολλαπλασιαστής ο οποίος μετατρέπει την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε ηλεκτρικό σήμα. Το φασματοφωτόμετρο Αποσβενύμενης Ολικής Ανακλαστικότητας που χρησιμοποιήθηκε στο χαρακτηρισμό των CPCs στην παρούσα εργασία, ήταν το FTIR (Excalibur της Digilab) στο οποίο είχε προσαρμοστεί εξάρτητα ATR (Pike Magic) με περιοχή σάρωσης από 450 cm-1 έως 4000 cm-1, το οποίο βρίσκεται στο Τμήμα Επιστήμης των Υλικών (Εικόνα 25:). Εικόνα 25: Φασματόμετρο FTIR (Digelab Excalibur) με εξάρτημα ATR (Pike Magic). 5.4 Φασματομετρία Μοριακής Απορρόφησης Υπεριώδους/Ορατού (UV/Vis) Η φασματοσκοπία μοριακής απορρόφησης υπεριώδους/ορατού (UV/Vis) στηρίζεται στη μέτρηση της διαπερατότητας Τ, ή της απορρόφησης Α, διαλυμάτων τα οποία περιέχουν μόρια χημικών ουσιών που απορροφούν ακτινοβολία στην υπεριώδη ή στην ορατή περιοχή, σε σύγκριση με διαλύματα τα οποία περιέχουν μόνο τον διαλύτη. Τα διαλύματα τοποθετούνται σε διαφανείς κυψελίδες οπτικής διαδρομής b cm. Όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από το διάλυμα το οποίο περιέχει την ουσία που απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής ως αποτέλεσμα της απορροφήσεώς της από αυτήν. Η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά ακτινοβολία στο διάλυμα εξαρτάται από την ελάττωση της ισχύος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας και συνήθως συνδέεται γραμμικά με την διαπερατότητα Τr, ή την απορρόφηση Αb και ακολουθεί το νόμο των Beer- Lambert γνωστό ως Νόμο του Beer: (5.4) όπου, Po η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, P η ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας από το διάλυμα, Tr η διαπερατότητα, b το μήκος της οπτικής διαδρομής της ακτινοβολίας μέσα στο διάλυμα, α η απορροφητικότητα, ε η μοριακή απορροφητικότητα και c η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά ακτινοβολία. Οι προϋποθέσεις του νόμου του Beer είναι οι εξής: η προσπίπτουσα ακτινοβολία να είναι μονοχρωματική, τα χημικά είδη που απορροφούν να δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και ανεξάρτητα από τον αριθμό και το είδος τους, η απορρόφηση να συμβαίνει σε έναν όγκο ομοιόμορφης διατομής, η ενεργειακή υποβάθμιση να είναι γρήγορη και ο δείκτης διάθλασης να είναι ανεξάρτητος της συγκέντρωσης. Συχνά παρουσιάζονται αποκλίσεις από τη γραμμικότητα μεταξύ της μετρούμενης απορρόφησης και της συγκέντρωσης. Μερικές από τις αποκλίσεις αυτές είναι θεμελιώδους σημασίας και αντιπροσωπεύουν πραγματικούς περιορισμούς του νόμου, ενώ άλλες εμφανίζονται ως συνέπεια του τρόπου μέτρησης της απορρόφησης (οργανολογικές αποκλίσεις) ή ως αποτέλεσμα χημικών μεταβολών (χημικές αποκλίσεις). Ο νόμος του Beer περιγράφει με επιτυχία την απορρόφηση υλικών που περιέχουν σχετικά μικρές συγκεντρώσεις της ουσίας που αναλύεται. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις η μέση απόσταση μεταξύ των απορροφούντων μορίων, μειώνεται σε σημείο που κάθε μόριο επηρεάζει την κατανομή φορτίου των γειτονικών του. Η αλληλεπίδραση αυτή μεταβάλλει την ικανότητά τους να απορροφούν σε δεδομένο μήκος κύματος [13]. Οργανολογία Τα όργανα για τη μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων στην υπεριώδη και ορατή ακτινοβολία αποτελούνται από: (i) μια πηγή ακτινοβολίας σταθερής ισχύος, (ii) ένα σύστημα φακών, κατόπτρων και σχισμών που ορίζουν, ευθυγραμμίζουν και εστιάζουν τη δέσμη, (iii) ένα μονοχρωμάτορα για την ανάλυση της ακτινοβολίας σε επί μέρους μήκη κύματος, (iv) διαφανείς κυψελίδες για την τοποθέτηση του δείγματος, (v) έναν ανιχνευτή ακτινοβολίας που μετατρέπει το οπτικό σήμα σε ηλεκτρικό και (vi) ένα σύστημα μέτρησης το οποίο διαθέτει ενισχυτή του σήματος και όργανο ανάγνωσης. Με ηλεκτρική διέγερση δευτερίου ή υδρογόνου υπό χαμηλή πίεση παράγεται ένα συνεχές φάσμα εκπομπής στην υπεριώδη περιοχή (160-340 nm). Η 69 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης συνηθέστερη πηγή ορατής (340-780 nm) ακτινοβολίας είναι η λυχνία νήματος βολφραμίου. Το νήμα βολφραμίου, ευρισκόμενο σε γυάλινο περίβλημα, παρουσία ευγενούς αερίου σε χαμηλή πίεση, πυρακτώνεται με ηλεκτρικό ρεύμα και φωτοβολεί. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από την πηγή κατευθύνεται μέσω κατόπτρων στο μονοχρωμάτορα. Ο μονοχρωμάτορας διαχωρίζει την πολυχρωματική ακτινοβολία σε επί μέρους μήκη κύματος και απομονώνει αυτά σε στενές ζώνες ή καλύτερα σε μονοχρωματική ακτινοβολία. Το φασματοφωτόμετρο υπεριώδους/ορατού διπλής δέσμης με το οποίο πραγματοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ιβουπροφαίνης, κατά τις μελέτες αποδέσμευσης ήταν της εταιρίας Perkin Elmer, (Model Lambda 35 UV/VIS Spectrophotometer). Οι κυψελίδες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οπτικής διαδρομής 1 cm. Εικόνα 26: Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους/ορατού διπλής δέσμης (Perkin Elmer, Model Lambda 35 UV/VIS Spectrophotometer). Η απεικόνιση του οπτικού συστήματος του φασματοφωτομέτρου διπλής δέσμης παρουσιάζεται στην Εικόνα 27:. Εικόνα 27: Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτομέτρου UV/VIS διπλής δέσμης. Στα φασματοφωτόμετρα διπλής δέσμης, η δέσμη της μονοχρωματικής ακτινοβολίας διαχωρίζεται σε δύο μέσω ενός κατόπτρου (διαμοιραστής δέσμης). Η πρώτη δέσμη διέρχεται από κυψελίδα η οποία περιέχει το διάλυμα αναφοράς (τυφλό) ενώ η δεύτερη από την κυψελίδα του δείγματος. Οι κυψελίδες κατασκευάζονται από υλικό το οποίο επιτρέπει τη διέλευση της ακτινοβολίας της περιοχής εργασίας. Στην υπεριώδη περιοχή απαιτούνται κυψελίδες από χαλαζία ή τηγμένη πυρίτια. Στην περιοχή του ορατού χρησιμοποιούνται κυψελίδες από απλή πυριτική ύαλο ή και μιας χρήσης, πλαστικές. Οι κυψελίδες πρέπει να έχουν παράθυρα εντελώς κάθετα προς τη διεύθυνση της δέσμης, απολύτως καθαρά, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες από ανακλάσεις. Στη συνέχεια οι δύο δέσμες κατευθύνονται με τη βοήθεια φακών προς τους αντίστοιχους ανιχνευτές. Ο ανιχνευτής απορροφά την ενέργεια των φωτονίων που προσκρούουν επάνω του και τη μετατρέπει σε ηλεκτρικό ρεύμα. Το ηλεκτρικό σήμα του ανιχνευτή ενισχύεται, μετρείται από όργανο μέτρησης και καταγράφεται ως ένδειξη σε ανάλογο σύστημα ανάγνωσης. 5.5 Φασματοσκοπία RAMAN Η φασματοσκοπία Raman ασχολείται με το φαινόμενο της μεταβολής της συχνότητας, όταν το φώς σκεδάζεται από μόρια. Το μέγεθος της μεταβολής αυτής αναφέρεται ως συχνότητα Raman και το σύνολο των χαρακτηριστικών συχνοτήτων ενός σκεδάζοντος είδους αποτελούν το φάσμα Raman του είδους αυτού. Μια μεταβολή συχνότητας Δν είναι ισοδύναμη με μια ενεργειακή μεταβολή Δν ⁄ h. Για καθαρά πρακτικούς λόγους συνηθίζεται τα παρατηρούμενα αποτελέσματα να εκφράζονται σε κυματαριθμούς αντί συχνοτήτων. Η συχνότητα ν εκφράζει τον αριθμό των δονήσεων ενός είδους στη μονάδα χρόνου. Η αντίστοιχη ποσότητα σε κυματαριθμούς εκφράζει τον αριθμό των κυμάτων ανά cm και σχετίζεται με τη συχνότητα μέσω της εξίσωσης ≈ ν/c, όπου c είναι η ταχύτητα του φωτός. Μεταξύ των φασματοσκόπων είναι πλέον σύνηθες να χρησιμοποιείται ο όρος «συχνότητα», ακόμα και όταν γίνεται αναφορά σε κυματαριθμούς, χωρίς να προκαλεί σύγχυση. Ας θεωρηθεί μια καθαρή ουσία (στερεά, υγρή ή αέρια), η οποία ακτινοβολείται με μονοχρωματική ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού, της οποίας η συχνότητα ν έχει επιλεγεί κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να μη συμπίπτει με κάποιο μέγιστο απορρόφησης του δείγματος. Όλο σχεδόν το φως θα περάσει μέσα από το δείγμα ανεπηρέαστο, ένα πολύ μικρό μέρος