INMUNOLOGÍA IIUNIDAD II METODOS INMUNOLÓGICOS ESPECIALES Prof. QFB José Alberto Piña Ibarra [email protected] http://fcqb.uasnet.mx:8100/~apina/ 1 Reacciones Ag - Ac Aglutinación y precipitación Fijación del Complemento Métodos Inmunológicos Especiales Combinadas con electroforesis Inmunoelectroforesis y Western Blot Inmunofluorescencia Inmunoensayo : ELISA y RIA Varias : Inmovilización, serotipos, neutralización, protección Inmunomicroscopía Electrónicos 2 ELECTROFORESIS En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y aplica este nuevo método al fraccionamiento de proteínas plasmáticas, identificando así los anticuerpos como las proteínas del suero que se desplazan más lentamente. Esta fracción recibió el nombre de gamma-globulina, quedando así asociados temporalmente, los conceptos de anticuerpo y de gammaglobulina, como equivalentes. 3 1 4 .Fig. Esto se observó analizando los niveles de las distintas fracciones de globulinas antes y después de la inmunización de animales con un antígeno. sino que muchos de ellos lo hacen con las alpha y beta globulinas. 5 . Posteriormente. se comprueba que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las gammaglobulinas. 6 . Se concluye entonces. IgG. por lo que Hebermans propone el término de inmunoglobulinas para designar a todas las sustancias con capacidad de anticuerpo. IgD e IgE. Hoy se conocen cinco tipos de inmunoglobulinas: IgM. IgA. que no todos los anticuerpos son gammaglobulinas. cada una de ellas con ciertas características distintas 7 . Combinadas con electroforesis Finalidad separación electroforética componentes Ag Inmunoelectroforesis (Grabar y Williams) Contrainmunoelectroforesis (Laurell 1ª) Inmunoelectroforesis en cohete (Laurell 2ª) Western Blot 8 . 9 . Para su interpretación se compara las bandas de precipitación del suero problema con el suero testigo normal. posteriormente.Significado clínico Es una técnica inmunoquímica basada en la precipitación que tiene lugar cuando una proteína reacciona con su antisuero específico. en condiciones bien determinadas. Es un método analítico que se desarrolla en dos etapas. en el que una mezcla de proteínas es sometida a separación electroforética y. al estudio inmunoquímico (inmunodifusión). 10 . 11 . La electroforesis de proteínas se refiere a las inmunoglobulinas como grupo. La inmunoelectroforesis aumenta la capacidad para identificar las inmunoglobulinas específicas mediante el uso de anticuerpos específicos para las proteínas de interés.INMUNO ELECTROFORESIS Nombres alternativos Electroforesis de inmunoglobulina en suero. electroforesis de gammaglobulina Es una técnica de laboratorio en la que se emplea una combinación de electroforesis proteínica y una interacción antígeno-anticuerpo. Separación por electroforesis + Identificación por Inmunodifusión doble 12 . 13 . 14 . La muestra de suero se coloca en el pozo y se separa en un campo eléctrico Se coloca el antisuero en el canal y se permite que el suero y los anticuerpos se difundan durante 18-24 HR. 15 . Con un adminiculo adecuado se corta un pozo para el antígeno y un canal para el anticuerpo. o bien se puede lavar. y teñir la laminilla para un registro permanente. Las líneas resultantes pueden fotografiarse.DESARROLLO DE LA TECNICA Se cubre un portaobjetos con agar o agarosa. Utilidad clínica Diagnóstico de gamapatías monoclonales por ej. mieloma y macroglobulinemia de Waldeström. Evaluación de gamopatías monoclonales Enfermedades linfoproliferativas (linfomas malignos) Diagnóstico y caracterización de estados inmunodeficientes y disgamaglobulinemias 16 . 17 . 18 . INMUNOFLUORESCENCIA 19 . 20 .ANTECEDENTES HISTORICOS La inmunofluorescencia descrita por Coons en 1941. consiste en revelar motivos antigénicos presentes sobre la estructura celular o tisular mediante la aplicación sobre las moléculas de los tejidos de un antisuero especifico que previamente se vuelve fluorescente por la fijación de fluorocromo. de manera habitual. 