Biotecnología 2ed

BIOTECNOLOGÍAUNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Rector Gustavo Eduardo Lugones Vicerrector Mario E. Lozano BIOTECNOLOGÍA Segunda edición actualizada María Antonia Muñoz de Malajovich Bernal, 2012 Colección Biomedicina Dirigida por Daniel Gomez Muñoz de Malajovich, María Antonia Biotecnología. - 2a ed. - Bernal : Universidad Nacional de Quilmes, 2012. 448 p. : il. ; 22x15 cm. - (Biomedicina / Daniel Eduardo Gomez) ISBN 978-987-558-255-2 1. Biotecnología. 2. Productos Biotecnológicos. I. Título CDD 664 Traducción del portugués y revisión técnica de la primera edición en español: Gabriela Levitus Título original: Biotecnologia © 1ª edición, Axcel Books do Brasil Editora, 2004 © María Antonia Malajovich, 2004 1a edición en español, 2006 1a reimpresión, 2007 2a edición, actualizada, 2012 © María Antonia Muñoz de Malajovich, 2006 © Universidad Nacional de Quilmes, 2006 Roque Sáenz Peña 352 (B1876BXD) Bernal, Buenos Aires http://www.unq.edu.ar [email protected] Diseño: Mariana Nemitz ISBN: 978-987-558-255-2 Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723 Índice Nota a la segunda edición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Presentación, por Daniel Gomez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1. La biotecnología tradicional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2. La biotecnología moderna. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3. Las definiciones de biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4. El impacto de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 5. Biotecnología y desarrollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 6. Historia de la biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 PRIMERA PARTE. FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGÍA Los agentes biológicos Capítulo II. Las células y los cromosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 1. La célula como unidad de los seres vivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Unidad estructural. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Unidad funcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2. Técnicas de laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3. Toda célula proviene de otra preexistente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4. Los cromosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 5. Teoría cromosómica de la herencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 6. Células y cromosomas como agentes biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 Capítulo III. Los microorganismos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 1. La diversidad microbiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Las eubacterias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Las arquibacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Los protozoarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Las algas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Los hongos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Los virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 2. Las técnicas de laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3. Bioseguridad y bioprotección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4. Microorganismos como agentes biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 1. Las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Estructura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 Algunas técnicas de laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 La electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 2. Las enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 La catálisis enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Los diversos tipos de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3. Los anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 La molécula de anticuerpo y el reconocimiento del antígeno. . . . . . . . . . . . . 82 La producción de anticuerpos en el organismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 La producción de anticuerpos en el laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 Utilización de los anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 1. Los ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 2. El código genético. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 3. La expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 El flujo de la información genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Células procariotas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Células eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 4. El complejo mundo del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 5. La genómica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 El genoma humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 El desarrollo de la genómica en América Latina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 Las herramientas básicas Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 1. Los procesos fermentativos y la industria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 2. Los microorganismos industriales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 Nociones sobre el metabolismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 Metabolismo primario y secundario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 El origen de las cepas industriales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Medios de cultivo y materia prima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 3. Los diferentes tipos de bioprocesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Los procesos tradicionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Los procesos sumergidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 4. Del laboratorio a la industria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 El cambio de escala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 La operación del proceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 La recuperación del producto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 5. Los bioprocesos en la industria de fertilizantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 1. La micropropagación de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Las etapas necesarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Los medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 Las diferentes modalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 El mejoramiento y la conservación de la biodiversidad vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 La difusión de la tecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 2. El cultivo de células animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 Manipulación in vitro de las células animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 Aplicaciones del cultivo in vitro de células de mamíferos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 Capítulo VIII. Tecnología del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 1. Las herramientas disponibles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 La extracción del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 Las nucleasas y las enzimas de restricción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 La electroforesis del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 Hibridización y sondas génicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 La técnica de Southern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 La técnica del Fingerprint . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 La síntesis y amplificación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 La secuenciación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 Los arrays o matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 2. La biología sintética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Capítulo IX. Ingeniería genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 1. El nacimiento de la biotecnología moderna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 Los primeros experimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 Mitos y realidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 2. Las bibliotecas de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 3. La construcción de un microorganismo recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 Encontrar el gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 Transferir el gen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 Identificar a los microorganismos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 4. La construcción de plantas transgénicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 El transgén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 Transferencia de genes a células vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 El problema de los marcadores de selección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 Del laboratorio al campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 5. Células y animales transgénicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 La transferencia de genes a células animales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 Los animales transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 Los rebaños farmacéuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 SEGUNDA PARTE. BIOTECNOLOGÍA Y SOCIEDAD Capítulo X. Biotecnología, industria y energía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 1. El proceso Weizmann . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 2. La industria química . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 La vía química . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 3. La vía biotecnológica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 4. Los productos biotecnológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 Metabolitos de interés comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 Biopolímeros y bioplásticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 5. Los biocombustibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Etanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 Biogás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 La utilización del biogás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 Biodiesel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189 6. Perspectivas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 1. El desarrollo sustentable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 2. Las tecnologías limpias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 La sustitución de procesos industriales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 La sustitución de insumos agrícolas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 3. La reducción de los residuos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 La degradación de la basura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 El tratamiento de las aguas residuales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 El tratamiento de los efluentes industriales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 Las emisiones de gases y el efecto invernadero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 4. La biorremediación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 Los contaminantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Los derrames de petróleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 5. La recuperación de recursos naturales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 El petróleo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 Los metales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 La biominería . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 6. El diagnóstico de contaminación ambiental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Indicadores biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Técnicas inmunológicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Técnicas genéticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 Biosensores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 1. La desaparición de los ecosistemas naturales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 2. El hombre y las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 Las plantas alimenticias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 La producción de alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217 Las plantas comerciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 Las plantas medicinales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 3. La biodiversidad amenazada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 La erosión genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 La expansión del agronegocio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 La transgénesis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 4. La protección de la biodiversidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224 Los centros de diversidad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224 La conservación de la biodiversidad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 La conservación in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226 El CGIAR y el Centro Internacional de la Papa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 El Protocolo de Cartagena de Bioseguridad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 1. La evolución de las prácticas agrícolas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 Antes de 1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 Después de 1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 2. La obtención de nuevas variedades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Mutación y selección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Alteración del número de cromosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 Ingeniería genética. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 3. El principio precautorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 4. Las plantas biotecnológicas actuales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 Plantas con propiedades agronómicas modificadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239 Plantas con calidad nutricional mejorada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 Plantas con propiedades nuevas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 5. El agronegocio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 La extensión de los cultivos transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 El mercado de semillas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246 La Unión Europea y la moratoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 Los países de América Latina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 6. ¿La coexistencia es posible? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 1. La nutrición de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 La necesidad de raciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 De Liebig a la vaca loca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 La composición de las raciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 Las raciones transgénicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 2. El mejoramiento genético del ganado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 Las tecnologías reproductivas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 Las nuevas tecnologías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 3. El mejoramiento de la producción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 Carne, leche, huevos y lana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 La acuicultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 4. La salud de los animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264 Resistencia a las enfermedades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264 Prevención y tratamiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 5. Los nuevos usos de los animales domésticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 Modelos de estudio para enfermedades humanas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 Xenotrasplantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 Los animales como biorreactores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 El marco conceptual de “las tres R”. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 6. Las mascotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 1. Los alimentos fermentados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 El pan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 El vino. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 El rol de la levadura en la vinificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 La cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 Los quesos y yogures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 2. La proteína unicelular (micoproteína) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 3. Los aditivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 Los diversos tipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 Los edulcorantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 4. Los alimentos biofortificados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 5. Seguridad alimentaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 1. La entrada de los transgénicos en la cadena alimentaria . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Mejorando la conservación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Mejorando las propiedades industriales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 Mejorando las características nutricionales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 2. La polémica generada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 3. Lo que el consumidor necesita saber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 Alimentos seguros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 La ingestión de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 Los marcadores de resistencia a antibióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 La composición centesimal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 La producción de toxinas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 La producción de alérgenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295 La utilización de un promotor viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 Otros efectos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 4. Cómo garantizar la seguridad alimentaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 El principio de equivalencia sustancial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 La evaluación de riesgos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297 El etiquetado de los alimentos transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298 Etiquetado e información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299 El rastreo de un transgén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 1. Las enfermedades infecciosas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 2. La adquisición de inmunidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302 Las respuestas primaria y secundaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302 Los mecanismos de defensa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302 3. Los diferentes tipos de vacunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 Primera generación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 Segunda generación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Tercera generación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 4. La producción de vacunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 Investigación y desarrollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 309 Aspectos tecnológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310 Aspectos económicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312 Un sector estratégico para la sociedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 5. El rol de las vacunas en la erradicación de enfermedades. . . . . . . . . . . . . . . . 314 El caso de la viruela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314 El caso de la poliomielitis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316 El caso de la influenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 6. La amenaza de las enfermedades emergentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319 7. El bioterrorismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico . . . . . . . . . 323 1. Las pruebas de diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323 Las tendencias actuales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 ¿Qué es una buena prueba de diagnóstico? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 Las diferentes técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325 2. Las pruebas de rastreo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328 3. El diagnóstico de enfermedades infecciosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329 4. La tipificación de tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 Sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 Otros tejidos y órganos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 5. La práctica forense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332 6. El diagnóstico de enfermedades genéticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 Las limitaciones de las pruebas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 Las estrategias seguidas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336 Diagnóstico preventivo y predictivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . 341 1. La industria de medicamentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341 2. Los principios activos de las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 El caso de la aspirina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 Los fitoterápicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344 Las nuevas tecnologías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344 La necesidad de un marco legal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345 3. Los antibióticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 El caso de la penicilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 Los límites al uso de los antibióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 La necesidad de innovación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348 4. Las primeras moléculas terapéuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 El caso de la insulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 5. Las proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353 Las bases tecnológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353 Los productos y sus usos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 La industria biotecnológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 6. Los medicamentos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 La farmacogenómica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 La farmacogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361 7. El costo de los nuevos medicamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362 8. Patentes y genéricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos . . . . . . . . . . . . . 365 1. La aprobación de un tratamiento nuevo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365 2. El progreso de las inmunoterapias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365 3. El cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 Una enfermedad de origen genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 Las terapias biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369 Las vacunas terapéuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370 4. Las terapias génicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 Terapia somática y germinal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 Los altibajos de una tecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 El estado del arte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374 Las promesas del silenciamiento génico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375 5. Los trasplantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378 Los trasplantes de órganos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378 La ingeniería de tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379 Las células madre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 Capítulo XXI. Consideraciones finales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387 Índice temático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433 Nota a la segunda edición Pasaron seis años entre las dos ediciones de este libro. En ese lapso de tiempo, sobrellevamos una crisis económica mundial y aprendimos que los cambios climáticos pueden alterar nuestra forma de vida. La investigación científica impulsó la expansión de las “ómicas”. Tecnologías como la del ARN interferente fueron asimiladas rápidamente, del mismo modo que la biología sintética en sus primeros pasos. La biotecnología se afianzó en el sector agrícola y abrió senderos nuevos en la industria. El progreso incesante en el área de salud está siendo terminantemente vinculado a la reflexión ética. Todos los sectores integraron los principios de bioseguridad, estableciendo normas para prevenir o mitigar los riesgos de tecnologías recientes. Incorporado en los diversos niveles educativos, el saber biotecnológico se encuentra al alcance de las nuevas generaciones. Agradezco a la Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes por darme la posibilidad de publicar este libro en su segunda edición actualizada. María Antonia Muñoz de Malajovich Río de Janeiro, octubre de 2012. 17 Presentación El libro Biotecnología nos acerca a un camino fascinante y abierto. Su autora, María Antonia Muñoz de Malajovich, nos introduce con singular didáctica a una de las más promisorias especialidades biológicas del siglo XXI, y nos brinda una visión abarcativa y dinámica. Desde el inicio es certera en la definición del paradigma: entiende la biotecnología como “una actividad basada en conocimientos multidisciplinarios, que utiliza agentes biológicos para hacer productos útiles o resolver problemas”. Y desde ese marco conceptual, la autora nos ayuda a ver cómo la biotecnología influencia, a veces sin que lo sepamos, los más diversos aspectos del quehacer humano. No solo ahonda en los fundamentos de la disciplina, sino que también profundiza en sus aplicaciones industriales, agrícolas, pecuarias, alimentarias, medioambientales y energéticas. No rehúsa explicitar los aspectos polémicos de estas tecnologías, tan difundidos, tan poco probados. Nos recuerda que lo bueno de una tecnología es lo bueno que hacemos con ella. Analiza y advierte sobre las transformaciones que produce en la sociedad, los aspectos culturales, económicos, políticos y diplomáticos. Como médico, no puedo hallar más que fascinante la sección sobre “Biotecnología y salud”, donde la autora se detiene reflexivamente a esbozarnos un panorama de cómo será la medicina del futuro. ¿Y por qué este libro era tan necesario? ¿Qué importancia tiene la biotecnología en Argentina? La Argentina es uno de los países latinoamericanos que más rápidamente ha utilizado y desarrollado nuevos productos biotecnológicos, en especial ciertas proteínas recombinantes de aplicación terapéutica, al igual que variedades vegetales resistentes a herbicidas e insectos, lo cual explica en parte la reciente oleada de expansión agrícola. Queda claro que un país cuyo sector agroalimentario es uno de los pilares de su economía y más aun de sus exportaciones, no puede estar de espaldas a estos conocimientos. Pongamos solo a modo de ejemplo un aspecto biotecnológico, digamos el agrícola. En la actualidad hay en el mundo 90 millones de hectáreas con plantaciones transgénicas: 49 están en los Estados Unidos, y 20 en nuestro país, segundo en el ránking mundial. 19 Biotecnología Por lo tanto, en el mundo, y en particular en nuestros países, en esta etapa del desarrollo histórico, el conocimiento se ha constituido en un elemento central del nuevo paradigma social y productivo vigente, resignificando el valor social de la formación. A las instituciones de educación superior les cabe un papel central, tanto en la formación de recursos humanos como en la producción, adaptación y difusión del conocimiento necesario para potenciar el desarrollo biotecnológico. La Licenciatura en Biotecnología de la Universidad Nacional de Quilmes (UNQ) fue creada con el inicio de la propia universidad. Al normalizarse la misma en 1992, la carrera comenzó como Ingeniería Genética y luego en 1994 se transformó en lo que es hoy la Licenciatura en Biotecnología, la cual a través de la impronta de sus diferentes directores ha permitido a la UNQ constituirse en una de las instituciones de referencia para la realización de estudios biotecnológicos. Nuestro país tiene excelentes biotecnólogos y enormes desafíos y posibilidades. María Antonia Muñoz de Malajovich es un ejemplo paradigmático: una científica argentina que debió exiliarse en el exterior en épocas oscuras de nuestra historia, pero que radicada en Brasil, y desde la docencia y la investigación consolida, y permite, justamente, alcanzar esos desafíos: educar en biotecnología, lograr la comprensión social de esas herramientas y posibilitar su alcance masivo a toda la población. Con todos estos antecedentes, entonces, no es más que un motivo de profundo orgullo que la Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes pueda publicar este valioso texto. Mi más sincero agradecimiento a la autora por su enorme generosidad. A Diego Golombek, quien me contagió el interés para su edición. A María Bjerg y a todo el equipo de la Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes, sin los cuales este logro no sería posible. Y a Gabriela Levitus y Argenbio por la pasión en difundir esta maravillosa ciencia. Daniel Gomez 20 A todos los que participaron de la experiencia de ciencia y ciudadanía que fue la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, donde tuve el privilegio de estudiar entre 1960 y 1966. A Hugo. Agradecimientos Desde niña tuve la suerte de estar en contacto con personas de orígenes y culturas muy diversas. Intervinieron en mi formación básica mis padres, Gori Muñoz y Mari Carmen García Antón, mi hermana Carmen, los republicanos españoles que se reunían todos los domingos en nuestro departamento de la calle Lafinur, mis profesores del Collège Français de Buenos Aires y los de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires. En 1966, la intervención militar en la Universidad, con su “noche de los bastones largos”, me llevó por un tiempo a Chile, donde trabajé para el Ministerio de Educación. De regreso a Buenos Aires, durante varios años fui profesora de biología en el Liceo Franco Argentino Jean Mermoz. En 1977, y residiendo ya en Brasil, tuve la oportunidad de volver a la vida académica, completando la maestría y el doctorado en genética en la Universidad Federal de Río de Janeiro. A mitad de la década de 1980, fui invitada por ORT Brasil para integrar el grupo de trabajo que iría a elaborar un estudio preliminar sobre los rumbos de la biotecnología en ese país. World ORT es una institución filantrópica judía que mantiene centros de educación y entrenamiento tecnológico en 50 países, y en esa época, el consejo académico de la institución, presidido por el profesor Efraim Katzir, identificó a la biotecnología como una de las áreas promisorias en que la institución debía invertir esfuerzos. Ya entonces era evidente que si bien las tecnologías biológicas generarían aplicaciones nuevas a gran velocidad, esto representaría un gran desafío para la educación. Paralelamente a mi colaboración en el grupo de trabajo de ORT Brasil y a mis actividades universitarias, tuve la oportunidad de participar como profesora del Lycée Molière de Río de Janeiro en un seminario sobre las nuevas tendencias de la enseñanza de la biología que tuvo lugar en el Centre International d’ Études Pédagogiques (Sèvres, Francia, 1987). También visité diversos centros de enseñanza de biotecnología en Inglaterra (National Centre for School Biotechnology, University of Sheffield y The London Centre for Biotechnology) e Israel (escuelas ORT de Karmiel y Ramat Gan). 