όμως θα σκεδαστεί από τα μόρια του δείγματος στο χώρο προς διευθύνσεις διαφορετικές από αυτήν της προσπίπτουσας δέσμης. Το προσπίπτον φως συνίσταται από φωτόνια ενέργειας 71 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης hνο. Κατά την πρόσκρουση του φωτός στα μόρια ενός μέσου, τα φωτόνια κατά το πλείστον σκεδάζονται ελαστικά, δηλαδή χωρίς απώλειες ενέργειας, εγείροντας το φαινόμενο της σκέδασης Rayleigh (Εικόνα 28:). Η ένταση της σκέδασης Rayleigh είναι ανάλογη της τέταρτης δύναμης της συχνότητας νο. Έτσι, αν χρησιμοποιηθεί ηλιακό φως, το κυανό πέρας του λαμβανόμενου φάσματος σκεδάζεται πολύ πιο έντονα από το ερυθρό. Στο φαινόμενο σκέδασης Rayleigh έχει αποδοθεί το γαλανό χρώμα του καθαρού ουράνιου θόλου, καθώς προκύπτει ως αποτέλεσμα της σκέδασης του ηλιακού φωτός από τα μόρια της ατμόσφαιρας. Εικόνα 28: Είδη σκεδάσεων του φωτός. Το φάσμα του σκεδαζόμενου φωτός περιέχει εκτός από τη Rayleigh και άλλες γραμμές μετατοπισμένες ως προς την αρχική συχνότητα (φάσμα Raman). Αυτές οφείλονται σε ανελαστική σκέδαση των φωτονίων από τα μόρια του μέσου. Όταν το μόριο υφίσταται κβαντισμένη μετάβαση σε κάποιο υψηλότερο ενεργειακό επίπεδο, το φωτόνιο χάνει ενέργεια και σκεδάζεται με χαμηλότερη συχνότητα (Δν αρνητικό). Αν το μόριο βρίσκεται ήδη σε κάποια ενεργειακή κατάσταση υψηλότερη της θεμελιώδους, η συνάντηση με ένα φωτόνιο μπορεί να προκαλέσει την αποδιέγερσή του, οπότε το φωτόνιο σκεδάζεται με υψηλότερη συχνότητα (Δν θετικό). Η μορφή του φάσματος στην πλευρά όπου η συχνότητα είναι χαμηλότερη από αυτή του διεγείροντος φωτός (Δν αρνητικό - γραμμές Stokes) αποτελεί το αντικατοπτρικό είδωλο της μορφής του φάσματος που κείται στην άλλη πλευρά της γραμμής Rayleigh (Δν θετικό - γραμμές anti-Stokes), με τη διαφορά ότι οι εντάσεις των λαμβανομένων κορυφών για αρνητικό Δν είναι μεγαλύτερες από ό,τι για θετικό (Εικόνα 29:). Οι μετατοπίσεις Raman είναι ισοδύναμες των ενεργειακών μεταβολών που συνοδεύουν τις μεταπτώσεις του σκεδάζοντος είδους, ανεξάρτητες της συχνότητας της διεγείρουσας ακτινοβολίας και χαρακτηριστικές του είδους που σκεδάζει. Εικόνα 29: Σχηματική απεικόνιση του φαινομένου Raman. Οργανολογία Μια τυπική πειραματική διάταξη που χρησιμοποιείται για τις αναλύσεις με την τεχνική Raman φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Εικόνα 30: Σχηματική πειραματική διάταξη Raman. 73 Κεφάλαιο 5: Τεχνκές Ενόργανης Ανάλυσης Η διάταξη αποτελείται από τα εξής βασικά στοιχεια: (i) Λέιζερ. (ii) Οπτικά στοιχεία για την καθοδήγηση (κάτοπτρα) και εστίαση της δέσμης (φακούς εστίασης). Συνήθως για την εστίαση στο προς ανάλυση δείγμα χρησιμοποιείται αντικειμενικός φακός μέσω του οποίου πραγματοποιείται και η συλλογή της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας. Επισης είναι απαραίτητη η χρήση κυτάλληλου φίλτρου (edge filter) πριν την είσοδο της σκεδαζόμειης ακτινοβολίας Raman στο φασματογράφο, το οποίο υποβάλλει την ακτινοβολία σκέδασης Rayleigh στο μήκος κύματος του λέιζερ και επιτρέπει τη διέλευση και ανίχνευση μόνο της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας Raman (Stokes), η οποία αντιστοιχεί σε μήκος κύματος λ > λLASER. Αυτό το φίλτρο είναι απαραίτητο γιατί οι κορυφές Raman είναι δυνατόν να εμφανίζονται κοντά στη γραμμή του λέιζερ και να μην είναι δυνατόν να γίνουν διακριτές αν η γραμμή τις επικαλύπτει λόγω της έντασης της, δεδομένου ότι η σκέδαση Rayleigh είναι πολύ εντονότερη της σκέδασης Raman. (iii) Οπτική ίνα για τη συλλογή και τη μεταφορά της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας στην είσοδο του φασματογράφου. (iv) Απεικονιστικό φασματογράφο. (v) Ανιχνευτή CCD για την καταγραφή του σήματος εκπομπής. (vi) Ηλεκτρονικό υπολογιστή με κατάλληλο λογισμικό για τον έλεγχο του πειράματος και την απεικόνιση των φασμάτων. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, για τη λήψη φασμάτων Raman χρησιμοποιήθηκε το φασματοφωτόμετρο Micro-Raman (Labram HR-800) που βρίσκεται στo Ινστιτούτο Επιστημών Χημικής Μηχανικής (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ) (Εικόνα 31:). Ως πηγή διέγερσης χρησιμοποιήθηκε ένα αερόψυκτο laser HeCd (Kimmon Electric Co., Model: IK5651R-G) το οποίο εκπέμπει μονοχρωματική ακτινοβολία στα 441,6 nm (μέγιστη ισχύς 80 mW) και στα 325 nm (μέγιστη ισχύς 20 mW). Η δέσμη της ακτινοβολίας περνά από ένα φίλτρο στενής φασματικής διαπερατότητας όπου απαλλάσσεται από τις παρασιτικές γραμμές εκπομπής του HeCd. Στη συνέχεια, αφού περάσει μέσα από ένα κατάλληλα διαμορφωμένο οπτικό μικροσκόπιο για μετρήσεις οπισθοσκέδασης, κατευθύνεται στο χώρο υποδοχής του δείγματος. Η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετά την ανάλυσή της απαλλάσσεται από την ελαστική σκέδαση Rayleigh με τη βοήθεια ενός φίλτρου. Για τη διασπορά της σκεδαζόμενης κατά Raman ακτινοβολίας χρησιμοποιήθηκε φράγμα περίθλασης 1800 εγκοπών ανά nm και για την ανίχνευσή της 2D CCD για την ψύξη της οποίας χρησιμοποιήθηκε υγρό άζωτο. Η διάταξη επίσης διαθέτει ειδική οθόνη φωταψίας για τη διευκόλυνση της εστίασης της δέσμης στο δείγμα [36]. Εικόνα 31: Φασματοφωτόμετρο Micro-Raman (Labram HR-800) που βρίσκεται στo Ινστιτούτο Επιστημών Χημικής Μηχανικής (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ). 75 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 6.1 Πειραματική διαδικασία Στην παρούσα διπλωματική εργασία οι συστάσεις των δοκιμίων που χρησιμοποιήθηκαν για τις μετρήσεις αντοχής σε θλίψη των οστικών τσιμέντων ήταν οι εξής: 100% α-TCP 90% α-TCP και 10% γύψος 100% γύψο Η γύψος παράχθηκε από την υδρόλυση και το μετασχηματισμό του ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: CaSO3 ∙ H2O + H2O CaSO4 ⋅2H2O + Q (6.1) όπου Q είναι η θερμότητα η οποία αναπτύσετε εξαρτώμενη από διάφορους παράγοντες [37]. Για την αποδέσμευση των βιοδραστικών ουσιών παρασκευάστηκαν δισκία των παραπάνω συστάσεων με προσθήκη 1%, 2% ιβουπροφαίνης και 0,2% ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης. Γενικά ο απατίτης έχει αργή βιοαπορροφησιμότητα όποτε η ενσωμάτωση μίας δέυτερης φάσης στο τσιμέντο βοηθάει στην πιο γρήγορη απορρόφηση του εμφυτέυματος από το οστό. Η επιλογή της γύψου ως δεύτερη φάση έγινε με βάση το ότι είναι βιοσυμβατό υλικό, εμφανίζει μεγαλύτερη διαλυτότητα από τον απατίτη και έχει τις ιδιότητες που αναφέρονται στο υποκεφάλαιο 3.2.2.5. 6.1.1 Παρασκευή του α-TCP Η παρασκευή του α-TCP, το οποίο αποτελεί τη στερεά φάση του τσιμέντου, έγινε με βάση την αντίδραση μεταξύ ανθρακικού και πυροφωσφορικού ασβεστίου: Κεφάλαιο 6 Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα (6.2) Τα αντιδρώντα, ανθρακικό ασβέστιο (CaCO3) και πυροφωσφορικό ασβέστιο (Ca2P2O7) σε ισομοριακή αναλογία αναμείχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε σφαιρόμυλο (ball milling) με δοχείο και σφαίρες από αχάτη (Εικόνα 32:) στις 450 στροφές για 20 λεπτά και 3 επαναλήψεις για καλύτερη ανάμειξη. Εικόνα 32: Σφαιρόμυλος (Pulverisette 5, Fritsch), δοχείο και σφαίρες διαμετρου 1cm απο αχάτη. Κατόπιν, η σκόνη τοποθετήθηκε σε χωνευτήρια αλούμινας (Alumina Crucible, Sigma – Aldrich) χωρητικότητας 100 ml, αναμείχθηκε με ακετόνη και αναδεύθηκε μηχανικά έως ότου το μείγμα γίνει λεπτόρευστο. Τα χωνευτήρια αλούμινας τοποθετήθηκαν σε προγραμματιζόμενο φούρνο (Εικόνα 33:) και τα αντιδραστήρια υπέστησαν θέρμανση στους 1350οC για 12 ώρες με ρυθμό θέρμανσης 164οC/h ώστε να αρχίσει η αντίδραση μετασχηματισμού. Εικόνα 33: Χωνευτήρια αλούμινας τοποθετημένα στο φούρνο. Έπειτα, έγινε απότομη ψύξη των δειγμάτων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, μέσα σε κύπελο ανοξείδωτου χάλυβα (Εικόνα 34:). Το τελικό προϊόν αλέσθηκε σε σφαιρόμυλο σε 4 κύκλους των 20 λεπτών ώστε να συνθλιφτούν τα συσσωματώματα του a-TCP που παρήχθησαν λόγω θερμότητας 77 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα και να επιτευχθεί το επιθυμητό μέγεθος κόκκου. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [38] το μέγεθος των κόκκων πρέπει να είναι μικρότερο από 100 μm. Εικόνα 34: Φωτογραφίες του δείγματος αμέσως μετά την έξοδό του από το φούρνο (αριστερά) και της αποκόλλησής του από το χωνευτήριο (δεξιά). Μετά την παραγωγή και την άλεση του α-TCP το προϊόν αποθηκεύθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και μέσα σε ξηραντήρα υπό κενό. Η διασφάλιση ξηρού περιβάλλοντος αποθήκευσης του α-TCP είναι σημαντική διότι το προϊόν έχει την τάση να δεσμεύει τα μόρια νερού από την ατμόσφαιρα και να αντιδρά προς το σχηματισμό κρυστάλλων ελλειματικού σε ασβέστιο υδροξυαπατίτη (CDHA: Calcium Deficient Hydroxy Apatite) ο οποίος σχηματίζεται με την υδρόλυση του α-TCP, σύμφωνα με την αντίδραση: (6.3) Έχει υπολογισθεί ότι 1000 mL αέρα στους 20οC και με σχετική υγρασία 75% περιέχουν 12 mg νερού. Ποσότητα αρκετή για να αντιδράσει με α-TCP και να σχηματίσει 600 mg CDHA [39]. 6.1.2 Παρασκευή δοκιμίων για μετρήσεις αντοχής σε θλίψη Συνολικά παρασκευάστηκαν τρείς σειρές δοκιμίων, οι αναλυτικές συστάσεις των οποίων βρίσκονται στον Πίνακας 2:. Πιο συγκεκριμένα, κατασκευάστηκαν αμιγή τσιμέντα 100% α-TCP και 100% γύψου καθώς και σύνθετα τσιμέντα 90% α-TCP με 10% γύψο, των οποίων η υγρή φάση ήταν 4% w/v Na2HPO4. Το μείγμα της εκάστοτε στερεάς φάσης με την υγρή, αφού αναδεύτηκε μηχανικά ώστε να γίνει ομοιόμορφο, τοποθετήθηκε σε κυλινδρικά καλούπια από σιλικόνη μήκους 12 mm και διαμέτρου 6 mm (Εικόνα 35:). Πίνακας 2: Συστάσεις των δοκιμίων τσιμέντου που παρασκευάστηκαν. a-TCP Γύψος 4% w/v Na2HPO4 100% - 0,32 ml/gr 90% 10% 0,35 ml/gr - 100% 0,50 ml/gr Εικόνα 35: Φωτογραφία του καλουπιού που χρησιμοποιήθηκε. Τα δοκίμια παρέμειναν στα καλούπια για 24h σε περιβάλλον 100% υγρασίας στους 37οC μέχρι να γίνει η αρχική σκλήρυνση (setting). Στη συνεχεία, αφαιρέθηκαν από τα καλούπια (Εικόνα 36:) και τοποθετήθηκαν σε κλειστά πλαστικά δοχεία τα οποία περιείχαν 15 ml διαλύματος Ringer (Fresenius Kabi - Lactated Ringer’s) στους 37οC ώστε να λάβει χώρα η διαδικασία σκλήρυνσης (hardening). Το διάλυμα Ringer είναι εμπλουτισμένος ορός, η σύσταση του οποίου φαίνεται στον Πίνακας 3:. Εικόνα 36: Φωτογραφία των δοκιμίων αμέσως μετά την αφαίρεσή τους απο το καλούπι. Πίνακας 3: Σύσταση του διαλύματος Ringer. Όνομα Χημικός τύπος Ποσότητα / 100 ml Λακτικό Νάτριο CH3CH(OH)COONa 0,31 gr Χλωριούχο Νάτριο NaCl 0,60 gr Χλωριούχο Κάλιο KCl 0,03 gr Χλωριούχο Ασβέστιο CaCl2∙2H2O 0,02 gr Για τη μελέτη της αντοχής σε θλίψη σε συνάρτηση με το χρόνο σκλήρυνσης (δηλαδή της παραμονής των δοκιμίων στο διάλυμα Ringer), σε χρονικά διαστήματα 1, 2, 8, 10 και 15 ημερών αφαιρούνταν από το διάλυμα έξι 79 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα δοκίμια από κάθε σύσταση. Τα δοκίμια αυτά κατόπιν μελετήθηκαν με XRD και SEM και τα αποτελέσματα περιγράφονται στο επόμενο υποκεφάλαιο. 6.1.3 Παρασκευή δισκίων για μετρήσεις αποδέσμευσης βιοδραστικών ουσιών Συνολικά παρασκευάστηκαν εννέα συστάσεις δισκίων, οι οποίες φαίνονται στον Πίνακας 4:. Το μείγμα της εκάστοτε στερεάς φάσης με την υγρή αναδεύτηκε μηχανικά ώστε να γίνει ομοιόμορφο και τοποθετήθηκε σε καλούπια σιλικόνης ώστε να έχουν σχήμα δισκίου (Εικόνα 37:). Πίνακας 4: Συστάσεις δοκιμίων τσιμέντου που κατασκευάστηκαν. a-TCP Γύψος Βιοδραστική ουσία 4% w/v Na2HPO4 IBUPROFEN Α 99% - 1% 0,32 ml/gr Β 89% 10% 1% 0,35 ml/gr Γ - 99% 1% 0,50 ml/gr Δ 98% - 2% 0,32 ml/gr Ε 88% 10% 2% 0,35 ml/gr Ζ - 98% 2% 0,50 ml/gr FITC Η 99,8% - 0,2% 0,32 ml/gr Θ 89,8% 10% 0,2% 0,35 ml/gr Ι - 99,8% 0,2% 0,50 ml/gr Εικόνα 37: Φωτογραφία των καλουπιών που χρησιμοποιήθηκαν. Τα δοκίμια παρέμειναν στα καλούπια για 24h σε περιβάλλον 100% υγρασίας μέχρι να γίνει η αρχική σκλήρυνση. Έπειτα, αφαιρέθηκαν από τα καλούπια, ζυγίσθηκαν και τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε γυάλινες κωνικές φιάλες οι οποίες περιείχαν 25 ml διαλύματος PBS (Phosphate Buffered Saline) το pH του οποίου είχε ρυθμιστεί σε τιμή 7,4. Η σύσταση του διαλύματος PBS φαίνεται στον Πίνακας 5:. Οι κωνικές φιάλες με τα δισκία τοποθετήθηκαν σε υδρόλουτρο υπό δόνηση στους 37οC. Πίνακας 5: Σύσταση του διαλύματος PBS. Σε 1 lt απεσταγμένου νερού: NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 8 gr 0,2 gr 1,44 gr 0,27 gr Σε τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν συλλογή 15 ml υγρού από κάθε κωνική φιάλη και αποθηκευόταν σε φυγοκεντρικά σωληνάρια. Εν συνεχεία πραγματοποιούνταν πλήρης ανανέωση του PBS (Εικόνα 38:). Έπειτα, γινόταν φυγοκέντρηση των αποθηκευμένων διαλυμάτων και με τη χρήση φασματοφωτομέτρου UV/Vis προσδιοριζόταν η ποσότητα της βιοδραστικής ουσίας που είχε απελευθερωθεί στο PBS από το εκάστοτε δισκίο κάθε χρονική στιγμή. Τέλος, με τη χρήση προγράμματος που δημιουργήθηκε σε Microsoft Excel υπολογίστηκε η εκατοστιαία ποσότητα της βιοδραστικής ουσίας που είχε απελευθερωθεί. Εικόνα 38: Σχηματική αναπαράσταση της δειγματοληπτικής διαδικασίας. 6.2 Χαρακτηρισμός του α-TCP με περίθλαση ακτίνων-Χ Το α-TCP που παρασκευάστηκε χαρακτηρίστηκε με περιθλασιμετρία ακτίνων-Χ. Πιο συγκεκριμένα, σε γουδί από αχάτη έγινε περαιτέρω κονιορτοποίηση των κόνεων, οι οποίες στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ειδικό δειγματοφορέα και πιέσθηκαν με τη βοήθεια γυάλινου πλακιδίου ώστε να επιτευχθεί επίπεδη επιφάνεια. Το δείγμα τοποθετήθηκε στην υποδοχή του οργάνου και ακτινοβολήθηκε από αντικάθοδο Cu (λ = 1.5421 Å). Η σάρωση έγινε με ταχύτητα 0,35 sec/step. Η περιοχή γωνιών σάρωσης (2θ) ήταν από 10° εώς 40°. 81 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Το διάγραμμα που προέκυψε, ταυτοποιήθηκε μετά από σύγριση με τις πρότυπες κάρτες ICDD® (International Centre for Diffraction Data®). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η κάρτα 29-359 για το α-TCP, η κάρτα 9-169 για το β-TCP και η κάρτα 9-432 για τον στοιχειομετρικό απατίτη HAP, ο οποίος στη συνέχεια θα αναφέρεται απλά ως απατίτης. 10 15 20 25 30 35 40 HAP # 9-432 α αα α,β β β β β α α α α α α,β α α α-TCP σκόνη Έ ν τα σ η ( a .u .) 2θ α-TCP # 29-359 β-TCP # 9-169 α β Σχήμα 1: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για την παρασκευασμένη στερεά φάση και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP και απατίτη (HAP). Από τη σύγκριση των περιθλασιογραμμάτων ακτίνων-Χ για την παρασκευασμένη στερεά φάση με τις κάρτες που προαναφέρθηκαν προέκυψε ότι το υλικό που παρασκευάστηκε περιέχει εκτός από το α-ΤCP και ανιχνεύσιμη ποσότητα β-TCP. Οι υψηλότερες σε ένταση κορυφές που παρουσιάστηκαν για το α-TCP και το β-TCP εμφανίζονται σε γωνίες 2θ ίσες με 30,75° και 31,09° αντίστοιχα. Οι κύριες ανακλάσεις που ειναι χαρακτηριστικές για αυτές τις γωνίες είναι (1 7 0) για το α-TCP και (0 2 10) για το β-TCP [18]. Παρατηρούνται και κορυφές μικρότερες σε ένταση οι οποίες σημειώνονται στο διάγραμμα. Η ύπαρξη β-TCP ως δεύτερη φάση απαντάται συχνά στη βιβλιογραφία και δημιουργείται κατά τη μη απότομη ψύξη της πρώτης ύλης από τους 1300οC σε θερμοκρασία δωματίου, διότι από τους 1180οC και κάτω είναι σταθερή η αλλοτροπική β-μορφή. Για παράδειγμα, οι Ginebra et. al. αναφέρουν την ύπαρξη β-TCP σε ποσοστό μέχρι και 15% στη πρώτη ύλη του τσιμέντου [40]. Επιπλέον, αναφέρεται και η παρουσία υδροξυαπατίτη στο τελικό προϊόν, γεγονός που οφείλεται στην απορρόφηση υγρασίας κατά την ψύξη του α-TCP, αλλά στη συγκεκριμένη περίπτωση δεν παρατηρήθηκε στο δείγμα που παρασκευάστηκε [41]. 