21 . mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas fluorocromos. Se emplean.INMUNOFLUORESCENCIA Conjunto de técnicas diagnósticas empleadas para la detección de un antígeno o un anticuerpo en células o tejidos. en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes. 22 .INMUNOFLUORESCENCIA La marcación de la Inmunoglobulina . que debe respetar la actividad anticuerpo. se obtiene poniendo en contacto anticuerpos purificados con el fluorocromo. y después se elimina el exceso de fluorocromo por diálisis o filtración sobre gel Sephadex. Fluoróforos: hidrocarburos poliaromáticos o heterociclos). HO O O O C OH R2 Fluoresceína R1 . llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes. y el isotiocianato de rodamina. que da una fluorescencia verde.Los fluorocromos mas empleados : Son el isotiocianato de fluoresceína. 24 . que da una fluorescencia de color naranja. 25 . Técnicas de Inmunofluorescencia: a) Directa b) Indirecta c) De sándwich d) Complemento 26 . A. Secundario) 27 . Coons Acs conjugados fluorocromos Fluorescencia Directa Indirecta (Ac primario) (Ac.Fluorescencia 1944. INMUNOFluorescencia indirecta: Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos específicos no marcados se unen. en una primera etapa.INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOFluorescencia directa: Modalidad de inmunofluorescencia en la cual los anticuerpos marcados con fluorocromos se unen directamente al antígeno. es su mayor sensibilidad. al antígeno y. Se denomina también inmunofluorescencia tipo sándwich. en una segunda etapa. 28 . al anticuerpo marcado con fluorocromo. frente a la inmunofluorescencia directa. y su principal ventaja. Inmunofluorescencia directa: La que mas se emplea para los cortes de tejido. 29 . una prueba inmunohistoquímica ya que se utilizan anticuerpos marcados con especificidades conocidas para hacer visibles los antígenos correspondientes en frotis o en cortes de una sola capa de los materiales que llevan el antígeno. Es por lo general. Inmunofluorescencia indirecta: Sirve comúnmente para detectar anticuerpos en sueros humanos y de animales. 30 . Estas emplean antígenos conocidos. sueros de referencia y conjugados IgG anti-humanos. 31 .Inmunofluorescencia directa (presencia de antígeno en la muestra de una mujer con herpes genital) a virus Herpes simplex tipo 2 en una muestra genital. teñidas en verde. acompañadas de hematíes teñidos en rojo con el contracolorante (IF013). Se observa la presencia de células infectadas por el virus. Se observa la presencia de células infectadas con el citoplasma teñido de verde fluorescente. 32 .Inmunofluorescencia directa positiva (presencia de antígeno en la aspirado nasal de un niño con bronquiolitis) a virus respiratorio sincitial. mx/deptos/microbiologia/parasito/protozoa/amibaslibres.http://www.facmed.htm 33 .unam. Fluoresceína. Ficoeritrina 34 . Rodamina. Inmunofluorescencia indirecta positiva (presencia de anticuerpos en el suero de un paciente con paludismo) a Plasmodium falciparum. 35 . Se observa la presencia de trofozoitos de Plasmodium falciparum. teñidos de color verde fluorescente. en el interior de los hematíes. Se observa la morfología de la espiroqueta con sus espiras regulares.Inmunofluorescencia indirecta (FTA) positiva (presencia de anticuerpos en el suero) de un paciente con sífilis) sobre Treponema pallidum. de la misma longitud de onda. 36 . características del Género. teñida en verde con los anticuerpos fluorescentes. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la células infectadas. destacándose en el citoplasma unas zonas con una intensidad mayor. que corresponden a zonas de mayor replicación viral. 37 . y por tanto mayor fijación de anticuerpos.Técnica de inmunofluorescencia indirecta. Células MS infectadas con el virus de la Peste porcina africana. http://www2.es/confocal/manosidasa.uam.htm 38 .cbm. Inmunofluorescencia de sándwich En este se descubren anticuerpos específicos. 39 . por ejemplo en células plasmáticas. con el tratamiento inicial de cortes congelados con antígeno específico no marcado. después con anticuerpo marcado de la misma especificidad que los de la célula plasmática y de aquí el nombre de “técnica del emparedado”. El segundo paso consiste en el complemento de un especie (suero fresco total) y el tercero. 40 . en un conjugado que es especifico para un componente del complemento de esa especie. como en la tinción indirecta.Inmunofluorescencia del Complemento Supone un procedimiento en tres pasos. Primero se usan anticuerpos no marcados. 