23 Biotecnología Hasta ese momento, mi vida profesional había transcurrido en un vaivén entre la investigación científica y la educación, generalmente en función de las oportunidades existentes. Encontraba satisfacción en el trabajo de mesada del laboratorio, pero me sentía un poco aislada del mundo. A pesar de gustarme mucho la docencia, la encontraba algo repetitiva y acababa diseñando experimentos que trajeran un poco de frescura a la clase, a veces en detrimento de la transmisión rigurosa de los conceptos teóricos programáticos que también me eran exigidos. La enseñanza de biotecnología solo tiene sentido dentro del contexto que hoy se denomina ciencia, tecnología y sociedad. Por eso representaba para mí un campo nuevo donde podía integrar lo más atractivo de cada una de mis actividades profesionales anteriores: estudiar, investigar, experimentar, innovar, aplicar y, además, comunicarme con otras personas. En ORT Brasil iniciamos las actividades de biotecnología con la elaboración de material didáctico para docentes de química y biología de la enseñanza secundaria. Lamentablemente, a pesar de contar con el asesoramiento de varios profesores de la Universidad de San Pablo y de la Universidad Federal de Río de Janeiro, este proyecto no tuvo continuidad. Sin embargo, fue el punto de partida para la preparación de los programas y las actividades prácticas del Curso Técnico de Biotecnología que creamos en 1992 en el Instituto de Tecnología ORT de Río de Janeiro, y del cual soy la Coordinadora. Desde entonces mi trabajo en biotecnología se centró alrededor de dos líneas: ¿qué enseñar? y ¿cómo enseñar? En la primera busco determinar cuáles son los conocimientos científicos y tecnológicos indispensables para entender la biotecnología y poder analizar sus alcances y limitaciones. En la segunda me propongo encontrar diferentes formas de transmitir esos conocimientos y divulgar la biotecnología. En esta tarea, así como en el desempeño de mis actividades docentes e institucionales, tuve siempre la colaboración de los profesores y técnicos que integraron mi equipo de trabajo en ORT Brasil. Destaco también la participación crítica de los alumnos, que se reveló estimulante y productiva, especialmente en la elaboración de sus trabajos de fin de curso. El éxito alcanzado en sus estudios posteriores y en su vida profesional nos llena de satisfacción a todos. En diversas oportunidades pude transmitir parte de esa experiencia a los docentes y estudiantes de instituciones públicas y privadas del Brasil (Universidad del Estado de Río de Janeiro, 1988; congresos de Educación de la Universidad de San Pablo, 1991,1994; cursos de biotecnología para los alumnos del Colegio Pedro II de Río de Janeiro, 1994,1995,1996; Unincor, Universidad Vale do Rio Verde, 2005), de Uruguay (conferencias, cursos 24 Agradecimientos y talleres organizados por ORT Uruguay en 1990; en la Escuela Integral Hebreo Uruguaya, 1996, 2000; en el Instituto Ariel, 2000 y en la Universidad ORT Uruguay, 2005) y de Venezuela (Asesoramiento a ORT Venezuela sobre la introducción de tópicos de biotecnología en los programas de la Escuela Moral y Luces Herzl Bialik entre 1991 y 1996; cursos para docentes, 1991, 1994). Esos cursos, así como las discusiones mantenidas a lo largo del tiempo con mis colegas y alumnos sobre el impacto de las biotecnologías en nuestra sociedad, fueron poco a poco transformándose en la base de este texto. Sin embargo, el libro solo adquirió una estructura formal debido a la iniciativa de Ricardo Reinprecht y a su equipo editorial de Axcel Books do Brasil, a quienes agradezco la primorosa edición brasileña de 2004. Gracias a Susana Sommer y Rubén Cucchi, esa primera edición llegó a Alberto Díaz y a través de él al Consejo Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes y a Gabriela Levitus, directora de ArgenBio. Agradezco a todos ellos, y especialmente al rector de la UNQ, Dr. Daniel Gomez, por la oportunidad de publicarlo en mi país, encontrando raíces que creía perdidas, y cerrando así un largo ciclo de ausencia. Desde mis primeros contactos con la Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes fue claro, para todos los involucrados, que a pesar del poco tiempo transcurrido desde la publicación de la primera edición, había que actualizar y ampliar el texto, incluyendo ejemplos latinoamericanos. Aunque conservé la estructura básica del libro, resultó una tarea de gran envergadura, ya que varias partes tuvieron necesariamente que ser escritas de nuevo, en el idioma original. La traducción es de Gabriela Levitus, a quien debo también una revisión técnica rigurosa. Además de un cuidado minucioso en el tratamiento de todos los detalles, agradezco a Gabriela por el contagioso despliegue de energía con que enfrentó la tarea. Agradezco también a Mónica Aguilar por resolver eficientemente los aspectos formales de esta edición, así como a Rafael Centeno y a todos aquellos que en la Editorial de la Universidad Nacional de Quilmes posibilitaron con su trabajo la publicación de este libro. En todo momento recibí el cariño de mi familia y el estímulo de mis amigos Susana Sommer, Rubén Cucchi, Danièle Covo, Charlotte y José Grunberg. Agradezco también a Hugo Malajovich, mi compañero desde los viejos tiempos del Centro de Estudiantes de Ciencias Naturales, por la lectura crítica del texto y la paciencia con que encaró los largos meses que dediqué a escribirlo. 25 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? 1. LA BIOTECNOLOGÍA TRADICIONAL El cultivo de vegetales, la domesticación de animales, la transformación de los alimentos y el aprovechamiento de las propiedades curativas de algunas plantas son actividades que se remontan a los albores de la humanidad y fueron desarrolladas a partir del conocimiento empírico, ignorando la existencia de los microorganismos o de las leyes de la herencia. A comienzos del siglo XIX, la demanda de mano de obra para el desarrollo de una industria incipiente estimula la migración de la población del campo a la ciudad. En condiciones sanitarias cada vez peores, las enfermedades y el hambre acompañan al hombre. Al mismo tiempo que el progreso exige procesos industriales más eficientes, la comprensión de los fenómenos naturales se vuelve indispensable para responder a las necesidades de la sociedad. A partir de 1850 surgen nuevas áreas del conocimiento; nacen la microbiología, la inmunología, la bioquímica y la genética. La química industrial evoluciona aceleradamente y, también, aumenta la intervención de la ingeniería agrícola y de la pecuaria en la explotación del campo. En 1914, Karl Ereky, un ingeniero agrónomo húngaro, desarrolla un gigantesco plan de cría de porcinos para sustituir las prácticas tradicionales por una industria agrícola capitalista basada en el conocimiento científico. Se le debe a Ereky (1919) la primera definición de biotecnología, como “la ciencia de los métodos que permiten la obtención de productos a partir de materia prima, mediante la intervención de organismos vivos”. Para él, la era bioquímica reemplazaría a la edad de la piedra y del hierro. El siglo XX asiste a un desarrollo extraordinario de la ciencia y la tecnología (electrónica, informática). De la convergencia de ambas resultan logros extraordinarios en varios sectores productivos, donde los seres vivos constituyen la base de aplicaciones tan diversas como la generación de variedades vegetales más productivas, la fabricación de nuevos alimentos, el tratamiento de los residuos y la producción de enzimas y antibióticos. 27 Biotecnología 2. LA BIOTECNOLOGÍA MODERNA La propuesta de Watson y Crick (1953) de un modelo helicoidal para la molécula de ADN representa, sin duda, un hito fundamental en la historia de la biología molecular. Sin embargo, la división entre la biotecnología tradicional y la biotecnología moderna responde a una serie de experiencias, realizadas por H. Boyer y S. Cohen, que culminan en 1973 con la transferencia de un gen de sapo a una bacteria. A partir de ese momento es posible cambiar el programa genético de un organismo transfiriéndole genes de otra especie. La importancia y los riesgos inherentes a la nueva tecnología no pasaron desapercibidos para las personas involucradas. Como un hecho inédito en la historia, los científicos reunidos en 1975 en Asilomar (Estados Unidos) establecieron una moratoria en sus trabajos hasta que se definieran las condiciones de seguridad adecuadas, lo que sucedió poco tiempo más tarde. En el paso de la biotecnología de laboratorio a una biotecnología industrial, la ingeniería genética ocupa un lugar destacado como tecnología innovadora. En algunos casos, como los de la producción de insulina y hormona de crecimiento, la innovación consiste en reemplazar los métodos de obtención tradicionales. En otros, se trata de productos completamente nuevos, como los anticuerpos monoclonales y el arroz dorado. Sin embargo, la manipulación genética no es la única herramienta disponible. La biotecnología abarca hoy un área amplia del conocimiento que surge de la ciencia básica (biología molecular, microbiología, biología celular, genética, etc.), de la ciencia aplicada (técnicas inmunológicas y bioquímicas, así como técnicas basadas en la física y la electrónica), y de otras tecnologías (fermentaciones, separaciones, purificaciones, informática, robótica y control de procesos). Se trata de una red compleja de conocimientos donde la ciencia y la tecnología se entrelazan y complementan. 3. LAS DEFINICIONES DE BIOTECNOLOGÍA El impacto causado por las primeras experiencias de ingeniería genética originó numerosos intentos por redefinir el campo de la biotecnología. A través del reemplazo de la expresión “intervención de organismos vivos” por “empleo de procesos celulares y moleculares” se trató de diferenciar a la biotecnología clásica de la moderna. Sin embargo, debido a la enorme difusión de las técnicas de manipulación genética, ambas acabaron superponiéndose, y fuera del contexto histórico resulta difícil distinguir el límite entre ambas. 28 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? Por otro lado, como la definición de un conjunto de actividades depende de los intereses de los grupos involucrados, muchas veces refleja la visión de los sectores profesionales predominantes. Por eso, si revisamos los textos de la década de 1980, años en que la expresión “biotecnología” comienza a difundirse, hallaremos más de una docena de definiciones diferentes del término. Mencionamos a continuación algunas de las definiciones más frecuentes. Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE): la aplicación de los principios de la ciencia y la ingeniería al tratamiento de materias por agentes biológicos en la producción de bienes y servicios (1982). Oficina de Evaluación Tecnológica (OTA, Office of Technology Assessment): biotecnología, en un sentido amplio, incluye cualquier técnica que utilice organismos vivos (o parte de ellos) para obtener o modificar productos, mejorar plantas y animales, o desarrollar microorganismos para usos específicos (1984). Federación Europea de Biotecnología (EFB, European Federation of Biotechnology): uso integrado de la bioquímica, la microbiología y la ingeniería genética para poder aplicar las capacidades de microorganismos, células cultivadas animales o vegetales o parte de los mismos en la industria, en la salud y en los procesos relacionados con el medioambiente (1988). E. H. Houwink: el uso controlado de la información biológica (1989). Organización de la Industria Biotecnológica (BIO, Biotechnology Industry Organization): en un sentido amplio, biotecnología es “bio” + “tecnología”, es decir, el uso de procesos biológicos para resolver problemas o hacer productos útiles (2003). Se observa que, con el tiempo, el concepto adquiere una expresión más simple. Las definiciones más recientes ya no hacen referencia a los procesos tecnológicos involucrados, tal vez porque además de ser complejos y variados, evolucionan muy rápidamente. En este texto consideraremos a la biotecnología de una manera amplia, definida como una actividad basada en conocimientos multidisciplinarios, que utiliza agentes biológicos para hacer productos útiles o resolver problemas (Figura 1). Esta definición engloba muchas de las actividades practicadas por ingenieros, químicos, agrónomos, veterinarios, microbiólogos, biólogos, médicos, abogados, empresarios, economistas, etcétera. 29 Biotecnología FIGURA 1. El campo de la biotecnología Conocimientos Ciencia y tecnología Agentes biológicos Organismos, células, organelas, moléculas Biotecnología Hacer productos útiles Resolver problemas 4. EL IMPACTO DE LA BIOTECNOLOGÍA No se trata de promesas o de perspectivas futuras: los productos y procesos biotecnológicos forman parte de nuestra vida cotidiana, ofreciendo oportunidades de empleo e inversiones. Se trata de plantas resistentes a enfermedades, plásticos biodegradables, detergentes más eficientes, biocombustibles, procesos industriales menos contaminantes, además de centenas de ensayos de diagnóstico y medicamentos nuevos (Tabla 1). 5. BIOTECNOLOGÍA Y DESARROLLO Por tratarse de un conjunto de tecnologías de varios tipos, el uso de las biotecnologías no se restringe necesariamente a los países desarrollados. Existe un espacio que los países emergentes pueden ocupar, en función de sus riquezas naturales, siempre que existan prioridades económicas y políticas definidas claramente. La condición fundamental es contar con instituciones competentes que formen una masa crítica de investigadores y personal técnico entrenado. China e India cuentan hoy con una industria biotecnológica avanzada y diversificada. También América Latina, donde se concentra principalmente en Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Cuba y México. Países como Uruguay y Venezuela también tienen actividad en algunas áreas, así como, en menor escala, Ecuador, Costa Rica, Paraguay, Perú y Bolivia. En la región, unas 500 empresas inciden en varios sectores: medioambiente e industria, agroalimentos y pecuaria, salud animal y humana. 30 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? TABLA 1. Productos y servicios de origen biotecnológico, en diferentes sectores Sector Energía Industria Tipos de productos o servicios Etanol, biogás y otros combustibles (a partir de biomasa). Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas, etcétera. Numerosas enzimas para otras industrias (textil, detergentes, etcétera). Recuperación de petróleo, biorremediación (tratamiento de aguas residuales y de basura, eliminación de contaminantes). Abono, silaje, bioinsecticidas, biofertilizantes, plantines libres de enfermedades, plantines de árboles para reforestación. Plantas con nuevas características incorporadas (transgénicas) para mayor valor nutritivo, resistencia a plagas y a condiciones de cultivo adversas (sequía, salinidad, etcétera). Embriones, animales con características nuevas (transgénicos), vacunas y medicamentos para uso veterinario, hormonas. Panificación (panes y bizcochos), lácteos (quesos, yogures y otras bebidas lácteas), bebidas (cervezas, vinos y bebidas destiladas) y aditivos diversos (salsa de soja, glutamato de sodio, edulcorantes, etc.); proteína unicelular (PUC) para raciones, alimentos de origen transgénico con propiedades nuevas. Antibióticos y medicamentos para diversas enfermedades, hormonas, vacunas, reactivos y pruebas de diagnóstico, etcétera. Medioambiente Agricultura Pecuaria Alimentación Salud Así y todo, la biotecnología suscita opiniones y sentimientos encontrados. Mientras algunos sectores la perciben como una tecnología basada en un sólido conocimiento científico, para otros se trata de una actividad antinatural y peligrosa. El enfrentamiento de partidarios y opositores ocurre con menos frecuencia en el terreno de las razones que en el de las pasiones, sean estas políticas, religiosas o ideológicas. Al discutir si la biotecnología es progresista o reaccionaria, buena o mala, se olvida que lo que caracteriza a una tecnología es el uso que hacemos de ella. Algunos productos y procesos que eran impensables hace treinta años entran en nuestra vida cotidiana sin que sus bases científicas y tecnológicas hayan penetrado en nuestra cultura a través de una divulgación amplia que 31 Biotecnología abarque también todos los niveles del sistema educativo. No existe ninguna posibilidad de construir una sociedad moderna si sus integrantes ignoran los aspectos más generales de la ciencia y la tecnología. El desconocimiento aumenta el riesgo de rechazar tecnologías promisorias que pueden abrir nuevas perspectivas de desarrollo sostenible en áreas tan críticas como la salud, la producción de alimentos, la energía y el medioambiente. La propuesta de este libro es revisar los fundamentos de las biotecnologías y mostrar cómo se aplican en diversos sectores productivos de la sociedad, destacando como ejemplos algunos emprendimientos latinoamericanos exitosos. Esperamos que sea de ayuda para todos los que nos interesamos por los alcances de esta fascinante (r)evolución tecnológica. 