6.3 Χαρακτηρισμός α-TCP και ώριμων τσιμέντων με φασματοσκοπία Raman Από τα φάσματα Raman του ώριμου τσιμέντου (Σχήμα 2: και Σχήμα 3:) διαπιστώνεται ότι το α-TCP που παρασκευάστηκε έχει υδρολυθεί σε απατίτη καθώς οι απορροφήσεις που παρατηρούνται στο τσιμέντο βρίσκονται σε 430, 580, 592, 609 και 960 cm-1 οι οποίες, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [42][43][44][45], συμπίπτουν με αυτές του απατίτη. Στο Σχήμα 2: όλες οι απορροφήσεις που εμφανίζονται για το α-TCP, β-TCP και τον απατίτη οφείλονται σε δονήσεις κάμψης του δεσμού O-P-O [44][46]. Για το β-TCP οι κορυφές εμφανίζονται σε 406, 440, 481,512, 548, 586, 610, 623 και 737 cm-1 ενώ στο α-TCP σε 420, 448, 564, 591 και 623 cm-1. Οι κορυφές αυτές είναι πλατιές και αλληλεπικαλύπτονται. 200 300 400 500 600 700 800 4 3 0 6 0 9 5 8 0 5 9 2 6 2 3 7 3 76 1 0 5 8 6 4 8 1 5 1 2 5 4 8 4 0 6 4 4 0 4 4 8 5 9 1 5 6 4 6 2 3 Έ ν τα σ η ( a .u .) Raman Shift / cm -1 Ώριμο τσιμέντο α-TCP β-TCP 4 2 0 Σχήμα 2: Φάσμα Raman σκόνης α-TCP και β-TCP καθώς και καθαρού ώριμου τσιμέντου α-TCP (200-825 cm-1). 83 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Στο Σχήμα 3: παρατηρούνται χαρακτηριστικές κορυφές του β-TCP σε 948 και 970 cm-1 οι οποίες αποδίδονται στις συμμετρικές δονήσεις τάσης του δεσμού Ο-P-O. Στην περίπτωση του α-TCP η αντίστοιχη δόνηση παρατηρείται σε 966 cm-1 ενώ στο ώριμο τσιμέντο σε 960 cm-1. Η κορυφή σε 1045 cm-1 οφείλεται στην ασύμμετρη δόνηση τάσης του δεσμού O-P-O. Αυτές οι κορυφές είναι χαρακτηριστικές για τον απατίτη. 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1 0 4 5 9 7 0 9 4 8 Έ ν τα σ η ( a .u .) Raman Shift / cm -1 Ώριμο τσιμέντο α-TCP β-TCP 9 6 0 9 6 6 Σχήμα 3: Φάσμα Raman σκόνης α-TCP και β-TCP καθώς και καθαρού ώριμου τσιμέντου α-TCP (825-1200 cm-1). 6.4 Δοκιμές αντοχής σε θλίψη Για τη μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων (αντοχή σε θλίψη) των δοκιμίων όλων των συστάσεων χρησιμοποιήθηκε η μηχανή θλίψης-εφελκυσμού Hounsfield H20K-W (Εικόνα 39:), του Τμήματος Επιστήμης των Υλικών με ταχύτητα κίνησης των αρπαγών 1,54 mm/min. Η καταγραφή των δεδομένων έγινε σε ηλεκτρονικό υπολογιστή με τη χρήση του λογισμικού του οργάνου. Το όργανο κατέγραφε τιμές δύναμης-μετατόπισης οι οποίες ανάχθηκαν σε τιμές τάσης-παραμόρφωσης. Πριν από κάθε διαδικασία θλίψης μετρήθηκαν οι πραγματικές διαστάσεις των δοκιμίων (μήκος και διάμετρος). Εικόνα 39: Mηχανή θλίψης-εφελκυσμού Hounsfield H20K-W. Εικόνα 40: Αρπάγες θλίψης με δοκίμιο τσιμέντου. Για κάθε δοκίμιο, μέσω της μέγιστης δύναμης που κατέγραφε το όργανο, υπολογιζόταν η μέγιστη τάση φόρτισης ή αλλιώς η αντοχή σε θλίψη σε MPa με βάση τη σχέση: (6.4) όπου, F η μέγιστη δύναμη σε Ν και Α το εμδαδόν επιφάνειας του δοκιμίου σε mm2. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε ο μέσος όρος και η σταθερή απόκλιση για κάθε ομάδα δοκιμίων με την ίδια σύσταση. Στο παρακάτω διάγραμμα αναπαριστάται η αντοχή σε θλίψη σε συνάρτηση με το χρόνο σκλήρυνσης για τα τρία είδη τσιμέντων που παρασκευάσθηκαν. Η απόκλιση προκύπτει από τις μετρήσεις πέντε έως οκτώ δοκιμίων κάθε σύστασης. Σημειώνεται ότι ως μηδενικός χρόνος θεωρείται ο χρόνος που αφαιρέθηκαν τα δοκίμια από τα καλούπια. Είχε προηγηθεί διάστημα 24 ωρών όπου τα δοκίμια βρισκόντουσαν μέσα στα καλούπια σιλικόνης στους 37oC, επομένως είχε πραγματοποιηθεί η αρχική σκλήρυνση (setting). Από το Σχήμα 4: παρατηρείται ότι για την περίπτωση των καθαρών τσιμέντων α-TCP η μέγιστη αντοχή σε θλίψη είναι (40,68 ± 4,14) MPa. Η τιμή αυτή είναι από τις μεγαλύτερες τιμες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [40]. Η παρουσία της γύψου σε περιεκτικότητα 10% μειώνει την αντοχή του τσιμέντου σε (34,61 ± 2,50) MPa. Η καθαρή γύψος εμφανίζει μέγιστη τιμή (14,52 ± 2,64) MPa. 85 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Επίσης, παρατηρείται ότι τα αμιγή τσιμέντα γύψου δεν παρουσιάζουν σημαντική διαφορά στην τιμή τους με το πέρασμα του χρόνου. Αυτό σημαίνει ότι η ολική σκλήρυνση του τσιμέντου έχει πραγματοποιηθεί κατά τη διάρκεια όπου βρισκόταν μέσα στα καλούπια, δηλαδή τις πρώτες 24 ώρες της δημιουργίας της πάστας. 0 1 2 8 1 0 1 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 σ ( M P a ) Χρόνος / Ημέρες 100% α-TCP 90% α-TCP & 10% γύψος 100% γύψος Σχήμα 4: Αντοχή σε θλίψη συναρτήσει του χρόνου σκλήρυνσης για τα τρία είδη τσιμέντων που παρασκευάσθηκαν. 6.4.1 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) Για να μελετηθεί η διεργασία της σκλήρυνσης των οστικών τσιμέντων που παρασκευάστηκαν συναρτήσει του χρόνου, τα δοκίμια χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία ακτίνων-Χ. Tα θραύσματα που προέκυψαν από τη μηχανική θλίψη των δοκιμίων, τα οποία είχαν αφαιρεθεί από το διάλυμα Ringer σε τακτά χρονικά διαστήματα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αλέσθηκαν σε γουδί από αχάτη και χρησιμοποιήθηκαν για το χαρακτηρισμό στο XRD. Η ταυτοποίηση των δειγμάτων έγινε με σύγκριση των περιθλασιογραμμάτων που ελήφθησαν με τις αντίστοιχες πρότυπες κάρτες ICDD®: 29-359 (α-TCP), 9-169 (β-TCP), 9-432 (στοιχειομετρικός απατίτης - HAP) και 33-311 (γύψος). Στο Σχήμα 5: είναι εμφανές ότι καθώς αυξάνονται οι ώρες παραμονής του τσιμέντου με σύσταση 100% α-TCP μέσα στο Ringer, οι κορυφές του α-TCP στις 7 ώρες μόλις διακρίνονται και κατόπιν εξαφανίζονται. Αυτό είναι λογικό αφού η ωρίμανση και η σκλήρυνση των τσιμέντων επιτυγχάνεται με την υδρόλυση του α-TCP σε απατίτη [40]. Εχει αναφερθεί ότι με τη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων της αρχικής φάσης αυξάνεται ο ρυθμός υδρόλυσης του α-TCP και ο σχηματισμός των κρυστάλλων του HAP εμφανίζεται πιο νωρίς [41]. Η παρουσία του β-TCP όμως ως δεύτερη φάση παραμένει μέχρι το τέλος της διεργασίας. 20 25 30 35 40 α α α β β β βα α β-TCP # 9-169 HAP # 9-432 α-TCP # 29-359 Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ 340h 7h 0h α β Σχήμα 5: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 100% α-TCP έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP και HAP. Η περιοχή εντός του περιγράμματος υποδικνύει τις κύριες κορυφές του απατίτη. Στο Σχήμα 6: παρουσιάζεται η μετατροπή του α-TCP σε απατίτη των τσιμέντων με σύσταση 90% α-TCP και 10% γύψο σε συνάρτηση με το χρόνο παραμονής τους στο Ringer. Και σε αυτήν την περίπτωση η παρουσία του β-TCP είναι αναπόφευκτη. Η γύψος δεν φαίνεται σε κανένα από τα τρία περιθλασιογράμματα (0h, 7h και 340h) πιθανόν λόγω του χαμηλού ορίου ανίχνευσης της παραπάνω ένωσης από τη συγκεκριμένη τεχνική. Οι κύριες χαρακτηριστηκές ανακλάσεις του στοιχειομετρικού απατίτη (HAP) ο οποίος σχηματίζεται στο εξαγωνικό σύστημα οφείλονται στα κρυσταλλογραφικά επίπεδα (2 1 1), (1 1 2), (3 0 0) και εμφανίζονται στις 31,60ο, 32,02ο και 32,72ο αντίστοιχα [47]. Στην περίπτωση των τσιμέντων οι παραπάνω κορυφές εμφανίζουν μεγαλύτερο πλάτος σε σχέση με το στοιχειομετρικό απατίτη γεγονός που δείχνει χαμηλότερη κρυσταλλικότητα. 87 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 20 25 30 35 40 β ββ β αα Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ γύψος # 33-311 340h 7h 0h β-TCP # 9-169 HAP # 9-432 α-TCP # 29-359 α β Σχήμα 6: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 90% α-TCP και 10% γύψο έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και των πρότυπων καρτών για τα α-TCP, β-TCP, HAP και γύψου. Η περιοχή εντός του περιγράμματος υποδικνύει τις κύριες κορυφές του απατίτη. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 γύψος # 33-311 Έ ντ α σ η ( a .u .) 2Theta 340h 7h 0h CSH Σχήμα 7: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 100% γύψο έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 0, 7 και 340 ώρες και πρότυπα φάσματα της γύψου και του ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH). Από το παραπάνω διάγραμμα (Σχήμα 7:) φαίνεται ότι, παρόλο που η κορυφή του ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) στις 14,7ο εξαφανίζεται από τις 0 ώρες, στο τελικό προϊόν εμφανίζονται οι κορυφές του στις 25,5ο και 31,9ο. Τα αμιγή τσιμέντα γύψου κατά την σκλήρυνσή τους δεν παρουσιάζουν κάποια ουσιαστική αλλαγή στη σύστασή τους από τη στιγμή που αφαιρούνται από το καλούπι. Αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματα που δείχνουν ότι ουσιαστικά δε μεταβάλλεται η αντοχή τους σε θλίψη μετά την απομάκρυση από τα καλούπια (Σχήμα 4:). 6.4.2 SEM Παρακάτω παρουσιάζονται εικόνες από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) των αμιγών και σύνθετων τσιμέντων που ελήφθησαν από το μικροσκόπιο LEO SUPRA 35VP που βρίσκεται στο ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ. Στην Εικόνα 41:Α παρατηρούνται σωματίδια α-TCP μεγέθους μικρότερο από 1μm. Στην Εικόνα 41:Β εμφανίζονται φυλλοειδές δομές του απατίτη οι οποίες υποδεικνύουν την έναρξη της υδρόλυσης του α-TCP. Στην Εικόνα 41:Γ διακρίνονται οπές οι οποίες δημιουργήθηκαν από τα σωματίδια TCP. Εικόνα 41: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων α-TCP πριν από την εισαγωγή (A) και έπειτα από την παραμονή τους σε διάλυμα Ringer για 7 (Β) και 340 (Γ) ώρες. Α Γ Β 89 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Στις Εικόνα 42:Α και Β φαίνεται η αρχή της δημιουργίας φυλλοειδών δομών που σε κάποιες περιπτώσεις (Β) έχει ολοκληρωθεί. Στις 340 ώρες παρουσιάζεται μια γενική εικόνα της επιφάνειας η οποία έχει καλυφθεί με κρυστάλλους απατίτη φυλλοειδούς μορφολογίας Εικόνα 42: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM σύνθετων τσιμέντων 90% α-TCP και 10% γύψου έπειτα από την παραμονή τους σε διάλυμα Ringer για 7 (Α,Β) και 340 (Γ) ώρες. Στην περίπτωση των αμιγών τσιμέντων γύψου οι κρύσταλλοι του γύψου με τη μορφή επιμήκων πλακών μεγέθους περίπου 6×2 μm έχουν σχηματισθεί ήδη κατά την αρχική σκλήρυνση (Εικόνα 43:Α). Μετά από 340 ώρες η μορφολογία παραμένει σχεδόν αμετάβλητη. Το γεγονός αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα θλίψης που αναφέρθηκαν στην παράγραφο 6.4 και τα οποία έδειξαν ότι η αντοχή σε θλίψη σταθεροποιείται μετά την αρχική σκλήρυνση (Σχήμα 4:). Β Γ Α Εικόνα 43: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων γύψου πριν από την εισαγωγή (A) και έπειτα από την παραμονή τους σε Ringer για 340 (Β) ώρες. 6.5 Αποδέσμευση βιοδραστικών ουσιών από τα τσιμέντα 6.5.1 Ιβουπροφαίνη 6.5.1.1 Ποσοτικός Προσδιορισμός Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ιβουπροφαίνης χρησιμοποιήθηκε φασματόμετρο UV/Vis διπλής δέσμης και η μέτρηση της απορρόφησης των διαλυμάτων έγινε σε μήκος κύματος λ=264 nm καθώς εκεί παρατηρήθηκε έντονη κορυφή στο διάγραμμα απορρόφησης-μήκους κύματος διαλυμάτων γνωστών συγκεντρώσεων ιβουπροφαίνης (Σχήμα 8:). Σχήμα 8: Φάσματα αποορρόφησης γνωστών συγκεντρώσεων ιβουπροφαίνης. Β Α 91 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Για τη δημιουργία της καμπύλης βαθμονόμησης παρασκευάστηκε αρχικά πυκνό πρότυπο διάλυμα (stock) συγκέντρωσης 120 ppm ιβουπροφαίνης σε διάλυμα PBS. Έπειτα, με λήψη κατάλληλων ποσοτήτων από το stock διάλυμα παρασκευάστηκαν διαλύματα γνωστών συγκεντρώσεων (3ppm, 6ppm, 12ppm, 16ppm, 20ppm, 30ppm, 40ppm και 60ppm). Η αραίωση έγινε με PBS και σύμφωνα με το νόμο της αραίωσης: Cstock ∙ Vstock = Cτελικό ∙ Vτελικό (6.5) όπου, γνωρίζοντας τη συγκέντρωση του πυκνού πρότυπου διαλύματος Cstock = 120ppm, την επιθυμητή συγκέντρωση του αραιωμένου διαλύματος Cτελικό και τον όγκο του αραιωμένου διαλύματος Vτελικό , υπολογίζόταν κάθε φορά ο όγκος του stock διαλύματος που έπρεπε να τοποθετηθεί στην ογκομετρικη φιάλη στην οποία παρασκευαζόταν το αραιωμένο διάλυμα. 0 20 40 60 80 100 120 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 A C (ppm) Σχήμα 9: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης της ιβουπροφαίνης για περιοχή συγκεντρώσεων 3 – 120 ppm. Από την ευθεία ελαχίστων τετραγώνων προέκυψεη εξίσωση: ∙ (6.6) Από το διάγραμμα του Σχήμα 9: φαίνεται ότι η γραμικότητα ισχύει για όλη την περιοχή των συγκεντρώσεων που παρασκευάστηκαν. Επομένως, μετρώντας την απορρόφηση των αγνώστων διαλυμάτων της ιβουπροφαίνης μπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση της αποδεσμευμένης ποσότητας και κατόπιν η εκατοστιαία αποδέσμευσή της. Στα παρακάτω διαγράμματα παρουσιάζεται η εκατοστιαία αποδέσμευση της ιβουπροφαίνης από τα δισκία που ήταν ενσωματωμένη σε ποσοστό 1% και 2%. Στο Σχήμα 10: φαίνεται ότι στο αμιγές τσιμέντο α-TCP (Α) στις 194 ώρες απελευθερώνεται όλη η ποσότητα της ιβουπροφαίνης (99,48% ± 6,22%) ενώ στο αμιγές τσιμέντο γύψου (Γ) καθώς και στο σύνθετο (Β) η αποδέσμευση είναι σημαντικά χαμηλότερη. Παρατηρείται ότι η μέγιστη εκατοστιαία απελευθέρωση του φαρμάκου είναι 44,33% ± 4,20% και 38,04% ± 1,13% αντίστοιχα. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 20 40 60 80 100 C ( % ) Χρόνος / Ώρες A Β Γ Σχήμα 10: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ιβουπροφαίνης (1%) συναρτήσει του χρόνου (Α: 99% α-TCP, Β: 89% α-TCP και 10% γύψος, Γ: 99% γύψος). Στην περίπτωση όπου το φάρμακο βρίσκεται σε ποσοστό 2% μέσα στα τσιμέντα (Σχήμα 11:) παρατηρείται ότι μετά από 414 ώρες δεν έχει επέλθει η μέγιστη απελευθέρωση της ιβουπροφαίνης που βρίσκεται στο αμιγές τσιμέντο α- TCP (Δ) αλλά το 90,23% ± 5,06%. Αντιθέτως, στο σύνθετο (Ε) και στο αμιγές τσιμέντο γύψου (Ζ) στις 194 ώρες εμφανίζεται η μέγιστη εκατοστιαία απελευθέρωση του φαρμάκου, η οποία είναι 30,69% ± 0,39% και 40,13% ± 3,25% αντίστοιχα. 93 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 20 40 60 80 100 C ( % ) Χρόνος / Ώρες Δ Z E Σχήμα 11: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ιβουπροφαίνης (2%) συναρτήσει του χρόνου (Δ: 98% α-TCP, Ε: 88% α-TCP και 10% γύψος, Ζ: 98% γύψος). Γενικά, συγκρίνοντας τις καμπύλες αποδέσμευσης, παρατηρήθηκε ότι στην περίπτωση των σύνθετων τσιμέντων των οποίων η στερεά φάση αποτελούνταν από 10% γύψο και 89% (Β) ή 88% (Ε) α-TCP υπήρξε πιο αργή αποδέσμευση φαρμάκου σε σχέση με τα αμιγή τσιμέντα α-TCP (Α και Δ) ή γύψου (Β και Ζ). 