41 . INMUNOENSAYOS ENZIMATICOS LA TÉCNICA ELISA INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT 42 . . PM 44 kdal • fosfatasa alcalina(AP). PM 80-84. HRP).Ensayos con marca enzimática • Las más utilizadas son: • peroxidasa (horseradish peroxidase.5 kDal • Ventajas • disponibles comercialmente • se pueden conjugar por técnicas simples • tienen varios sustratos. Captura de anticuerpos E Ac marcado E E Sustrato + Ag muestra Señal Ag muestra + Ac marcado Señal [Ag] .Competitivo. Captura de antígeno Señal Antígeno marcado [Ag] Señal Muestra Lavado .Competitivo. “sandwich” de anticuerpos Exceso de antígeno eliminado por lavado bloqueante Ag + E E Sustrato Señal Señal Curva standard [Ag] .No competitivo. • Métodos de detección: • a) Espectrofotométrico o colorimétrico.Ensayos con marca enzimática • Generación de la señal • La última parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimática es la cuantificación de la enzima.Se mide la aparición de un producto luminiscente. . • b)Fluorométrico. Se mide la aparición de un cromóforo.Se mide la aparición de un producto fluorescente • c)Quimioluminiscente. 10-21 moles) AP: quimioluminiscencia fluorescencia color 1 100 50000 HRP: 25000 -2000000 .Ensayos con marca enzimática: límites de detección (zeptomoles. haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima.LA TÉCNICA ELISA La técnica de Elisa es un procedimiento de ensayo inmunoenzimático cuyo nombre resulta de la asociación de las iniciales de su denominación inglesa (enzyme linked inmuno sorbent assay). 49 . Como todo ensayo inmunoenzimático. para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biológicos. la prueba recurre al empleo de inmunógenos. que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios sobre grandes poblaciones. 50 . de manera sencilla y económica. Es una técnica altamente sensible y de gran especificidad.LA TÉCNICA ELISA El método ELISA está recomendado fundamentalmente para el estudio de poblaciones. 51 .LA TÉCNICA ELISA Esta técnica presenta además una buena reproducibilidad y facilidad en la interpretación de los resultados. ). hormonas.LA TÉCNICA ELISA Fue concebida independientemente en 1971 en Suecia y Holanda. 52 . siendo aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (antígenos. fármacos. anticuerpos. etc. parasitarias o virósicas. micósicas. 53 . antígenos y anticuerpos en infecciones bacterianas. siendo utilizada como el primer sustituto de la técnica de Radioinmunoensayo en la medición de hormonas.LA TÉCNICA ELISA El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida. inmunoglobulinas. Hepatitis.TIPOS DE TÉCNICAS ELISA: Técnicas cualitativas: Son técnicas Elisa que nos indican la ausencia ó presencia de un antígeno o anticuerpo determinando. Ejemplo: HIV. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antígenos. etc. 54 . Técnicas cuantitativas: Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad de antígeno ó anticuerpo presente en la muestra. etc. Ejemplo: Hormonas. Marcadores tumorales. 55 . Los kits incluyen +/-6 estándares (sueros de diferentes concentraciones del antígeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para así poder determinar la concentración de la muestra. poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. agregándose posteriormente un sustrato cromogénico de la enzima marcadora.LA TÉCNICA ELISA PROCEDIMIENTO: De un modo general se procede a la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido. marcadas con una enzima (peroxidasa de rábano picante). El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial. 56 . LA TÉCNICA ELISA La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo por medio de espectrofotometría cantidad de producto enzimático resultante. 57 . PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TÉCNICA ELISA: Dispensar muestras Dispensar conjugado Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente Lavar los pozos Dispensar cromógeno/sustrato Incubar a 37ºC o a temperatura ambiente Dispensar solución de parada Leer en lector de tiras ó placas de ELISA 58 . Los sueros problema por duplicado han sido colocados en el resto de la placa. se observan positivos (azul) y negativos (sin color). En la primera línea se observa el suero control positivo y en la segunda el negativo. 