6. HISTORIA DE LA BIOTECNOLOGÍA Antigüedad Preparación y conservación de alimentos y bebidas por fermentación (pan, queso, cerveza, vino y vinagre); cultivo de plantas (papa, maíz, cebada, trigo, etc.); domesticación de animales; tratamiento de infecciones (con productos de origen vegetal como el polvo de crisantemo y derivados de soja fermentada). Edad Media Siglo XII Edad Moderna Siglo XVI Cronistas registran que los aztecas recolectaban algas para la alimentación, en los lagos del centro de México. Inicio de la producción comercial de cerveza; extracción de metales por acción microbiana en España; cultivo de hongos en Francia; Hooke descubre la existencia de células (1665). Invento de la máquina a vapor (1752). A partir de 1750 crece el cultivo de leguminosas en Europa y se difunde la práctica de rotación de cultivos, aumentando la productividad y mejorando el uso de la tierra. Destilación del alcohol. Siglo XVII Siglo XVIII 32 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? Edad Contemporánea 1797 1809 1835 a 1855 1863 a 1886 Jenner inmuniza a un niño con un virus que lo protege contra la viruela. Appert utiliza el calor para esterilizar y conservar comida, proceso que será utilizado en las campañas napoleónicas. Schleiden, Schwann y Virchow enuncian la teoría celular. Pasteur inventa un proceso, la pasteurización, para conservar alimentos sin alterar sus propiedades organolépticas (1863), derriba la teoría de la generación espontánea (1864), investiga las enfermedades del gusano de seda (1865), identifica a la levadura como el agente responsable de la fermentación alcohólica (1876), usa microorganismos atenuados para obtener vacunas contra el ántrax y el cólera (1881), realiza las primeras pruebas con una vacuna contra la rabia (1881). Paralelamente, Koch inicia el desarrollo de técnicas fundamentales para el estudio de los microorganismos (1876) y enuncia cuatro postulados sobre los agentes infecciosos como causa de las enfermedades. En 1865 Mendel presenta su trabajo “Experiencias de hibridación en plantas”. Se inaugura en París el Instituto Pasteur. Se descubre el virus del mosaico del tabaco; introducción del tractor en la agricultura. Büchner demuestra que las enzimas extraídas de la levadura pueden transformar el azúcar en alcohol. Primer trasplante de un órgano: un riñón de un perro a otro. Redescubrimiento de las leyes de la herencia, ya enunciadas por Mendel en 1865 y luego olvidadas. Se realiza el primer trasplante de córnea con éxito, porque la córnea no tiene antígenos. Ehrlich descubre el primer agente quimioterapéutico, llamado Salvarsan, que sería utilizado contra la sífilis. En Manchester, Inglaterra, comienza la introducción de sistemas de purificación de cloacas basados en la actividad microbiana. Rhöm obtiene la patente de una preparación enzimática para el lavado de la ropa. Weizmann consigue producir acetona y butanol usando microorganismos. Morgan publica su libro Mecanismos de la herencia mendeliana. 1887 1892 1897 1899 1900 1905 1906 1910 1912 a 1914 1915 33 Biotecnología 1916 1918 Se logra inmovilizar enzimas, facilitando su empleo en procesos industriales. Más de veinte millones de personas mueren de gripe española, un número de víctimas superior al de la Primera Guerra Mundial. Se construyen los primeros biodigestores para la producción de metano (China e India). El ingeniero agrónomo húngaro Ereky utiliza por primera vez la palabra biotecnología. Muller descubre que los rayos X causan mutaciones. F. Griffith descubre la transformación, es decir, la transferencia de información genética de una cepa bacteriana a otra. Comercialización de semillas de maíz híbrido, un maíz más productivo. Obtención de ácido cítrico por fermentación. En Francia, producción comercial de un bioinsecticida (Bacillus thuringiensis). Avances en la mecanización del trabajo agrícola. Producción a gran escala de la penicilina (descubierta por Fleming en 1928 y desarrollada por Florey y Chain). Inseminación artificial de ganado usando semen congelado. McClintock descubre la presencia de genes saltarines en maíz. Watson y Crick proponen un modelo para la estructura del ADN. Reinart regenera plantas de zanahoria a partir de un cultivo de células (callo). Aumento de la producción de ácido láctico, ácido cítrico, acetona y butanol por fermentación. Descubrimiento del código genético. La empresa danesa Novo produce una proteasa alcalina para uso en jabones para lavar ropa. Comienza en México la siembra de nuevas variedades de trigo más productivas, iniciando lo que se conocería después como Revolución Verde. Se realiza el primer trasplante de corazón en Sudáfrica. El paciente sobrevive 18 días. 1919 1927 1928 1933 1936 1938 1940 a 1950 1944 1951 1953 1959 1960 1961 1962 1967 34 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? 1968 1973 Producción industrial de aminoácidos utilizando enzimas inmovilizadas. Luego de desarrollar técnicas de corte y ligación del ADN, Cohen y Boyer transfieren un gen de una especie a otra. Se lanza en Brasil el programa de producción de alcohol a partir de biomasa (Pró-Álcool). Kohler y Milstein desarrollan la tecnología de hibridomas y obtienen anticuerpos monoclonales. Novo produce jarabe de alta fructosa por vía enzimática, para ser usado como edulcorante alternativo a la sacarosa. La Conferencia de Asilomar solicita al Instituto Nacional de Salud (NIH, National Institute of Health) que se establezcan normas que reglamenten los experimentos con ADN recombinante, lo que sucedería meses más tarde. Genentech, la primera empresa biotecnológica fundada un año antes por Boyer y Swanson, obtiene la proteína somatropina (hormona de crecimiento) mediante la tecnología de ADN recombinante. Nace el primer “bebé de probeta”, en Inglaterra. La Corte Suprema de Justicia de Estados Unidos aprueba el principio de patentes para las formas de vida de origen recombinante. Las primeras patentes son de Chakrabarty para un microorganismo para biorremediación de petróleo y de Cohen y Boyer por el proceso de 1973. Mullis inventa la técnica de “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) cuya patente será obtenida por Cetus en 1985 y vendida en 1991 a Hoffman-La Roche por 300 millones de dólares. Se obtienen las primeras células vegetales (callos) modificadas genéticamente. Se inicia la comercialización de la insulina humana de origen recombinante de Genentech. La empresa Eli Lilly obtiene una licencia y la vende con el nombre de Humulina. Se comercializa en Europa la primera vacuna de ADN recombinante para el ganado. Se obtienen las primeras plantas por ingeniería genética (tabaco y petunia). Syntex Corporation recibe la aprobación de la FDA (Food and Drug Administration) para un test para Chlamydia trachomatis basado en anticuerpos monoclonales. Se aísla el virus VIH en el Instituto Pasteur (Francia) y en el Instituto Nacional de Salud (NIH, Estados Unidos). 1975 1977 1978 1980 1981 1982 1983 35 Biotecnología 1984 Jeffrey introduce la técnica Fingerprint (huella genética), que un año después sería utilizada por los tribunales para la identificación de sospechosos. Chiron clona y secuencia el genoma del virus VIH. La Agencia de Protección Ambiental (EPA, Enviromental Protection Agency) de Estados Unidos aprueba la liberación de plantas de tabaco transgénicas. Un grupo de expertos en bioseguridad, de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), declara que la predictibilidad de los cambios genéticos obtenidos por ingeniería genética es frecuentemente mayor que la correspondiente a las técnicas tradicionales, y que los riesgos asociados a los organismos transgénicos pueden evaluarse de la misma manera que los riesgos asociados a los otros organismos. Se aprueba la primera vacuna biotecnológica para uso humano, la Recombivax-HB, contra la hepatitis B. La Advanced Genetic Sciences libera a campo bacterias recombinantes que inhiben la formación de hielo en cultivos de frutilla, en California; la FDA aprueba el factor activador del plasminógeno obtenido por ingeniería genética, para el tratamiento de ataques cardíacos. Se patenta un ratón transgénico, desarrollado especialmente por la Universidad de Harvard para el estudio del cáncer. En la misma década los europeos obtienen la patente de otro ratón transgénico sensible a sustancias carcinogénicas. Genencor International Inc. consigue la patente de un proceso que permite producir enzimas (proteasas) resistentes a blanqueadores (proceso bleach) para la fabricación de jabones para lavar la ropa. Se inicia el mapeo del genoma humano con la creación del Centro Nacional de Investigación del Genoma Humano. Primera experiencia de terapia génica para una enfermedad rara (ADA), en una niña de cuatro años. Pfizer comercializa ChyMax, una enzima recombinante para la preparación de quesos. GenPharm International, Inc. obtiene una vaca transgénica que produce en la leche proteínas humanas para alimentación infantil. La Universidad de California y la de Stanford suman 100 patentes relacionadas con la metodología del ADN recombinante. 1992 Científicos norteamericanos y británicos elaboran una técnica que permite detectar anormalidades, como la fibrosis quística y la hemofilia, en embriones in vitro. 1986 1987 1988 1989 1990 36 Capítulo I. ¿Qué es la biotecnología? 1993 1994 1995 1996 Se aprueba el empleo de la hormona de crecimiento bovina rBGH/ rBST de Monsanto, para aumentar la producción de leche. Se lanza al mercado el tomate FlavSavr, que por la inactivación de un gen puede madurar en la planta. Se descifra el primer genoma de una bacteria, Haemophilus influenzae. Se completa la secuenciación del primer genoma de un organismo eucarionte, la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se desarrolla el primer GeneChip (Stanford, Affymetrix). En el Instituto Roslin (Gran Bretaña) nace Dolly, una oveja clonada, y más tarde una segunda oveja, Polly, clonada y genéticamente modificada. Hay más de 1.500 empresas de biotecnología en Estados Unidos y más de 3.000 en el mundo. Se emplean células madre embrionarias para regenerar tejidos. Se secuencia el primer genoma animal, el del gusano Caenorhabditis elegans. Se completa la secuencia del primer cromosoma humano. F. Collins, del Consorcio del Genoma Humano, y C. Venter, de Celera, anuncian simultáneamente la obtención del borrador del genoma humano. Se completa la secuencia del genoma de la mosca Drosophila melanogaster, de una planta (Arabidopsis thaliana) y, en Brasil, de una bacteria que ataca a los cítricos (Xylella fastidiosa). Se completa el borrador de la secuencia del genoma humano, publicado simultáneamente en las revistas Science y Nature. Se secuencian los genomas de plantas de interés agronómico (arroz, banana) para los países en desarrollo. Se secuencian genomas de bacterias de importancia agronómica. Se completa el borrador del proteoma funcional de la levadura; secuenciación del genoma del agente y del vector que transmite la malaria; se identifican más de 200 genes involucrados en la diferenciación de las células madre; se descubre la participación de moléculas de ARN en la regulación de varios procesos celulares. Se vende como mascota el GloFish, un pez transgénico que brilla en la oscuridad, originalmente diseñado para detectar contaminantes. Clonan varios tipos de animales y de especies amenazadas de extinción. Entran al mercado nuevos ensayos de diagnóstico y medicamentos como el Avastin (bevacizumab). 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 37 Biotecnología 2006 2007 Un grupo de investigadores liderado por S. Yamanaka consigue inducir la pluripotencialidad celular (iPS). Las autoridades europeas de seguridad alimentaria concluyen que los genes marcadores de resistencia a los antibióticos no representan riesgos relevantes para la salud animal o humana, o para el medioambiente. Investigadores japoneses desarrollan la primera rosa azul, genéticamente modificada. Es autorizado en la Unión Europea el cultivo de la papa Amflora (BASF) para uso industrial. Investigadores del Instituto J. Craig Venter construyen la primera célula sintética. 2008 2010 38 PRIMERA PARTE FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGÍA Los agentes biológicos Capítulo II. Las células y los cromosomas 1. LA CÉLULA COMO UNIDAD DE LOS SERES VIVOS Unidad estructural La célula es la unidad estructural de los seres vivos. Sean bacterias, amebas, espermatozoides o neuronas, las células están formadas por agua, iones inorgánicos y moléculas orgánicas (proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos). Todas ellas presentan una membrana plasmática que separa al citoplasma del medio externo y permite el intercambio de moléculas entre ambos. Las células procariotas se encuentran exclusivamente en el Reino Monera. Pequeñas (0,001 a 0,005 mm) y con requerimientos nutricionales simples, estas células se multiplican rápidamente. La información genética se encuentra en un cromosoma circular, formado por una molécula de ADN y asociado a una invaginación de la membrana plasmática (mesosoma). También se pueden encontrar pequeñas moléculas circulares adicionales (plásmidos). Hay numerosos ribosomas que aseguran la síntesis proteica (Figura 1, A). La estructura de las células eucariotas es mucho más compleja, y se las encuentra en los cuatro reinos restantes (Protista, Fungi, Plantae y Animalia). Con un tamaño que varía entre 0,01 y 0,10 mm, estas células son diez veces más grandes que las procariotas. La presencia de compartimientos diferenciados (organelas) que cumplen actividades específicas resulta en una subdivisión del trabajo, que garantiza la eficiencia del funcionamiento de la célula (Figura 1, B y C). El citoplasma es atravesado por un sistema de membranas, el retículo endoplasmático, que a su vez está asociado a los ribosomas y, por consiguiente, a la síntesis de proteínas. Los productos celulares son procesados en el aparato de Golgi y luego secretados o distribuidos en otras estructuras (lisosomas, membrana celular). Hay organelas citoplasmáticas complejas y rodeadas de membranas, como las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas, que están asociadas al metabolismo energético. El citoesque41 Biotecnología leto, formado por túbulos y filamentos proteicos, mantiene la forma de la célula, además de asegurar el transporte interno de las organelas y de los movimientos celulares. La información genética está distribuida en cromosomas, cada uno de ellos formado por una molécula lineal de ADN asociada a proteínas. Los cromosomas y el nucleolo se encuentran en el núcleo, que funciona como un centro de control celular. La membrana nuclear, un envoltorio con poros que separa al núcleo del citoplasma, permite el intercambio de sustancias entre ambos. A pesar de tener una organización muy parecida, las células animales difieren de las células vegetales en algunos aspectos. En las células vegetales encontramos una pared celular alrededor de la membrana plasmática; el citoplasma contiene cloroplastos, donde ocurre la fotosíntesis, y grandes vacuolas donde se almacenan sustancias y degradan macromoléculas. Ninguna de estas estructuras se observan en las células animales; estas tienen un centríolo que falta en las células vegetales (Tabla 1). FIGURA 1. Representaciones esquemáticas de la estructura celular A. Célula bacteriana (procariota) Fimbrias o pili Cápsula Ribosomas Pared celular Membrana plasmática Región nucleoide (ADN) Mesosoma Flagelos 42 Capítulo II. Las células y los cromosomas B. Célula vegetal (eucariota) Cloroplastos Citoplasma Citoesqueleto Vacuola Mitocondrias Peroxisoma Nucléolo Ribosomas Cromosomas Aparato de Golgi Núcleo Citoesqueleto Mitocondria Ribosomas Centríolo Nucléolo Membrana plasmática Lisosoma Núcleo Retículo endoplasmático Pared celular Retículo endoplasmático Citoplasma Aparato de Golgi Cromosomas C. Célula animal (eucariota) Unidad funcional La célula es también la unidad funcional de un organismo. En la solución viscosa del citoplasma ocurren continuamente reacciones de síntesis y degradación de sustancias, que consumen o liberan energía. Estas reacciones constituyen lo que denominamos metabolismo. Las reacciones metabólicas son facilitadas por proteínas con actividad catalítica, denominadas enzimas. Como las proteínas estructurales, las enzimas se sintetizan en los ribosomas, que son pequeños componentes citoplasmáticos, no membranosos. La estructura de las proteínas depende de la información genética codificada en el ácido desoxirribonucleico (ADN) y transcripta en el ácido ribonucleico (ARN) que la lleva del núcleo hasta el citoplasma. 