6.5.1.2 Χαρακτηρισμός με φασματοσκοπία FTIR/ATR Η πρώτη τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για το χαρακτηρισμό των τσιμέντων που περιείχαν το φάρμακο ήταν η FTIR/ATR. Από τα φάσματα που ακολουθούν παρατηρείται ότι στο καθαρό τσιμέντο α-TCP και στο σύνθετο εμφανίζεται η κορυφή της ιβουπροφαίνης σε κυματάριθμο 668 cm-1 ενώ στα αμιγή τσιμέντα γύψου η κορυφή αυτή επικαλύπτεται από την κορυφή της γύψου. Η κορυφή σε 1019 cm-1 οφείλεται στην ύπαρξη του α-TCP. Στο Σχήμα 12: εμφανίζονται κορυφές του φαρμάκου και σε 779, 1231 και 1721 cm-1. Επειδή η ποσότητα του φαρμάκου είναι μικρή (2%) και η διακριτική ικανότητα του μηχανήματος είναι επίσης σε αυτά τα όρια, η ένταση των κορυφών της ιβουπροφαίνης στα τσιμέντα είναι χαμηλή. Γενικά, η ιβουπροφαίνη εμφανίζει χαρακτηριστικές απορροφήσεις στο FTIR. Πιο συγκεκριμένα, η κορυφή σε 1721 cm-1 αποδίδεται στη δόνηση τάσης του δεσμού C=O, σε 1231 cm-1 στη δόνηση τάσης του δεσμού C-C και σε 779 και 668 cm-1 σε δονήσεις κάμψης του δεσμού Η-C-H εντός και εκτός επιπέδου αντίστοιχα [48]. Στους κυματάριθμους 564 και 603 cm-1 οι δύο κορυφές αποδίδονται στην τριπλώς εκφυλισμένη δόνηση κάμψης των φωσφορικών δεσμών Ο-P-O του υδροξυαπατίτη [49]. Σε 965 cm-1 η κορυφή είναι χαρακτηριστική λόγω των συμμετρικών δονήσεων τάσης των φωσφορικών δεσμών O-P-O. Οι απορροφήσεις στην περιοχή 1380-1480 cm-1 οφείλονται σε δονήσεις της ανθρακικής ομάδας. Τα ανθρακικά ιόντα είναι δυνατό να εισέλθουν στη δομή του απατίτη και να αντικαταστήσουν, σε ποσοστό περίπου 2%, είτε τα φωσφορικά ιόντα είτε τα ιόντα υδροξυλίου. Επίσης, και η κορυφή σε κυματαριθμό 1114 cm-1 προκύπτει από την παρουσία ανθρακικών [49]. 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 2% ibuprofen & 0% γύψος 0% γύψος Δ ια π ε ρ α τό τη τα ( a .u .) Κυματάριθμος / cm -1 1 0 1 9 ibuprofen 6 6 8 7 7 9 1 2 3 0 1 7 2 1 1114 965 603 564 1380 - 1480 Σχήμα 12: Φάσματα FTIR/ATR των δύο αμιγών παρασκευασμένων τσιμέντων α-TCP, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου. 95 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 2% ibuprofen & 10% γύψος Δ ια π ερ α τό τη τα ( a .u .) Κυματάριθμος / cm -1 ibuprofen 10% γύψος 6 6 8 1 0 1 9 66877912311721 Σχήμα 13: Φάσματα FTIR/ATR των δύο σύνθετων τσιμέντων α-TCP και 10% γύψου, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου. 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 6 6 7 Δ ια π ερ α τό τη τα ( a .u .) Κυματάριθμος / cm -1 2% ibuprofen & 100% γύψος ibuprofen 100% γύψος 5 9 7 1 0 9 8 1 6 8 2 1 6 1 9 Σχήμα 14: Φάσματα FTIR/ATR των δύο αμιγών παρασκευασμένων τσιμέντων γύψου, με 0% και 2% ιβουπροφαίνη, και του καθαρού φαρμάκου. Στα φάσματα της καθαρής γύψου (Σχήμα 14:) δεν εμφανίζονται κορυφές της ιβουπροφαίνης. Οι κορυφές που παρατηρούνται σε κυματάριθμους 597 και 667 cm-1 αντιστοιχούν στις δονήσεις κάμψης των θειϊκών ενώσεων ενώ σε 1098 cm-1 σε δονήσεις τάσης του δεσμού S-O. Οι απορροφήσεις που οφείλονται στις δονήσεις τάσης του Ο-Η του νερού εμφανίζονται σε 1619 και 1682 cm-1. Πιο συγκεκριμένα, η πρώτη κορυφή σχετίζεται με τις δονήσεις του νερού που υπάρχει στο ημιένυδρο θειϊκό ασβέστιο (CSH) ενώ η δεύτερη στο διένυδρο [51]. 6.5.1.3 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) Με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας ακτίνων-Χ έγινε χαρακτηρισμός των αμιγών και των σύνθετων τσιμέντων α-TCP και γύψου που περιείχαν το αντιφλεγμονώδες φάρμακο ιβουπροφαίνη σε ποσοστό 2%. Παρόμοια περιθλασιογράμματα ελήφθησαν και για τα τσιμέντα που περιείχαν 1% του φαρμάκου γι’αυτό δε θα αναφερθούν στη συνέχεια. Στο Σχήμα 15: φαίνεται η παρουσία του α-TCP πριν τοποθετηθούν τα δισκία καθαρού α-TCP με 2% ιβουπροφαίνη μέσα σε διάλυμα PBS ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία της αποδέσμευσης του φαρμάκου. Μετά από 414 ώρες παραμονής των δισκίων στο μέσο απελευθέρωσης, ελήφθησαν πάλι ακτινογραφήματα και παρατηρήθηκε εξάλειψη της α φάσης και ύπαρξη απατίτη, ενώ η β φάση του TCP εξακολουθεί να υφίσταται. 10 15 20 25 30 35 40 αα α Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ ibuprofen α-TCP β-TCP HAP πριν μετάH A P αβ β βα β αββ β β Σχήμα 15: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 98% α-TCP και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP, CDHA και ιβουπροφαίνης. Η περιοχή εντός του περιγράμματος υποδικνύει τις κύριες κορυφές του απατίτη. 97 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Στα παρακάτω περιθλασιογράμματα (Σχήμα 16:) εκτός από τις κορυφές του α-TCP, οι οποίες εξαφανίζονται μετά την σκλήρυνση που έχει πραγματοποιηθεί κατά την παραμονή των δισκίων στο PBS, εμφανίζονται και δύο κορυφές της γύψου, στις 11,63ο και 20,72ο, και έτσι επιβεβαιώνεται η ύπαρξή του (10%) στα συγκεκριμένα τσιμέντα. Επίσης, είναι και εδώ εμφανής η μετατροπή του α-TCP σε απατίτη. 10 15 20 25 30 35 40 β β γύ ψ ο ς γύ ψ ο ς H A P α Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ ibuprofen α-TCP γύψος HAP πριν μετά αβ α β ββ β α H A P Σχήμα 16: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 88% α-TCP, 10% γύψο και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, γύψου, CDHA και ιβουπροφαίνης. Η περιοχή εντός του περιγράμματος υποδικνύει τις κύριες κορυφές του απατίτη. Τέλος, στα διαγράμματα των τσιμέντων καθαρής γύψου με 2% ιβουπροφαίνη (Σχήμα 17:) δεν εμφανίζεται καμία κορυφή του φαρμάκου, ωστόσο εμφανίζεται ένα ίχνος ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) στις 25,5ο και 32,13ο. 10 15 20 25 30 35 40 C S H C S Hγύ ψ ο ς γύ ψ ο ς γύ ψ ο ς γύ ψ ο ς γύ ψ ο ς γύ ψ ο ς Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ ibuprofen CSH πριν μετά γύψος Σχήμα 17: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 98% γύψο και 2% ιβουπροφαίνη πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των γύψου, ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) και ιβουπροφαίνης. 6.5.1.4 SEM Από τα καθαρά και σύνθετα τσιμέντα με 2% ιβουπροφαίνη που παρασκευάστηκαν κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας, ελήφθησαν φωτογραφίες από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM), οι οποίες παρουσιάζονται στη συνέχεια. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το φάρμακο δεν εντοπίστηκε σε καμία φωτογραφία και γι’αυτό δεν ήταν εφικτός ο σχολιασμός σχετικά με τη μορφολογία και τη συσχέτισή του με τους κρυστάλλους απατίτη στα τσιμέντα. Στην Εικόνα 44: παρατηρούμε το σχηματισμό τόσο πλακοειδών (Α) όσο και βελονοειδών (Β) κρυστάλλων α-TCP. Όπως αναφέρεται στο υποκεφάλαιο 3.1.4, το μέγεθος και το σχήμα των σχηματισθέντων κρυστάλλων καθορίζεται από το μέγεθος των σωματιδίων α-TCP. Οι βελονοειδείς κρύσταλλοι οφείλονται σε λεπτόκκοκη σκόνη α-TCP, ενώ οι πεπλατυσμένοι κρύσταλλοι σε σκόνη μεγαλύτερου μεγέθους. 99 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα Εικόνα 44: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM αμιγών τσιμέντων α-TCP με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή τους στο διάλυμα PBS. Στην Εικόνα 45: είναι ορατή η διαδικασία της ανάπτυξης των κρυστάλλων απατίτη πάνω σε κρυστάλλους γύψου. Στη Β παρατηρείται καλύτερα η διεπιφάνεια μεταξύ απατίτη και γύψου. Εικόνα 45: Εικόνες από μικροσκόπιο SEM σύνθετων τσιμέντων 88% α-TCP και 10% γύψου με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή τους στο διάλυμα PBS. Στην Εικόνα 46: παρουσιάζεται κρύσταλλοι γύψου με τη χαρακτηριστική μορφολογία όπως αναφέρθηκε προηγούμένως. Εικόνα 46: Εικόνα από μικροσκόπιο SEM καθαρού τσιμέντου γύψου με 2% ιβουπροφαίνη πριν από την εισαγωγή του στο διάλυμα PBS. Α B Α Β 6.5.2 Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης χρησιμοποιήθηκε φασματόμετρο UV/Vis διπλής δέσμης και η μέτρηση της απορρόφησης των διαλυμάτων έγινε σε μήκος κύματος λ=493 nm. Σχήμα 18: Φάσματα αποορρόφησης γνωστών συγκεντρώσεων ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης. Για τη δημιουργία της καμπύλης βαθμονόμησης παρασκευάστηκε αρχικά πυκνό πρότυπο διάλυμα (stock) συγκέντρωσης 12 ppm ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης σε διάλυμα PBS. Στη συνέχεια, με λήψη κατάλληλων ποσοτήτων από το stock διάλυμα παρασκευάστηκαν διαλύματα γνωστών συγκεντρώσεων (1ppm, 1,6ppm, 4ppm, 5ppm, 6,4ppm, 8ppm και 10ppm). Από την ευθεία ελαχίστων τετραγώνων προέκυψεη εξίσωση: ∙ (6.7) 101 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 0 2 4 6 8 10 12 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 A C (ppm) Σχήμα 19: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης για περιοχή συγκεντρώσεων 1 - 12ppm. Από το παρακάτω διάγραμμα (Σχήμα 20:) φαίνεται ότι στο αμιγές τσιμέντο α-TCP (Η) στις 55 ώρες απελευθερώνεται όλη η ποσότητα της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (95,31% ± 7,49%) ενώ στο αμιγές τσιμέντο γύψου (Ι) παρατηρείται η μέγιστη εκατοστιαία απελευθέρωση της ουσίας στο 69,70% ± 7,46%. Στο σύνθετο τσιμέντο (Θ) εμφανίζεται πολύ μικρή μέγιστη αποδέσμευση της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (5,84% ± 0,33%) στο ίδιο χρονικό διάστημα. Τόσο αργοί ρυθμοί αποδέσμευσης αναφέρθηκαν πρόσφατα σε τσιμέντα πυριτικού ασβεστίου. Πιο συγκεκριμένα, αναφέρεται ότι σε χρονικό διάστημα 28 ημερών το εκατοστιαίο ποσοστό του φαρμάκου ρισεδρονάτη που απελευθερώθηκε ήταν περίπου 10% [52]. Αυτό οφείλεται στην ισχυρή προσρόφηση του φαρμάκου με τη στερεά φάση. Συνεπώς, στην περίπτωση που μελετήσαμε, θα πρέπει να διερευνηθεί η προσρόφηση της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης σε στερεά φάση που αποτελείται από α-TCP, γύψο και ανάμειξη αυτών. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 c ( % ) Χρόνος / Ώρες Η Θ Ι Σχήμα 20: Εκατοστιαία απελευθέρωση (c) της ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (0,2%) συναρτήσει του χρόνου (Η: 99,8% α-TCP, Θ: 89,8% α-TCP και 10% γύψος, Ι: 99,8% γύψος). 6.5.2.1 Χαρακτηρισμός με περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD) Ο χαρακτηρισμός των αμιγών και των σύνθετων τσιμέντων α-TCP και γύψου που περιείχαν την ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) σε ποσοστό 0,2% έγινε με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας ακτίνων-Χ. Στο Σχήμα 21: φαίνεται η παρουσία του α-TCP πριν τοποθετηθούν τα δισκία καθαρού α-TCP με 0,2% ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης μέσα σε διάλυμα PBS ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία της αποδέσμευσης του φαρμάκου. Μετά από 145 ώρες παραμονής των δισκίων στο μέσο απελευθέρωσης, ελήφθησαν πάλι ακτινογραφήματα και παρατηρήθηκε εξάλειψη του α-TCP σε αντίθεση με το β-TCP το οποίο εξακολουθεί να υπάρχει. Στα περιθλασιογράμματα του Σχήμα 22:, εκτός από τις κορυφές του α-TCP, οι οποίες εξαφανίζονται μετά την σκλήρυνση που έχει πραγματοποιηθεί κατά την παραμονή των δισκίων στο PBS, εμφανίζεται και μία κορυφή της γύψου, στις 11,63ο, και έτσι επιβεβαιώνεται η ύπαρξή της (10%) στα συγκεκριμένα τσιμέντα. Επίσης, είναι εμφανής η μετατροπή του α-TCP σε απατίτη. Σε καμία από τις δύο συστάσεις τσιμέντων δεν εντοπίστηκε η FITC καθώς το όριο ανίχνευσης του μηχανήματος XRD δεν το επιτρέπει. 103 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα 10 15 20 25 30 35 40 β β β β β ββ β β β α β α α αα α β-TCP πριν μετά FITC Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ α-TCP HAP α Σχήμα 21: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 99,8% α-TCP και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, β-TCP, HAP και FITC. 10 15 20 25 30 35 40 ααβ β β β α α α αα β Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ FITC α-TCP HAP γύψος πριν μετά γύ ψ ο ς Σχήμα 22: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 89,8% α-TCP, 10% γύψο και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των α-TCP, γύψου, HAP και FITC. Τέλος, στα διαγράμματα των τσιμέντων καθαρης γύψου με 0,2% ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης δεν εμφανίζεται κορυφή της ουσίας, ωστόσο διαπιστώνεται ένα ίχνος ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) στις 25,5ο και 32,13ο. 10 15 20 25 30 35 40 CSH μετά πριν γύψος Έ ντ α σ η ( a .u .) 2θ FITC Σχήμα 23: Περιθλασιογράμματα ακτίνων-Χ για τα δοκίμια με σύσταση 99,8% γύψο και 0,2% ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) πριν και μετά από τη διαδικασία απελευθέρωσής της από τα δοκίμια και πρότυπα φάσματα των γύψου, ημιένυδρου θειϊκού ασβεστίου (CSH) και FITC. 6.6 Συμπεράσματα Παρακάτω καταγράφονται τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη συγκεκριμένη διπλωματική εργασία. 1. Η πρώτη ύλη για την παρασκευή των οστικών τσιμέντων ήταν το α-TCP, το οποίο συντέθηκε στο εργαστήριο με αντίδραση ανθρακικού και πυρο- φωσφορικού ασβεστίου σε υψηλές θερμοκρασίες. Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε η δημιουργία υδροξυαπατίτη μετά την παραμονή των τσιμέντων είτε σε διάλυμα Ringer είτε σε PBS. Ο χαρακτηρισμός έγινε με φασματοσκοπία Raman και FTIR/ATR, XRD και μικροσκοπία SEM. 2. Η παρουσία της γύψου ως δεύτερη διεσπαρμένη φάση σε ποσοστό 10% w/w είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της αντοχής σε θλίψη των αμιγών τσιμέντων α-TCP. 3. Τα αμιγή τσιμέντα γύψου κατά την σκλήρυνσή τους, τόσο στο Ringer όσο και στο PBS, δεν παρουσιάζουν κάποια ουσιαστική αλλαγή στην αντοχή τους σε 105 Κεφάλαιο 6: Πειραματική Διαδικασία - Αποτελέσματα θλίψη. Η σκλήρυνσή τους έχει λάβει χώρα στις πρώτες 24 ώρες που βρισκοντουσαν ακόμα στα καλούπια στους 37οC. 4. Η ανάλυση SEM διασαφήνισε τη διαδικασία του μετασχηματισμού κατά τη διάρκεια της οποίας στρώσεις υδροξυαπατίτη σχηματίζονται γύρω από τους κρυστάλλους α-TCP καθώς αυτοί διαλύονται. 5. Παρατηρήθηκε ότι σε δοκίμιο τσιμέντου α-TCP είναι εφικτή η συνύπαρξη και πλακοειδών και βελονοειδών κρυστάλλων. Αυτό σημαίνει ότι το μέγεθος της σκόνης δεν είναι ομοιόμορφο σε όλο τον όγκο του τσιμέντου καθώς οι βελονοειδείς κρύσταλλοι οφείλονται σε λεπτόκκοκη σκόνη α-TCP, ενώ οι πεπλατυσμένοι σε σκόνη μεγαλύτερου μεγέθους. 6. Από τα πειράματα αποδέσμευσης των ουσιών διαπιστώθηκε ότι τα αμιγή τσιμέντα α-TCP απελευθερώνουν μεγαλύτερη ποσότητα από τα αμιγή γύψου και ακόμα περισσότερη από τα σύνθετα. 6.7 Προτάσεις για μελλοντική ερευνα 1. Μέτρηση του πορώδους των δοκιμίων που παρασκευάστηκαν ώστε να συσχετιστεί ο ρυθμός απελευθέρωσης του φαρμάκου με αυτό. 2. Πιθανή επίδραση της παρουσίας του φαρμάκου στις μηχανικές ιδιότητες των δοκιμίων. 3. Μελέτη του χρόνου πήξης (setting time) και της εγχυσιμότητας (injectability) της πάστας του τσιμέντου. Επίδραση της παρουσίας του φαρμάκου στις παραπάνω ιδιότητες. 107 Βιβλιογραφία [1] Ν. Μπουρόπουλος, «Σημειώσεις Επιστήμης Υλικών IV - Εισαγωγή στα Βιοϋλικά», Τμήμα Επιστήμης των Υλικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2008. [2] N. Patel, P. Gohil, «A Review on Biomaterials: Scope, Applications & Human Anatomy Significance», International Journal of Emerging Technology and Advanced Engineering, 2 (2012) 91-101. [3] B. Ratner, A. Hoffman, F. Schoen, J. Lemons, «Biomaterials Science – An introduction to materials in medicine», Academic Press, 2nd Edition, 2004. [4] A.M.M. Abdulrazzaq, «An in vitro study of genotoxicity of locally produced bovine pericardium», School of Dental Sciences, Health Campus, University of Sains Malaysia, 2007. [5] Drug Delivery Systems: http://www.biobasics.gc.ca/english/View.asp?x=785 [6] http://www.mddionline.com/article/polymers-controlled-drug-delivery [7] Ν. Μπουρόπουλος, «Προηγμένα Βιοϋλικά», Τμήμα Επιστήμης των Υλικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2011. [8] C. Vogelson, «Advances in drug delivery systems», Modern Drug Discovery, 4 (2001) 49-50. [9] Drug Delivery Solutions:http://landec.com/applications/drug-delivery-solutions [10] Μ. Μπέτσιου, «Φυσικές και συνθετικές ορυκτές ύλες ως φορείς ουσιών βιολογικής