59 . En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado. 60 . se basa en la fijación de un anticuerpo a la fase sólida. el cual atrapa los antígenos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima.El procedimiento se efectúa de dos formas principalmente: Método directo: También conocido como método Sándwich (Anticuerpo-antígenoanticuerpo). que en caso de reaccionar con el anticuerpo de la placa. se añade el substrato para revelar la reacción. sobre el que se añadirá el macerado del órgano sospechoso. será puesto en evidencia tras la adición del segundo anticuerpo marcado con la enzima. En esta forma. 61 . Por último. la placa suele ya venir con un anticuerpo fijado (monoclonal ó policlonal) frente al antígeno problema.La modalidad más frecuente del método ELISA para la determinación de antígenos es el modelo ELISA "Sándwich". 62 . (2) se incuba con la muestra problema. Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados. (3) se añade el conjugado. (1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antígeno suele estar ya unido a la placa.Fases de la técnica Elisa Sándwich. (4) por último el sustrato. la placa de ELISA del antígeno (en los Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en el suero problema existen anticuerpos específicos. consiste en la inmovilización a 63 . proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos.ELISA INDIRECTO Es el método más utilizado para la determinación de anticuerpos. Básicamente. Se pueden utilizar como antígenos. (4) y por último. (3) posteriormente.Fase de la técnica Elisa indirecto. 64 . el sustrato. (1) El antígeno se pega a la placa (2) Se añade el suero problema. el conjugado. La cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.LA TÉCNICA ELISA Método competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. 65 . frente a un antígeno conocido.ELISA DE COMPETICIÓN En este sistema también es muy utilizado para la detección de anticuerpos específicos. Se denomina de competición ya que el suero problema es incubado previamente con el antígeno. lavado y finalización con el sustrato y lectura. y por tanto compite con él. antes de incubarlo con el antisuero fijado en la placa. que previamente ha sido inmovilizado en la placa. 66 . Los pasos siguientes es la adición e incubación del conjugado. Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal). Técnica Elisa de competición. (1) Se incuba el suero problema con el antígeno. (4) después. En este caso la ausencia de color sería positivo. el sustrato. 67 . (2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero anti antígeno (3) se añade el conjugado. ELISA Quimioluminiscencia: Substrato luxogénico Sensibilidad (5. 10 –18 M Ag) 68 . Este método utiliza como soporte antigénico filtros de nitrocelulosa. Se recomienda cuando no hay que estudiar un gran número de sueros o para analizar sueros dudosos por otras técnicas. 69 . manteniendo total o parcialmente sus propiedades antigénicas.INMUNOELECTROTRANSFERENCIA O WESTERBLOT La inmunoelectrotransferencia "westerblot" o "Immunoblotting" es una técnica inmunoenzimática que se utiliza para la detección de anticuerpos específicos. donde las proteínas del antígeno han sido previamente transferidas. Western Blotting Identificar proteína: Ag Ac 70 . Material necesario para la realización de la inmunotransferencia: Tiras de nitrocelulosa antigenadas. conjugado. sueros de referencia positivo y negativo. Tampon PBS. solución sustrato y soporte plástico para realizar todos los procesos. 71 . PIPETAS LAVADOR DE PLACAS 72 . LECTOR DE PLACAS ELISA LECTOR DE TIRAS ELISA 73 FIJACION DE COMPLEMENTO Detectar Ag o Ac (suero) utilizando una fuente de C' y un sistema indicador (GR carnero sensibilizados) • Controles: .- Suero + No hemólisis .- Suero Neg. Hemólisis .- Gr solos Lisis espontánea .- Suero en estudio – Ag + C' + GR: Lisis .- Ag – Suero en estudio + C' + GR Lisis 74 Radioinmunoensayos ( RIA ) Técnica muy sensible para detectar Ag o Ac . Unión competitiva entre Ag* y Ag por Ac de alta afinidad Desventajas: pérdida de sensibilidad durante el almacenamiento radioactividad, deterioro marcaje y precausiones exposición humana a radioactividad 75 Microscopía Inmunoelectrónica: Componentes intracelulares Acs conjugados a marcadores electrodensos Oro Oro Ferritina Radio E’s DAB 76 . 77 . 78 .