43 Biotecnología TABLA 1. Función y distribución de las estructuras celulares Estructura Pared celular Membrana plasmática Función Mantenimiento de la forma y protección de la célula Mantenimiento de la estabilidad del medio intracelular; control del intercambio entre la célula y el medio extracelular Control del flujo de sustancias membrana nuclear entre el núcleo y el citoplasma Control de la estructura y función celular Formación de ribosomas Formación de cilias y flagelos; participación en la división celular Síntesis de proteínas Síntesis de proteínas Célula bacteriana Presente o ausente Célula animal Ausente Célula vegetal Presente Presente Presente Carioteca o membrana celular Cromosoma(s) Ausente Único y circular; solo ADN Ausente Ausentes Presente Múltiples y lineales; ADN y proteínas Presente Presentes Presentes Ausentes Nucléolo(s) Centríolos Ribosomas Retículo endoplasmático rugoso Retículo endoplasmático liso Complejo de Golgi Vacuola central Lisosomas Mitocondrias Cloroplastos Citoesqueleto Síntesis de lípidos; almacenamiento e inactivación de sustancias Secreción celular Equilibrio osmótico y almacenamiento Digestión intracelular Respiración celular aerobia Fotosíntesis Mantenimiento de la forma celular; contracción; anclaje de organelas Ausente Presente Ausente Ausentes Ausentes Ausentes Ausente Presentes Presente Ausentes Presentes Presentes Presente 44 Capítulo II. Las células y los cromosomas Las semejanzas estructurales y funcionales de las células provienen de un origen evolutivo común, aproximadamente 3,8 millones de años atrás. Los dos tipos celulares que reconocemos hoy, las células procariotas y las eucariotas, aparecieron entre un millón y 1,5 millones de años más tarde. 2. TÉCNICAS DE LABORATORIO El estudio de las células se ve facilitado por un conjunto de técnicas de laboratorio a las que nos referimos a continuación. Técnicas de microscopía que permiten una visualización detallada de la célula. Microscopía óptica, que se utiliza para observar cortes de tejidos. Generalmente, estos se fijan (con alcohol, ácido acético, formaldehído) y tiñen con colorantes que reaccionan con las proteínas o con los ácidos nucleicos, aumentando el contraste de la imagen. Microscopía de contraste de fase, que transforma las diferencias de grosor o la densidad del fragmento observado en diferencias de contraste. Microscopía de fluorescencia, que asocia anticuerpos específicos a un reactivo como la GFP (proteína verde fluorescente de medusa), para marcar las moléculas y visualizar su distribución en las células. Microscopía confocal, que combina la microscopía de fluorescencia con el análisis electrónico de la imagen, brindando una imagen tridimensional. Microscopia electrónica, que permite la observación en un plano de cortes teñidos con sales de metales pesados (microscopía de transmisión) y la observación tridimensional de las células (microscopía de barrido). Técnicas físicas como la centrifugación diferencial (ultracentrifugación, centrifugación en gradiente) que permiten separar los componentes celulares para estudios bioquímicos posteriores. Técnicas instrumentales que posibilitan el conteo de células y la separación de poblaciones celulares (cell sorter) o de cromosomas (flow sorter). Técnicas de cultivo de células, con diversos objetivos. 45 Biotecnología 3. TODA CÉLULA PROVIENE DE OTRA PREEXISTENTE Así como una planta se forma a partir de otra planta y un animal de otro animal, toda célula deriva de otra preexistente. Este concepto, enunciado por R. Virchow en 1855, no fue plenamente aceptado hasta diez años más tarde cuando L. Pasteur mostró experimentalmente que la proliferación de microorganismos en un medio orgánico estéril se debe a su contaminación con los microorganismos presentes en el aire. Al encontrar un medio propicio, estos se multiplican rápidamente. Todo organismo multicelular se forma por multiplicación de una única célula, huevo o cigota. Las contribuciones de los genes maternos y paternos para el desarrollo del embrión no son idénticas (imprinting). Las células embrionarias se diferencian, formando más de 200 tipos de células en animales, y un poco menos en las plantas. Los diferentes tipos celulares cumplen funciones específicas que, integradas, aseguran la unidad del organismo. En los vegetales, la persistencia de tejidos embrionarios totipotentes (meristemas) en la planta adulta permite el crecimiento y regeneración durante toda la vida del organismo. En condiciones apropiadas, las células especializadas pueden revertir a un estado no diferenciado y regenerar un organismo completo y diferenciado. En estas propiedades se basa la propagación de plantas in vitro. En los animales superiores, la totipotencia se restringe a las células del embrión con menos de cuatro días, que son las únicas capaces de regenerar un organismo entero. En el embrión de más de cuatro días, algunas células internas del blastocisto (células madre embrionarias) son pluripotentes, es decir, pueden originar a todos los tejidos del organismo (Figura 2). Las células madre también se encuentran en tejidos adultos (médula ósea, sangre, córnea y retina, pulpa dentaria, hígado, piel, tracto digestivo y páncreas). Estas células pueden permanecer en los tejidos multiplicándose durante largos períodos de tiempo, sin que ocurra la diferenciación. En determinadas condiciones fisiológicas, estas células madre adultas originan células especializadas de varios tipos, asegurando el mantenimiento y la reparación del tejido donde se encuentran. Es a partir de un único tipo de célula madre multipotente de la médula ósea, por ejemplo, que se forman todas las células sanguíneas (eritrocitos, leucocitos y plaquetas). Finalmente, existen otras células madre que son unipotentes y se diferencian en un único tipo celular como, por ejemplo, los queratinocitos de la piel. 46 Capítulo II. Las células y los cromosomas FIGURA 2. Diferenciación de las células madre embrionarias en diferentes tipos celulares Las células madre pueden extraerse del blastocisto y cultivarse in vitro. En condiciones experimentales adecuadas, se diferencian en los distintos tipos celulares Espermatozoide Óvulo Masa interna de células Cultivo de células-madre embrionarias Células de páncreas Células de médula ósea Cigota Blastocisto (corte) 5 a 7 días Células de músculo cardíaco En la actualidad, se están desarrollando varias aplicaciones terapéuticas de las células madre adultas. El progreso es más lento con las células madre embrionarias, que son objeto de controversia. Existen dos formas de obtenerlas, una de ellas a partir de los embriones supernumerarios conservados en las clínicas de fertilización asistida, la otra a partir de embriones formados por transferencia nuclear a un ovocito enucleado. Ambos métodos han generado debates éticos, tanto en relación al estatus del embrión como al origen de los ovocitos. La polémica comienza a amainar con el desarrollo de una tecnología que permite obtener, a partir de células somáticas, células iPS (del inglés, induced pluripotent stem cells) con propiedades equivalentes a las de las células madre embrionarias. La pluripotencialidad, que es inducida por inserción de algunos genes en células adultas, representa un paso importante para acabar con la necesidad de utilizar embriones congelados. Además de aumentar nuestro conocimiento sobre el control genético de la diferenciación celular, la tecnología de reprogramación celular abre nuevos caminos para la implementación de ensayos, medicamentos y tratamientos nuevos. Es probable que la medicina regenerativa llegue en breve a aplicarse al tratamiento de varias enfermedades (diabetes, enfermedades cardíacas, enfermedades neurodegenerativas). 4. LOS CROMOSOMAS Cada cromosoma está formado por un filamento de ADN enrollado, a intervalos regulares, sobre proteínas (histonas). En la mayor parte del ciclo celular 47 Biotecnología los cromosomas se encuentran distendidos, formando una red de filamentos finos (cromatina). Durante la división celular, la cromatina se condensa, posibilitando la observación de los cromosomas al microscopio. Desde el punto de vista morfológico, los cromosomas se caracterizan por el tamaño y la posición del centrómero, una constricción que divide al cromosoma en dos brazos. El número de cromosomas n es constante en todos los individuos de una misma especie; n = 4 en Drosophila melanogaster y n = 23 en el hombre, por ejemplo. Como en las células somáticas los cromosomas se encuentran siempre de a pares, en la especie humana el número de cromosomas (2n) es de 46, y un par determina el sexo. Los cromosomas sexuales son idénticos en la mujer (46, XX) y diferentes en el hombre (46, XY). En otras especies, la determinación del sexo sigue mecanismos diferentes. Un poco antes de la división celular, los cromosomas se duplican, de manera que cada una de las células hijas reciba 2n cromosomas. La mitosis mantiene constante el número de cromosomas en las células somáticas de los individuos de una misma especie. En cambio, en las células sexuales, la meiosis reduce a la mitad (n) el número de cromosomas; en la fecundación, la fusión de las gametas restaurará el número 2n propio de la especie. Durante la meiosis, el entrecruzamiento de los cromosomas permite el intercambio y recombinación de los genes (Figura 3). Durante la formación de las gametas, ciertos errores en la disyunción de los cromosomas pueden dar origen a individuos con fórmulas cromosómicas alteradas. En el síndrome de Down, por ejemplo, la persona presenta generalmente un cromosoma 21 adicional (mujeres 47, XX + 21; hombres 47, XY + 21). Se estima que el porcentaje de recién nacidos con alguna anomalía cromosómica estaría en torno del 0,85%, de los cuales únicamente algunos presentarían algún síntoma. Las alteraciones cromosómicas también pueden estar relacionadas con algunos tipos de cáncer. En la leucemia mieloide crónica, por ejemplo, se observa la traslocación recíproca de dos pedazos de los cromosomas 9 y 22. Es frecuente encontrar alteraciones en el número de cromosomas de las células cancerosas. 5. TEORÍA CROMOSÓMICA DE LA HERENCIA En 1865, Gregor Mendel presentó su trabajo “Experiencias de hibridación en plantas”, en el que reunía los resultados de experimentos realizados con 48 Capítulo II. Las células y los cromosomas FIGURA 3. Mitosis y meiosis Durante la meiosis, el intercambio de fragmentos cromosómicos homólogos posibilita la recombinación de los genes MEIOSIS MITOSIS Duplicación del ADN Duplicación del ADN Permuta Primera división Segunda división arvejas (Pisum sativum) durante siete años, en el jardín del monasterio agostino de Brno (Moravia, República Checa). El trabajo pasó casi desapercibido, pero gracias a su publicación, un año después, en los Anales de la Sociedad de Historia Natural, acabó siendo distribuido en varias bibliotecas de Europa y América. 49 Biotecnología En el texto figuran algunas generalizaciones. La primera, conocida como Primera Ley de Mendel, Ley de Segregación o Monohibridismo, se refiere a la segregación de los factores (alelos) de un caracter (un gen) en la formación de las gametas. La segunda, conocida como Segunda Ley de Mendel, Ley de la Segregación Independiente o Dihibridismo, se refiere a la segregación de los factores (alelos) de dos o más caracteres (dos o más genes) independientes en la formación de las gametas. En 1900, después de arribar de manera independiente a conclusiones semejantes, los investigadores K. Correns, E. von Tschermak y H. de Vries redescubrieron en las bibliotecas el trabajo de Mendel. En ese intervalo de 35 años se había descrito la división celular (mitosis, 1875; meiosis, 1890). El paso siguiente lo dieron Sutton y Boveri (1902), quienes sugirieron que los factores hereditarios de Mendel estarían en los cromosomas. La confirmación de esta hipótesis vino de los trabajos de T. H. Morgan y su brillante equipo de la Universidad de Columbia (Nueva York), con la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (Figura 4). En 1910, después de una serie de cruzamientos y de análisis estadísticos, Morgan mostró que la herencia del color blanco del ojo del mutante white estaba asociada a la transmisión del cromosoma X, que determina el sexo. Morgan y sus colaboradores identificaron muchos otros mutantes de Drosophila melanogaster con un modelo mendeliano de herencia. Además de moscas con ojos blancos en lugar de rojos, encontraron otras con alas cortas en vez de largas, con cuerpo marrón o negro en lugar de amarillo, etc. Los genes correspondientes se clasifican en cuatro grupos de ligamiento, y cada uno de ellos está asociado a uno de los cuatro pares de cromosomas de la Drosophila. Como durante la meiosis se producen intercambios entre segmentos cromosómicos, en los cruzamientos aparecen individuos recombinantes, es decir, con otras combinaciones genéticas diferentes a las previstas por las FIGURA 4. Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta 50 Capítulo II. Las células y los cromosomas FIGURA 5. Monohibridismo El color del cuerpo de la Drosophila depende de un gen, localizado en el cromosoma III, con dos alelos (e = cuerpo negro o ebony, e+ = cuerpo amarillo). El cruzamiento entre dos cepas puras de moscas que difieren en el color del cuerpo (amarillo o negro) genera la primera generación (F1) de moscas de cuerpo amarillo, mostrando que el alelo e+ es dominante. Del cruzamiento entre individuos de la F1 nace una segunda generación (F2) con una proporción fenotípica de tres moscas amarillas: una mosca negra. Esta proporción surge de la segregación de los alelos de un gen en la formación de las gametas Genotipo Fenotipo Fenotipo Genotipo Homocigota e e Gametas Homocigota e+ e+ Heterocigota e e+ Heterocigota e e+ Heterocigota e e+ Proporción fenotípica Cuadro que representa al cruzamiento F1 x F1 51 Biotecnología FIGURA 6. Dihibridismo El color del cuerpo de la Drosophila depende de un gen, localizado en el cromosoma III, con dos alelos (e = cuerpo negro o ebony; e+ = cuerpo amarillo). La presencia o ausencia de ojos depende de un gen, localizado en el cromosoma IV, con dos alelos (ey = sin ojos, ey+ = con ojos). El cruzamiento entre dos cepas puras de moscas que difieren en el color del cuerpo (amarillo o negro) y en la presencia o ausencia de ojos genera en la primera generación (F1) moscas de cuerpo amarillo y con ojos, mostrando que los alelos ey+ y e+ son dominantes. Del cruzamiento entre moscas de la F1 nace una segunda generación (F2) con una proporción fenotípica de nueve moscas amarillas con ojos: tres moscas amarillas sin ojos, tres moscas negras con ojos: una mosca negra sin ojos. Esta proporción surge de la segregación independiente de los alelos de los genes localizados en diferentes cromosomas homólogos en la formación de las gametas Genotipo Fenotipo Fenotipo Genotipo Homocigota e+ e+ ey ey Gametas Homocigota e e ey+ ey+ Heterocigota e e+ ey ey+ Proporción fenotípica Heterocigota e e+ ey ey+ Cuadro que representa al cruzamiento F1 x F1 52 Capítulo II. Las células y los cromosomas leyes mendelianas. A partir de los datos obtenidos en miles de cruzamientos sobre la recombinación de los genes de un mismo grupo de ligamiento, se llegó a establecer la distancia genética entre ellos. Los primeros trabajos de mapeo comenzaron con el descubrimiento de células con cromosomas gigantes (politénicos) en las glándulas salivales de las larvas de Drosophila, una característica morfológica que permitió asociar los datos genéticos a los datos físicos. La observación al microscopio de los cromosomas mostró con una enorme riqueza de detalles una sucesión de bandas anchas y estrechas. De la asociación entre los métodos genéticos y los métodos citológicos surgieron los primeros mapas físicos, asociando cada gen con una región cromosómica. De los descubrimientos de Morgan y su equipo nace la teoría del gen, según la cual: a) los caracteres de un individuo corresponden a elementos pares, los genes; b) los genes están ligados unos con otros en los cromosomas, formando un determinado número de grupos de ligamiento; c) los genes de cada par se separan durante la gametogénesis, de acuerdo con la Primera Ley de Mendel y, en consecuencia, cada gameta lleva un único conjunto de genes (Figura 5); d) los genes que pertenecen a grupos de ligamiento diferentes segregan independientemente, de acuerdo con la Segunda Ley de Mendel (Figura 6); e) entre los elementos pertenecientes a cada grupo de ligamiento ocurre un intercambio ordenado llamado entrecruzamiento o crossing-over, que lleva a la recombinación de los genes (Figura 3); f) la frecuencia de entrecruzamiento refleja la linealidad de los genes en cada grupo de ligamiento y permite determinar su posición relativa. Estudios posteriores mostraron la complejidad de los patrones de herencia, que incluyen casos de alelismo múltiple, pleiotropía, herencia poligénica e interacción génica. Alelismo múltiple, cuando un gen puede admitir múltiples alelos, dominantes, recesivos o co-dominantes (sistema ABO, por ejemplo). Pleiotropía, cuando un gen determina diversos caracteres (pelaje y sobrevida en ratones, por ejemplo). Herencia poligénica, cuando un carácter está determinado por varios genes de efecto acumulativo (altura, color de ojos). Interacción génica, cuando una característica depende de la acción de muchos genes. Finalmente, hay que destacar que el fenotipo de un individuo es el resultado de la interacción entre el genotipo y el ambiente en el que este se expresa. 