δράσης», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη 2012. [11] E. Verron, I. Khairoun, J. Guicheux, J. Bouler, «Calcium phosphate biomaterials as bone drug delivery systems: a review», Drug Discovery Today, 15 (2010) 547- 552. [12] Γ. Γκέκα, «Μελέτη της αποδέσμευσης βιοδραστικών ουσιών από μήτρες φωσφορικού ασβεστίου», Μεταπτυχιακή Εργασία, Τμήμα Φαρμακετικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2008. [13] Σ. Ροκίδη, «Βιολογική ασβεστοποίηση φυσικών και τεχνητών ιστών», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2011. [14] V. Budzynski, M. Chen, D. Hakimi-Mehr, M. Landy, M. Tsui, A. Tsvetkov, Q. Yang, «Lipid coatings for implantable medical devices», Pattent # WO 2009048645 A2. [15] M. Bohner, «Design of ceramic-based cements and putties for bone graft substitution», European Cells and Materials, 20 (2010) 1-12. [16] M. Sikiric, H. Milhofer, «The influence of surface active molecules on the crystallization of biominerals in solution», Advances in Colloid and Interface Science, 128 (2006) 135-158. [17] Ι. Χάφεζ, «Aνάπτυξη σύνθετων εναποθέσεων για την βελτίωση μηχανικών ιδιοτήτων κοκκωδών υλικών», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2006. [18] Ο. Κατσαμένης, «Σύνθεση και χαρακτηρισμός οστεϊκών τσιμέντων φωσφορικού ασβεστίου», Διπλωματική Εργασία, Τμήμα Επιστήμης των Υλικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2006. [19] M. Ginebra, C. Canal, M. Espanol, D. Pastorino, E. Montufar, «Calcium phosphate cements as drug delivery materials», Advanced Drug Delivery Reviews, 64 (2012) 1090–1110. [20] M. Ginebra, T. Traykova, J. Planell, «Calcium phosphate cements as bone drug delivery systems: A review», Journal of Controlled Release, 113 (2006) 102–110. [21] Μ. Λιόλιου, «Μελέτη της συσσωμάτωσης εδαφών μέσω in situ καταβύθισης ανόργανων αλάτων ασβεστίου», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2006. [22] H. Catherine, W. Skinner, «Studies in the Basic Mineralizing System, CaO-P2Os- H2O», Calcified Tissue Research, 14 (1974) 3-14. [23] Α.Κορωναίος, Γ. Πουλάκος, «Τεχνικά υλικά - Τόμος 1», Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Αθήνα 2006. [24] S. Parikh, «Bone graft substitutes: past, present, future», Journal of Postgraduate Medicine, 48 (2002) 142-148. [25] Β. Αθανασίου, «Πειραματική συγκριτική μελέτη αναγγειων μοσχευμάτων για την πλήρωση οστικών ελλειμμάτων», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2010. [26] C. Kelly, R. Wilkins, S. Gitelis, C. Hartjen, J. Watson, P. Kim, «The use of a surgical grade calcium sulfate as a bone graft substitute: results of a multicenter trial», Clinical Orthopaedics, 382 (2001) 42-50. [27] W. Walsh, P. Morgberg, Y. Yu, J. Yang, W. Haggard, P. Sheath, M. Svehla, «Response of a calcium sulfate bone graft substitute in a confined cancellous defect», Clinical Orthopaedics, 406 (2003) 228-36. [28] J. Lane, S. Khan, «Bone grafts of the 20th century: multiple purposes, materials and goals», Special to “Orthopaedics Today”, Jan. (2000) 1-12. [29] http://www.nsaids-list.com/nsaids-list/ibuprofen/ [30] http://synthesisofibuprofen.wikispaces.com/ [31] http://users.teiath.gr/petef/Web_Lessons/Lessons/IEK_Notes/IEK_Diagnoseis/IE K_Diagnoseis_IFA_Karkalousos.pdf [32] http://www.vcbio.science.ru.nl/en/fesem/eds/ 109 [33] Σ. Οικονομοπούλου, «Μελέτη της Αποδέσμευσης Αντιμικροβιακών Ουσιών από Πολυμερικές Μήτρες», Διδακτορική Διατριβή, Διατμηματικό- Διαπανεπιστημιακό πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στην Επιστήμη και Τεχνολογία Πολυμερών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2005. [34] R. Engelberg, «Silk encapsulated films for sustained release of Buprenorphine», Bachelor Thesis in Biomedical Engineering, Tufts University, 2010. [35] Δ. Φιλιππάτου, «Ποσοτικός προσδιορισμός της δραστικής ουσίας Δικαλουταμίδη (Bicalutamide) σε δισκία, με χρήση μη καταστροφικών μεθοδολογιών», Μεταπτυχιακή Εργασία, Τμήμα Φαρμακετικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα 2013. [36] Ο. Κατσαμένης, «Μελέτη Φυσικοχημικών και Μηχανικών Ιδιοτήτων Παθολογικά Αλλοιωμένων Ανθρώπινων Μηνίσκων», Μεταπτυχιακή Εργασία, Τμήμα Επιστήμης των Υλικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, 2009. [37] N. Singh, B. Middendorf, «Calcium sulphate hemihydrate hydration leading togypsum crystallization», Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials, 53 (2007) 57-77. [38] A. Ebrahimpour, M. Johnsson, F. Richardson, H. Nancollas, «The Characterization of Hydroxyapatite Preparations», Journal of Colloid and Interface Science, 159 (1993) 158-163. [39] S. Dorozhkin, M. Epple, «Biological and Medical Significance of Calcium Phosphates», Angew. Chem Int. Ed, 41 (2002) 3130-3146. [40] M. Ginebra, E. Fernadez, E. De Maeyer, R. Verbeeck, M. Boltong, J. Ginebra, F. Driessens, J. Plannel, «Setting reaction and hardening of an apatitic calcium phosphate cement», Journal of Dental Research, 76 (1997) 905-12. [41] M. Ginebra, F. Driessens, J. Plannel, «Effect of the particle size on the micro and nanostructural features of a calcium phosphate cement: a kinetic analysis», Biomaterials, 25 (2003) 3453-3462. [42] A. Antonakos, E. Liarokapis, T. Leventouri, «Micro-Raman and FTIR studies of synthetic and natural apatites», Biomaterials, 28 (2007) 3043-3054. [43] G. Sauer, W. Zunic, J. Durig, R. Wuthier, «Fourier Transform Raman Spectroscopy of Synthetic and Biological Calcium Phosphates», Calcified Tissue International, 54 (1994) 414-420. [44] H. Li, B. Ng, K. Khor, P. Cheang, T. Clyne, «Raman spectroscopy determination of phases within thermal sprayed hydroxyapatite splats and subsequent in vitro dissolution examination», Acta Materialia, 52 (2004) 445-453. [45] C. Silva, A. Sombra, «Raman spectroscopy measurements of hydroxyapatite obtained by mechanical alloying», Journal of Physics and Chemistry of Solids, 65 (2004) 1031–1033. [46] A. Jillavenkatesa, R. Condrate, «The Infrared and Raman Spectra of β- and α- Tricalcium Phosphate (Ca3(PΟ4)2)», Spectroscopy Letters, 31 (1998), 1619-1634. [47] S. Koutsopoulos, «Synthesis and characterization of hydroxyapatite crystals: A review study on the analytical methods», Journal of Biomedical Materials Research, 62 (2002) 600-612. [48] S. Ramukutty, E. Ramachandran, «Growth, spectral and thermal studies of ibuprofen crystal», Crystal Research and Technology, 47 (2012) 31-38. [49] B. Fowler, «Infrared studies of apatites. I. Vibrational assignments for calcium, strontium and barium hydroxyapatites utilizing isotopic substitution», Inorganic Chemistry, 13 (1974) 194-207. [50] P. Regnier, A. Lasaga, R. Berner, O. Han, K. Zilm, «Mechanism of carbonate substitution in francolite: Evidence from FTIR, 13C NMR and quantum mechanical calculations», American Mineralogist, 79 (1994) 809-818. [51] M. Lanzón, P. García-Ruiz, «Effect of citric acid on setting inhibition and mechanical properties of gypsum building plasters», Construction and Building Materials, 28 (2012) 506–511. [52] T. Gong, Z. Wang, Y. Zhang, C. Sun, Q. Yang, T. Troczynski, U. Hafeli, «Preparation, characterization, release kinetics and in vitro cytotoxicity of calcium silicate cement as a risedronate delivery system», Journal of Biomedical Materials Research, Part A (2013), doi: 10.1002/jbm.a.34908.
Comments
Report "Σύνθεση, χαρακτηρισμός και αποδέσμευση βιοδραστικών ουσιών από οστικά τσιμέντα με βάση το φωσφορικό ασβέστιο"