53 Biotecnología 6. CÉLULAS Y CROMOSOMAS COMO AGENTES BIOLÓGICOS Una de las primeras pruebas de diagnóstico genético se basa en la observación al microscopio de los cromosomas de células somáticas durante la división celular (mitosis). La identificación se ve facilitada por la presencia de regiones o bandas reveladas mediante técnicas de coloración. El número y la estructura de los cromosomas se analizan y se presentan en un arreglo, llamado cariotipo, de acuerdo con una clasificación convencional (Figura 7). FIGURA 7. Representación de los cromosomas humanos El arreglo sigue una clasificación convencional que tiene en cuenta el tamaño, la posición del centrómero (rayado en el esquema) y el patrón de las bandas de cada cromosoma or Fuente: <http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/502/karyotype.png>. 54 Capítulo II. Las células y los cromosomas Las pruebas de diagnóstico genético basadas en el análisis de cariotipos están ampliamente difundidas en la práctica médica, y se ven simplificadas actualmente por el empleo de colorantes específicos para cada par cromosómico. Como agentes biológicos, las células tienen otras aplicaciones (Tabla 2). Las células vegetales cultivadas in vitro sirven para producir sustancias de alto valor agregado, importantes para las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. También se utilizan para regenerar plantas. La multiplicación de virus en cultivos de células de insectos permite la comercialización de métodos de control biológico. La síntesis de algunas sustancias importantes para la industria farmacéutica, como el factor activador de plasminógeno, depende del cultivo in vitro de células animales. Estas también reemplazan a los animales en los ensayos toxicológicos, y se utilizan en la multiplicación de virus para la preparación de vacunas. Además, posibilitan la producción de anticuerpos. Combinando las técnicas de cultivo celular con el desarrollo de materiales biológicos semejantes al colágeno se crea un área nueva de ingeniería de tejidos que apunta a la reparación o sustitución de tejidos lesionados. Los injertos de piel artificial, cultivada in vitro, se usan para reparar heridas y quemaduras en seres humanos. TABLA 2. Las células como agentes biológicos Agentes biológicos Vegetales Aplicaciones Industria alimentaria y cosmética (edulcorantes, colorantes, saborizantes y aromatizantes) Industria farmacéutica (alcaloides y esteroides) Estudios toxicológicos Células Animales y humanas Diagnóstico clínico (cariotipos) Industria farmacéutica (producción de anticuerpos y vacunas) Medicina regenerativa (producción de tejidos de sustitución) 55 Capítulo III. Los microorganismos 1. LA DIVERSIDAD MICROBIANA El término “microorganismos” se aplica a un grupo heterogéneo de seres que viven como células independientes o como agregados celulares: bacterias, protozoarios, algas, hongos y, también, virus. Encontramos microorganismos en los tres dominios de la clasificación de los seres vivos (Bacteria, Archaea y Eukarya). La excepción son los virus, en la frontera entre lo vivo y lo no vivo. Los microorganismos muestran una diversidad sorprendente de estructura y modos de vida (Tabla 1). Algunos son procariontes, como las bacterias; otros son eucariontes, como los protozoarios, las algas y los hongos. Las formas libres colonizan todos los ambientes terrestres, desde la cima de las montañas hasta las profundidades de los océanos. Los parásitos crecen a costa de otros seres vivos y dependen enteramente de ellos para su abrigo y alimento. Otros, en cambio, solo dependen parcialmente y en diversos grados de otros organismos vivos. Los aerobios crecen si hay oxígeno, los anaerobios si no lo hay. Los autótrofos sintetizan sus alimentos a partir de dióxido de carbono; los fotosintéticos utilizan la luz como fuente de energía y los quimiosintéticos usan algunas reacciones químicas inorgánicas. Los heterótrofos absorben o ingieren las moléculas orgánicas elaboradas por los autótrofos, de los cuales dependen. El hecho de mantenerlos agrupados bajo la denominación de “microorganismos” tal vez obedezca más a razones prácticas que a cuestiones de semejanza entre ellos, ya que en estos grupos se pueden aplicar los mismos métodos básicos de estudio (aislamiento, cultivo in vitro, identificación) con pequeñas variaciones. Las eubacterias Las bacterias son organismos unicelulares procariontes recubiertos por una pared celular que los protege. Además del ADN cromosómico pueden tener moléculas circulares extras de ADN, denominadas plásmidos. 57 TABLA 1. Los microorganismos en el marco de una clasificación biológica actual Dominio Reino Bacteria Eubacteria Archaea Archaebacteria Procariota Eukarya Protista Eucariota Fungi Eucariota Pared celular de quitina. Ausencia de cloroplastos Uni o pluricelular Plantae Eucariota Pared celular de celulosa. Presencia de cloroplastos Pluricelular Animalia Eucariota Sin pared celular. Ausencia de cloroplastos Biotecnología 58 Tipo de célula Procariota Estructura celular Pared celular con Pared celular sin Pared celular de peptidoglicano peptidoglicano celulosa, en algunos. Presencia de cloroplastos, en algunos Unicelular Autotrófica o heterotrófica Eubacterias Unicelular Autotrófica o heterotrófica Arqueas Uni o pluricelular Autotrófica o heterotrófica Organización Nutrición* Ejemplos Pluricelular Heterotrófica (ingestión) Heterotrófica Autotrófica (absorción) Invertebrados y Protozoarios y algas Levaduras, Briófitas (musgos), mohos y setas pteridófitas (helechos), cordados gimnospermas y angiospermas * Nutrición: autotrófica o heterotrófica. Nutrición autotrófica: cuando un organismo produce su propio alimento a partir de sustancias inorgánicas y de una fuente de energía. Los seres autotróficos pueden realizar fotosíntesis (para la cual la fuente de energía es la luz solar) o quimiosíntesis (para la cual la fuente de energía es una reacción química exotérmica). Nutrición heterotrófica: cuando un organismo se alimenta de moléculas orgánicas elaboradas por otros seres vivos por absorción (captación de nutrientes disueltos en el agua), o ingestión (entrada de partículas de alimentos no disueltas en agua). Capítulo III. Los microorganismos FIGURA 1. Bacterias y clones Por división binaria de una bacteria se genera un clon de bacterias iguales Clones Bacteria En condiciones favorables de humedad, acidez y temperatura, las bacterias se multiplican rápidamente por fisión celular (o binaria) produciendo millones de células en pocas horas (Figura 1). En una de sus acepciones, la palabra “clon” se aplica a las células que derivan de una única célula. Sin embargo, algunas especies bacterianas también pueden reproducirse en forma sexuada, posibilitando la recombinación del material genético. Las eubacterias forman un grupo con más de 5.000 especies conocidas. Pequeñas (0,0005-0,005 mm) y de formas diversas (esféricas, en bastones, helicoidales), se las puede encontrar solitarias, de a pares, en cadenas o formando agregados. Algunas se mueven libremente mediante uno o más flagelos distribuidos en la superficie celular, otras se adhieren mediante pili (pelos) o fimbrias a un organismo hospedador. El grupo incluye también a las cianobacterias, que serán comentadas más adelante junto con las algas. En condiciones desfavorables, algunas bacterias forman esporas que sobreviven en forma latente hasta que las condiciones ambientales se vuelvan favorables y puedan germinar, retomando su actividad fisiológica. Un ejemplo interesante, en Europa del siglo XIX, es el de la existencia de ciertos “campos malditos”, donde las ovejas no debían pastar ni transitar, debido al alto riesgo de contraer carbunco o ántrax. De hecho, los bacilos presentes en los animales muertos por la enfermedad y enterrados en esos campos formaban esporas que, al ser llevadas a la superficie por las lombrices, contaminaban los pastizales. La técnica de laboratorio conocida como coloración de Gram permite diferenciar a las bacterias por la estructura de la pared celular. Entre las 59 Biotecnología Gram positivas, cuya pared celular es más simple, encontramos géneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (con algunas especies que causan la tuberculosis y la lepra) y los actinomicetes, como Streptomyces, productora de antibióticos como la estreptomicina. Entre las Gram negativas encontramos a los micoplasmas, Escherichia coli (colonizadora del tracto digestivo de muchos organismos), Salmonella (agente causal de muchas intoxicaciones alimentarias), las cianobacterias fotosintéticas, las espiroquetas (Treponema pallidum y Borrelia burgdorferi, que causan la sífilis y la enfermedad de Lyme, respectivamente) y las clamidias (responsables de infecciones genitales, tracomas y uretritis). Se estima que las bacterias son responsables de aproximadamente la mitad de las enfermedades humanas. Las Gram negativas resultan más difíciles de tratar que las Gram positivas, debido a la protección dada por una capa adicional en la pared celular, que dificulta la entrada de antibióticos. Del mismo modo que el hombre, los animales y las plantas también son afectados por patógenos bacterianos que invaden los tejidos del hospedador o liberan sustancias tóxicas (exo y endotoxinas). Pero no todas las bacterias son patogénicas. Su participación en el reciclado de los elementos es fundamental desde el punto de vista ecológico, posibilitando el tratamiento de residuos y de aguas servidas, la eliminación de compuestos contaminantes (biorremediación) y la extracción de minerales (biolixiviación). También hay bacterias que fijan nitrógeno o producen toxinas pesticidas, contribuyendo a la mejora de las prácticas agrícolas. Debido a sus características metabólicas, muchas eubacterias se utilizan en la producción de alimentos (lácteos, vinagre, pickles y aceitunas) y aditivos (vitaminas, aminoácidos, gomas emulsificantes y estabilizantes), en la industria química (acetona, butanol y plásticos biodegradables) y en la industria farmacéutica (vacunas, toxinas y antibióticos). También se emplean en la producción de enzimas para uso industrial y medicinal (Tabla 2). Las arquibacterias Las arquibacterias difieren de las eubacterias en la estructura de la pared celular y en algunas características metabólicas relacionadas con la síntesis de proteínas, que las aproximan a los eucariontes. Algunas viven en hábitats inhóspitos, como las solfataras de los volcanes o los géiseres en Islandia y Costa Rica, donde las temperaturas superan los 60-80 °C. Otras prosperan en lagos donde la concentración salina es altísima, como el Gran Lago Salado (Estados Unidos) o el Mar Muerto (Israel). Existen también entre las arqui60 Capítulo III. Los microorganismos TABLA 2. Las bacterias como agentes biológicos Agentes biológicos Aplicaciones Tratamiento de residuos y de aguas servidas Producción de energía (metano) Biorremediación, extracción de minerales Bacterias Industria química (acetona, butanol, ácido láctico, ácido acético) Enzimas industriales Agricultura (rizobios, biopesticidas) Alimentos (lácteos, vinagres, pickles, aceitunas, silaje) Indústria alimentaria (vitaminas B12 e -caroteno, aminoácidos lisina e ácido glutámico; polisacáridos xantano y dextrano*) Industria farmacéutica (enzimas de uso médico, antibióticos, vacunas y toxinas) * El dextrano también tiene usos médicos. bacterias algunos géneros con vías metabólicas peculiares, dependientes del azufre o productoras de metano. Debido a estas propiedades, en los últimos años se ha acelerado la prospección de arquibacterias con propiedades potencialmente interesantes, para ser empleadas en procesos industriales que exijan condiciones ambientales extremas. Sin embargo, estudios recientes de ecología molecular muestran que las arquibacterias no se limitan a ambientes extremos, y que su diversidad sería mucho mayor que lo previsto. Los protozoarios Los protozoarios se clasifican en el reino Protista, un grupo mal definido de seres eucariontes que pueden ser unicelulares o pluricelulares, autótrofos o heterótrofos, de reproducción sexual o asexual. Los protozoarios, en particular, son unicelulares y heterótrofos, con un tamaño que varía entre 0,002 y 1 mm. Algunos viven libres en ambientes marinos, de agua dulce, o simplemente lugares muy húmedos. Otros parasitan a otras especies causándoles enfer61 Biotecnología medades, como Giardia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma, etc. Debido a la importancia fundamental que tienen para el ser humano desde el punto de vista médico, la caracterización molecular de estos protozoarios puede dar origen a pruebas de diagnóstico y vacunas. Las algas Clasificadas en el reino Protista junto con los protozoarios, las algas son organismos uni o pluricelulares, autótrofos y acuáticos. Situadas en la base de las cadenas alimenticias acuáticas, las algas cumplen un papel fundamental en la biosfera, porque son capaces de fijar gas carbónico y producir oxígeno. Algunas participan en la formación de suelos y en la fijación de nitrógeno. Las macroalgas marinas (algas pardas, algas rojas y parte de las algas verdes) forman filamentos y talos que pueden llegar a medir más de treinta metros, a pesar de no tener órganos diferenciados. Son utilizadas en la alimentación humana (Porphyra o nori; Laminaria, como el kombu, en Oriente y el cochayuyo en Chile) y, también, como abono. Debido a su capacidad de formar geles y emulsiones, los ficocoloides extraídos de las algas (agar, carragenina, alginato) se emplean en los laboratorios de investigación y de análisis clínicos para la preparación de medios para el cultivo de bacterias y hongos. También se los usa en varias industrias, tales como la alimentaria (helados, cremas, jaleas, etc.), la farmacéutica (laxantes, cápsulas de remedios) y la cosmética (cremas, jabones, champúes, dentífricos, etcétera). Las microalgas representan a un grupo extremadamente diverso de unas 25.000 especies, de las cuales solo un pequeño grupo está bien estudiado. Este grupo comprende aproximadamente cincuenta especies de microorganismos fotosintéticos, tanto eucariontes (diatomeas, dinoflagelados, euglenoides y otras algas verdes) como procariontes (cianobacterias, antes llamadas algas azul-verdosas). La proliferación de microalgas como floraciones en la naturaleza (mareas rojas) o en reservorios, generalmente debida a la eutrofización de las aguas, puede causar la muerte de otros organismos y es muy peligrosa cuando se acompaña de la liberación de toxinas. Pero no siempre es así. La incorporación de microalgas en los tanques en algunos sistemas de tratamiento de efluentes permite remover nutrientes inorgánicos y adicionar oxígeno al proceso. También se usan como indicadores de polución. 62 Capítulo III. Los microorganismos TABLA 3. Las algas como agentes biológicos Agentes biológicos Biomasa Algas Aplicaciones Tratamiento de efluentes, biomonitoreo de contaminación, obtención de energía Agricultura (abono) Producción de alimentos (alimentación humana, ración para avicultura y acuicultura) Industria de alimentos (aditivos, complementos nutricionales y sustitutos proteicos) Moléculas Industria de cosméticos (ácidos grasos, ficocoloides, pigmentos, gliverol, abrasivos finos, etcétera) Industria farmacéutica (toxinas, antibióticos, antivirales y antitumorales) La degradación de la biomasa de algas por microorganismos anaerobios produce metano, un gas combustible. Otra alternativa energética interesante es la producción de hidrógeno por algas. Las microalgas también se usan en la alimentación animal, como ración para la avicultura y la acuicultura. Algunas de las sustancias sintetizadas por ellas son incluidas en la alimentación humana como complementos nutricionales y sustitutos proteicos (aminoácidos, ácidos grasos y vitaminas B12 y -caroteno). Los ácidos grasos, así como varias otras sustancias (ficocoloides, pigmentos, glicerol, abrasivos finos, etc.) se usan en la formulación de cosméticos. Otros compuestos biológicamente activos son de gran interés para la industria farmacéutica (Tabla 3). Los hongos El reino Fungi comprende más de 100.000 especies. Los hongos son organismos eucariontes, uni o pluricelulares, con una pared celular formada por quitina. Todos son heterótrofos y pueden reproducirse en forma sexual o asexual. Tienen gran importancia como agentes biológicos (Tabla 4). Las levaduras son hongos unicelulares que se desarrollan en lugares húmedos y se reproducen por brotación. A este grupo pertenece uno de los microorganismos de mayor importancia económica: Saccharomyces cere63 Biotecnología TABLA 4. Los hongos como agentes biológicos Agentes biológicos Aplicaciones Agricultura (control biológico de insectos y nematodes, micorrizas) Productos de fermentación (etanol, glicerol, ácido cítrico) Hongos Enzimas industriales Biomasa (levadura de panadería, micoproteína) Industria de alimentos (panificación, quesería) Industria de bebidas (cervezas y vinos, destilados) Productos metabólicos (extracto de levadura, hormonas de crecimiento vegetal) Industria farmacéutica (antibióticos, vitaminas, vacunas, esteroides) visiae, la popular levadura de cerveza (o simplemente levadura) utilizada tradicionalmente en la preparación de alimentos y bebidas, así como en la producción de etanol, vitaminas y otros metabolitos. También se la emplea, modificada por ingeniería genética, para producir una vacuna contra la hepatitis B. Sin embargo, no todas las levaduras son benéficas. Candida albicans, por ejemplo, es un microorganismo oportunista de la flora normal humana que, en ciertas condiciones, puede proliferar de manera anormal tornándose patogénica. En los mohos, las células forman una maraña de filamentos o hifas, denominada micelio. Los mohos crecen rápidamente por fragmentación del micelio y se diseminan mediante esporas, como Aspergillus niger, un productor de ácido cítrico; o como Rhizopus, el moho negro del pan, que se expande sobre su superficie a pesar de los conservantes que se agregan; o como Aspergillus flavus, un moho que crece en las semillas de leguminosas (maní, poroto, soja) produciendo una toxina poderosa, la aflatoxina, que causa graves intoxicaciones. En este grupo también se encuentra Penicillium, un género que cuenta con diversas especies, una de las cuales es empleada en la industria farmacéutica para la producción de penicilina, y otras en la industria de alimentos, para la maduración de quesos como el roquefort, el gorgonzola y el camembert. 64 Capítulo III. Los microorganismos Las setas son los cuerpos reproductivos de muchos hongos. Algunos son venenosos, como los Amanita, y otros producen alucinógenos, como la psilobicina, usada por grupos nativos mexicanos en rituales religiosos, o la ergotamina, sintetizada químicamente en el siglo XX con el nombre de LSD (ácido lisérgico). Pero también hay setas comestibles, como los géneros Agaricus (champignon), Shiitake y Pleurotus, que son cultivados y comercializados por el hombre. Los hongos destruyen en el campo un cuarto de la cosecha de frutas y verduras. Enfermedades como la roya del café, la fusariosis del trigo y el ergot del centeno afectan seriamente a la agricultura. En la Irlanda del siglo XIX, el hongo Phytophtora infestans atacó a los cultivos de papa, destruyendo una fuente básica de alimentación. La enfermedad causó un millón de muertes y la emigración forzada de buena parte de la población. Los líquenes resultan de la simbiosis entre un hongo y un alga. Algunos son comestibles y se cree que el líquen Lecanora esculenta era el maná mencionado en la Biblia. El grupo no ha sido muy explotado económicamente, a pesar de habérsele encontrado aplicaciones como colorante (tintura de tornasol, un indicador de pH), tintura para telas y como fijador en la industria de perfumes. También son indicadores de polución (monitoreo biológico). Por su parte las micorrizas –otra asociación, esta vez entre un hongo filamentoso y las raíces de las plantas vasculares– ocupan un lugar destacado en la agricultura en suelos tropicales al facilitar la solubilización de los fosfatos. Los virus Los virus son partículas inertes sin ninguna actividad metabólica, en el límite entre lo “vivo” y lo “no vivo”. Los menores miden 20 nanómetros (1 nm = 10-4 mm). Pueden atravesar filtros extremadamente finos y cristalizar. Su estructura es muy simple: un ácido nucleico (ADN o ARN, como cadena simple o doble) dentro de una cubierta proteica o cápside (Figura 2). Muchos poseen enzimas que serán liberadas dentro de la célula hospedadora. Como parásitos obligados de bacterias, plantas o animales, al infectar una célula viva pasan a usarla para su propia reproducción. Algunos se integran al genoma de la célula infectada (bacteriófagos, retrovirus), y son utilizados actualmente como vectores para introducir genes en una célula hospedadora (Figura 3). Entre los virus que causan enfermedades humanas encontramos el poliovirus, el VIH, el coronavirus responsable del SAR (síndrome agudo respira65 Biotecnología FIGURA 2. Algunos tipos de virus Los adenovirus y el VIH parasitan células humanas; el bacteriófago, bacterias VIH Adenovirus Bacteriófago FIGURA 3. La multiplicación de un bacteriófago La infección de la bacteria por el bacteriófago destruye a la célula (ciclo lítico). En algunos casos, el ADN viral se integra al cromosoma transmitiéndose a las células hijas; en determinadas condiciones el virus retoma su actividad, reiniciando el ciclo lítico Bacteria Infección El ADN viral se integra en el cromosoma Bacteriófago ADN viral y se transmite a las células hijas Eventualmente Adhesión del bacteriófago a la pared celular e inyección del ADN viral ADN viral CICLO LÍTICO Lisis de la bacteria y liberación de nuevas partículas de virus Infección CICLO LISOGÉNICO Puede volver a activarse Multiplicación del ADN viral Formación de nuevos virus Síntesis de las proteínas virales y destrucción del cromosoma bacteriano 66 Capítulo III. Los microorganismos torio), etc. Algunos infectan a las células animales normales y las transforman en células cancerosas. Los virus que infectan insectos pueden emplearse en el control de plagas. El Baculovirus, por ejemplo, evita la aplicación de 1,2 millones de litros de insecticidas por año en los campos de soja brasileños atacados por la oruga de las leguminosas. 2. LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO Hay diversos tipos de técnicas que facilitan el trabajo de laboratorio. La identificación de un microorganismo requiere la observación microscópica y la utilización de algunos métodos específicos de coloración, complementados eventualmente por pruebas bioquímicas, genéticas e inmunológicas. Para encontrar y mantener una cepa bacteriana en el laboratorio se usan técnicas que, con algunas variaciones, pueden ser aplicadas a hongos y algas. El cultivo de un microorganismo exige, además del diseño de un medio nutritivo que satisfaga sus necesidades metabólicas, un cuidado especial con las condiciones de temperatura e iluminación en las que será incubado. Los medios nutritivos se emplean líquidos o solidificados con agar, una sustancia que les confiere una consistencia gelatinosa. Los recipientes más comunes son tubos de ensayo y placas de vidrio o plástico circulares con tapa (Placas de Petri); y para inocular los medios se utilizan ansas de platino y pipetas de diferentes tipos. La mayor dificultad es conseguir la multiplicación del microorganismo deseado y al mismo tiempo evitar las contaminaciones, es decir la proliferación de otros microorganismos. Para eso, se trabaja en condiciones asépticas, que demandan la esterilización previa del material de vidrio, de los medios de cultivo y de los instrumentos (ansas, pipetas) que serán utilizados. Los equipamientos diseñados para trabajar bajo un flujo de aire esterilizado son una gran ayuda para el profesional, porque permiten evitar la contaminación con los microorganismos del ambiente, durante la transferencia del material biológico. Finalmente, al descartar el material utilizado es indispensable proceder de modo tal que no se liberen microorganismos perjudiciales al medioambiente. Los microorganismos se aíslan a partir de muestras de suelo, agua, aire y fluidos corporales. Las cepas obtenidas se conservan como cultivos puros. Para obtener microorganismos con características diferentes se inducen mutaciones y se seleccionan las cepas mutantes. Si bien cada laboratorio 67 Biotecnología suele mantener los stocks microbianos necesarios para su trabajo, estos también pueden ser solicitados a centros especializados (colecciones de cultivos). El número de microorganismos presentes en una muestra es estimado por diversos métodos entre los cuales se incluyen el conteo (microscópico, electrónico o en placa) y medidas de la turbidez del medio, de la masa seca, del contenido de nitrógeno o de la actividad metabólica. En general, como las técnicas clásicas son trabajosas y se demora mucho tiempo hasta llegar a un diagnóstico clínico, están siendo reemplazadas por técnicas más rápidas que identifican a los microorganismos por algunas secuencias características del ADN. También dependemos de la genómica para ampliar nuestro conocimiento de las comunidades microbianas del ambiente, porque el número de especies que conseguimos cultivar en el laboratorio no representa más del 1 al 5% de la totalidad existente. Aunque la microbiología es una disciplina que data del siglo XIX, nuestra ignorancia sobre el mundo microbiano todavía es enorme. 3. BIOSEGURIDAD Y BIOPROTECCIÓN Los microorganismos se clasifican según el riesgo de causar daños a la comunidad y a los profesionales que trabajan con ellos. Los criterios fundamentales son la patogenicidad para el hombre, la virulencia, el modo de transmisión, la endemicidad y la existencia o no de medidas preventivas y un tratamiento terapéutico eficaz. En función de esas características, se definen cuatro grupos de riesgo. Grupo 1. Bajo riesgo individual y colectivo. Microorganismos que nunca fueron descritos como agentes causales de enfermedades para el hombre y que no constituyen ningún riesgo para el medioambiente. Ejemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algunas cepas). Grupo 2. Riesgo individual moderado, riesgo colectivo limitado. Microorganismos que pueden causar enfermedades en el hombre, con poca probabilidad de alto riesgo para los profesionales del laboratorio. Ejemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, virus del sarampión, virus de la hepatitis B. Grupo 3. Riesgo individual elevado, riesgo colectivo bajo. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves a los profesionales del laboratorio. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y VIH. 68 Capítulo III. Los microorganismos FIGURA 4. Logotipos utilizados para indicar la existencia de riesgo biológico Bioseguridad Bioprotección Grupo 4. Serio riesgo para los profesionales del laboratorio y para la comunidad. Microorganismos que causan enfermedades graves para el hombre. Ejemplos: virus Ébola, virus Marburg. A cada uno de los grupos anteriores le corresponden normas estrictas de bioseguridad, que abarcan desde la arquitectura del laboratorio y las características de los equipamientos, hasta las precauciones que deben tomar los profesionales y la forma en que se descartan los desechos (Figura 4). Los microorganismos genéticamente modificados se clasifican en función del grupo de riesgo al que pertenecen las cepas donantes y receptoras. Según la Organización Mundial de la Salud, el término bioseguridad abarca los principios, técnicas y prácticas necesarias para evitar la exposición accidental a patógenos y toxinas, o su liberación accidental. El concepto más reciente de bioprotección (o biocustodia) se refiere a las medidas de protección de la institución y del personal, destinadas a evitar el riesgo de pérdida, robo, uso incorrecto, desvíos o liberación intencional de patógenos y toxinas (bioterrorismo). 4. MICROORGANISMOS COMO AGENTES BIOLÓGICOS La importancia biotecnológica de algunos microorganismos se describe en la Tabla 5. 69 Biotecnología TABLA 5. Agentes microbianos de importancia biotecnológica Arquibacterias Thermus aquaticus Utilización Aislada de un charco del Parque Nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bacteria produce una enzima que copia el ADN a temperatura alta. Esta enzima permite obtener millones de copias de un fragmento de ADN en un proceso automatizado que revolucionó a la biotecnología, llamado PCR (polymerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa). Viven en lugares donde no hay oxígeno, sea en el tubo digestivo de algunos animales (ganado, termitas) o en los pantanos. Estas bacterias transforman el acetato, resultante de la degradación de la celulosa por otras bacterias, en metano, un gas combustible. Bacterias metanogénicas Eubacterias Bacterias lácticas Utilización Los géneros Lactobacillus y Streptococcus son responsables de varios procesos, tales como la elaboración de quesos y yogures, el añejamiento de los vinos, la conservación de los alimentos (sauerkraut o repollo fermentado, silaje para el ganado), la producción de ácido láctico, aditivo utilizado en la industria alimentaria como acidulante y estabilizante. Este microorganismo prolifera en el suelo y en la superficie de las plantas, sintetizando una toxina fatal para las larvas de ciertos insectos. La toxina es producida comercialmente desde hace más de 40 años; representa el 90% de las ventas de insecticidas biológicos y ha reducido la necesidad de aplicación de pesticidas químicos en el campo. En los últimos años se ha introducido el gen de la toxina en plantas como el algodón y el maíz para que sinteticen directamente el insecticida. Bacterias del suelo que producen sustancias antibióticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifúngicas (nistatina), herbicidas, antitumorales y supresoras del rechazo de trasplantes. Tienen el olor característico de la tierra removida. Se usan varias cepas en la eliminación de contaminantes. Algunas degradan moléculas de hidrocarburos, como los presentes en los derrames accidentales de petróleo; otras pueden remover el mercurio del agua. Bacillus thuringiensis Streptomyces Pseudomonas 70 Capítulo III. Los microorganismos Eubacterias Agrobacterium tumefaciens Utilización Agente patogénico para las plantas dicotiledóneas en las que desarrollan tumores o agallas. Con la eliminación de un gen pierde la capacidad de provocar tumores conservando la capacidad infecciosa. Es utilizada en la ingeniería genética de plantas. En la industria textil, Clostridium butiricum libera las fibras vegetales durante la maceración del cáñamo y del lino. Clostridium acetobutyricum se usa en la producción industrial de acetona y butanol. Clostridium botulinum produce una toxina poderosísima; se calcula que un gramo de esta bastaría para matar a un millón de personas. La ingestión de conservas contaminadas y mal esterilizadas suele tener un desenlace fatal. Por su acción inhibitoria de la contracción muscular, la toxina botulínica es usada en concentraciones muy pequeñas para reducir arrugas y marcas de expresión durante un cierto tiempo (efecto cosmético). Descubierta en 1855, esta bacteria Gram-negativa vive en el tracto digestivo del hombre y de otros animales. Tiene forma de bastón (0,002 mm de largo, 0,0008 mm de diámetro), 1 a 4 moléculas de ADN y 15.000 a 30.000 ribosomas. Tiene flagelos y “pelos” que le permiten moverse rápidamente. Algunas cepas son patógenas, pudiendo contaminar los alimentos (carne, leche, vegetales) que deben cocinarse adecuadamente. Los requerimientos nutricionales básicos son simples: agua, sales minerales, una fuente de nitrógeno y una fuente de energía. En condiciones adecuadas se divide cada 20-40 minutos, y también puede reproducirse de manera sexual (conjugación). Debido a la facilidad con que se la puede cultivar en el laboratorio, Escherichia coli se ha transformado en una herramienta indispensable para estudios bioquímicos y genéticos, incluyendo la ingeniería genética. Su genoma comprende 4,6 millones de pares de bases que codifican unas 4.000 proteínas diferentes. La introducción de transgenes en Escherichia coli K12, una cepa inofensiva de laboratorio, posibilitó los primeros procesos de producción de insulina, de interferón y de hormona de crecimiento. Sin embargo, por tratarse de una célula procarionte no siempre es la mejor opción como “fábrica” para la síntesis de productos de origen animal o vegetal, de a poco ha sido sustituida por células eucariontes, como las levaduras. Bacterias butíricas Escherichia coli 71 Biotecnología Algas Spirulina Utilización Su alto tenor proteico, correspondiente al 60% del peso seco, le confiere un elevado valor nutritivo (las proteínas representan solo el 2% del peso seco de la papa y el 6-10% del trigo, aproximadamente). Cuando llegaron los españoles, los aztecas ya preparaban unas galletas (tecuitlatl) con la Spirulina colectada en el lago Texcoco. En África, en el lago Chad, aún hoy se la colecta y consume como alimento. Spirulina y Chlorella se venden en tabletas como complemento dietario. Vive en medios de alta salinidad, evitando la deshidratación mediante la acumulación de glicerol. Puede crecer en el Mar Muerto. También se la cultiva en tanques o lagunas cercanas al Mar Rojo, para la extracción del glicerol y de -caroteno, otro producto metabólico. Utilización Conocida como la levadura de cerveza o “levadura”, se utiliza en la preparación de alimentos (pan, bizcochos, fermento de panadería) y de bebidas (cerveza, vino y destilados), así como en la producción de otras sustancias de importancia industrial (etanol, vitaminas y otros metabolitos). La levadura crece fácilmente en el laboratorio. También puede ser manipulada genéticamente. En los fermentadores o biorreactores industriales, donde se multiplica rápidamente a partir de materias primas de bajo costo, permanece activa durante períodos largos, y al concluir el proceso, puede ser separada por filtración o centrifugación. Con 12.000.000 de pares de bases y 6.000 genes en 16 cromosomas, Saccharomyces cerevisiae fue, en 1997, el primer organismo eucarionte en tener su genoma secuenciado. Algunas especies alcanzan gran importancia industrial, como A. niger, que se utiliza para la producción de ácido cítrico o de enzimas (en cepas modificadas genéticamente). Algunas especies se utilizan en la industria farmacéutica (penicilina) o alimentaria (quesos “azules” como el roquefort y gorgonzola o el queso camembert). Dunaliella Hongos Saccharomyces cerevisiae Aspergillus Penicillium 72 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos 1. LAS PROTEÍNAS Todos los organismos están compuestos por agua y moléculas de diversos tipos, inorgánicas y orgánicas. Entre estas últimas se encuentra un grupo de macromoléculas, las proteínas, que participan en numerosas actividades, cumpliendo un papel fundamental para los seres vivos (Tabla 1). Pertenecen a ese grupo las enzimas, que cumplen una función catalítica, y los anticuerpos, que participan en la defensa del organismo. A pesar de haber algunas diferencias en las proporciones de ciertos componentes, la composición química de otros microorganismos o de las células eucariontes es comparable a la de una bacteria (Figura 1). FIGURA 1. Composición química de una bacteria Iones, moléculas pequeñas (4%) Fosfolípidos (2%) ADN (1%) Otras moléculas (30%) ARN (6%) Macromoléculas Agua (70%) Proteínas (15%) Polisacáridos (2%) 73 Biotecnología TABLA 1. Las funciones de las proteínas en el organismo Función Componentes estructurales Sustancias de reserva Acción catalítica Otras Ejemplos Queratina del cabello, colágeno de la dermis, actina y miosina de las fibras musculares. Albúmina del huevo, caseína de la leche. Enzimas que controlan las reacciones químicas celulares. Transmisión de información (hormonas proteicas), participación en los mecanismos de defensa (anticuerpos, citoquinas), transporte y almacenamiento de pequeñas moléculas (hemoglobina). Estructura Las proteínas son macromoléculas formadas por 20 aminoácidos diferentes. Estos se caracterizan por tener unido al carbono un grupo amino (básico), un grupo carboxilo (ácido) y un radical variable (Figura 2, A). La presencia de un carbono asimétrico resulta en dos formas moleculares, L y D, que difieren en sus propiedades ópticas. Los aminoácidos que forman parte de las proteínas corresponden a la forma L. La reacción de condensación entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro crea una unión peptídica (Figura 2, B). Al unirse varios aminoácidos se forma una cadena peptídica caracterizada no solo por el número y tipo de aminoácidos que la componen, sino también por la secuencia en que se encuentran (estructura primaria). Debido a las interacciones entre los grupos que forman los enlaces peptídicos, la cadena adopta una estructura regular, generalmente en forma de hélice o de hoja (estructura secundaria). Las interacciones entre las cadenas laterales de los aminoácidos causan el plegamiento de la proteína, obteniéndose una configuración espacial determinada (estructura terciaria). La asociación entre varios polipéptidos determina la forma final de una proteína (estructura cuaternaria) (Figura 2, C). Algunas técnicas de laboratorio La cromatografía Esta técnica permite separar las sustancias de una mezcla con fines analíticos y preparativos. Se basa en la migración diferencial de las moléculas 74 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos FIGURA 2. Aminoácidos y proteínas A. Fórmula de los aminoácidos L-aminoácido Grupo carboxilo D-aminoácido Grupo carboxilo Grupo amino Cadena lateral Cadena lateral Grupo amino B. Formación de una unión peptídica Aminoácido 1 Aminoácido 2 Unión peptídica C. Estructura de una proteína Aminoácidos Hoja plegada (conformación ) Hélice (conformación ) Hoja plegada o Estructura primaria Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria de una mezcla colocada en una fase móvil, sobre un soporte estacionario o matriz. Según las características de la fase estacionaria, se distinguen diferentes tipos de cromatografía: en papel, en capa delgada, gaseosa, líquida, etc. En la cromatografía en columna, por ejemplo, la separación de las proteínas de una mezcla depende de la estructura de la matriz, sólida y permeable, que se encuentra inmersa en un solvente (Figura 3). La separación obedece a tres tipos de mecanismos: intercambio iónico, tamiz molecular y afinidad. Intercambio iónico. La matriz está formada por pequeñas partículas cargadas que retienen a las moléculas de carga contraria. Como la asociación depende de factores como el pH y la fuerza iónica de la solución, la modificación de estos factores permite controlar la separación. 75 Biotecnología FIGURA 3. Cromatografía en columna El proceso se basa en la velocidad de migración diferencial de las moléculas proteicas en una matriz inmersa en un solvente Muestra Solvente Matriz Salida del solvente Tiempo Fracciones colectadas Tamiz molecular. La matriz consiste en partículas porosas que separan a las proteínas en función de su tamaño, como un “colador” molecular. Afinidad. Las partículas de la matriz están unidas por enlaces covalentes a moléculas (enzimas, anticuerpos) que interactúan con la proteína de interés. Para liberar a la proteína retenida en la columna se cambia el pH o la concentración salina. De este modo se obtiene la proteína purificada. La electroforesis Las moléculas ionizadas colocadas en un campo eléctrico migran de acuerdo con sus cargas y pesos moleculares. Si la carga es positiva, migrarán al polo negativo o cátodo e, inversamente, si es negativa, la migración ocurrirá hacia el polo positivo o ánodo. Este es el fundamento de otra técnica analítica: la electroforesis. La carga de un péptido resulta de la suma de las cargas correspondientes a los grupos amino y carboxilo terminales y a los radicales de los aminoácidos que lo componen, y esa carga varía con el pH del medio. Cuando se coloca una mezcla de varios péptidos en un campo eléctrico, estos migran de acuerdo a su carga y, también, a su forma y tamaño. Al cabo de un tiempo se formarán bandas características, que serán visualizadas con un colorante o una reacción química específica (Figura 4). 76 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos FIGURA 4. Electroforesis Separación de los péptidos de una mezcla por migración diferencial en un campo eléctrico Mezcla de péptidos Cátodo Ánodo Aplicación de un campo eléctrico Migración y separación de los péptidos La electroforesis permite separar los componentes de una mezcla. Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del soporte (papel de filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulosa y geles de agarosa, amido o poliacrilamida), de la disposición de la cuba (horizontal o vertical), de la dirección de la migración (unidireccional o bidireccional), etcétera. La espectrometría de masa Esta técnica analítica mide la masa molecular a partir de la relación entre la masa y la carga de moléculas ionizadas, una medida que permite la identificación de una sustancia. Con el descubrimiento de métodos de ionización adaptados a las moléculas biológicas, la espectrometría de masa se tornó en los últimos años una herramienta indispensable en la identificación de proteínas, azúcares, ácidos nucleicos, lípidos y otros compuestos orgánicos. Aplicada a las proteínas, la espectrometría de masa identifica una molécula por comparación con otras registradas en una base de datos. También brinda un análisis estructural de la molécula indicando la secuencia de aminoácidos. Con esta técnica es posible estudiar el conjunto de proteínas de un organismo (proteoma) e identificar las interacciones de las proteínas con otras moléculas. Por ser un método automatizado y rápido, ha alcanzado múltiples aplicaciones en farmacología y diagnóstico. 77 Biotecnología 2. LAS ENZIMAS La catálisis enzimática Las reacciones químicas que ocurren en los seres vivos dependen de la actividad catalítica de las enzimas. Estas actúan disminuyendo la energía de activación necesaria de una reacción química, siendo capaces de promoverla y acelerarla, sin ser alteradas o destruidas durante la misma (Figura 5). Según la teoría clásica de la llave-cerradura, la molécula de enzima reconoce un sustrato específico, formando con él un complejo molecular o estado de transición. El encaje en el sitio activo de la molécula facilita la transformación del sustrato en el (los) producto(s) de la reacción. La enzima se recupera al final de la reacción, y puede actuar muchas veces más. El proceso puede ser representado como sigue: S+E SE P+E La primera característica de las enzimas es la especificidad. Una enzima como la lactasa, que actúa sobre la lactosa, no actuará sobre la sacarosa. Dos enzimas, como por ejemplo la -amilasa y la -amilasa, pueden hidrolizar el almidón de manera diferente, porque rompen enlaces distintos. La segunda es que, como son moléculas biológicas, las enzimas son biodegradables y trabajan en condiciones moderadas de temperatura y pH. La acción enzimática depende del pH, de la temperatura, de la presencia de cofactores inorgánicos (zinc, hierro, cobre) y orgánicos (coenzimas, muchas de las cuales son vitaminas). Los metales pesados alteran la estructura molecular de la enzima de manera irreversible, impidiendo su acción catalítica (desnaturalización). FIGURA 5. El mecanismo de la actividad enzimática, según el modelo llave-cerradura La actividad enzimática no modifica el equilibrio de la reacción Sustrato Productos Enzima Complejo enzima-sustrato Enzima 78 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos TABLA 2. Clasificación internacional de las enzimas Clase Oxidorreductasas Transferasas Hidrolasas Tipo de reacción catalizada Reacciones en las que se transfieren electrones Reacciones en las que se transfieren grupos químicos Reacciones de hidrólisis, o sea, de transferencia de grupos funcionales al agua Adición de grupos a enlaces dobles o formación de enlaces dobles por eliminación de grupos Producción de isómeros por transferencia de grupos dentro de la misma molécula Formación de uniones C-C, C-S, C-O o C-N por reacciones de condensación Ejemplos Deshidrogenasas, oxidasas Transaminasas, fosforilasas Proteasas, carbohidrasas, peptidasas, lipasas Decarboxilasas (renina, trombina) Liasas Isomerasas Isomerasas, mutasas Ligasas Sintetasas Cuando hay moléculas muy parecidas al sustrato, ocurre la inhibición de la actividad enzimática, ya que compiten con este para ocupar el sitio activo de la enzima (inhibición competitiva). La actividad también se inhibe cuando otras moléculas se unen a determinadas partes de la enzima, alterando su estructura espacial y dificultando la unión al sustrato (inhibición no competitiva). Los diversos tipos de enzimas Una forma de clasificar a las enzimas es por el tipo de reacción que catalizan, agregando el sufijo “asa” al nombre del sustrato: proteasa, lactasa, amilasa, lipasa, celulasa (Tabla 2). También se puede agregar “asa” al nombre de la reacción catalizada: hidrolasa, oxidorreductasa. A veces se combinan las dos reglas anteriores, mencionando el nombre del sustrato, el de la reacción y agregando “asa”, como por ejemplo, en la ADN-polimerasa. Sin embargo, algunas enzimas, como la renina o la trombina, conservan sus nombres tradicionales. 79 Biotecnología Importancia económica Como agentes biológicos en procesos tecnológicos, las enzimas presentan numerosas ventajas: son específicas y operan en condiciones fácilmente controlables. Como además son biodegradables, puede afirmarse que los tratamientos enzimáticos disminuyen la carga contaminante de los efluentes industriales. De las 25.000 enzimas que, según las estimaciones, existirían en la naturaleza, solo unas 2.800 están clasificadas hasta el momento, y solo 400 se comercializan. El mercado se distribuye fundamentalmente entre las proteasas (59%), las carbohidrasas (28%) y las lipasas (3%), tres grandes conjuntos de enzimas que se emplean en diversas industrias; el 10% restante del mercado corresponde a las enzimas analíticas y farmacéuticas (Tabla 3). En los jabones para la ropa, las enzimas ofrecen al consumidor ropa limpia que parece nueva. Un ejército formado por proteasas, amilasas y lipasas digiere las manchas difíciles (sangre, leche, salsa de tomate, chocolate, pasto, lápiz de labios, etc.), mientras que las celulasas remueven de las prendas las microfibrillas de celulosa. La limpieza se realiza con poco esfuerzo y sin desgastar la tela, porque no es necesario restregar las manchas. Tampoco hay que calentar el agua, porque las enzimas trabajan a temperatura ambiente. Con una ventaja para el fabricante: las enzimas no representan más que una pequeña fracción del jabón (0,4-0,8%) que corresponde al 1% de su costo. Las enzimas se emplean también en la terminación de las telas. Para conseguir el aspecto gastado, los jeans eran lavados con piedras pómez (stone washed), un proceso que tenía el inconveniente de dañar las telas y causar la abrasión de la maquinaria. En los últimos años, las piedras fueron reemplazadas por celulasas, con resultados satisfactorios. Las curtiembres, en lugar de excrementos de perro o paloma, se valen hoy de enzimas pancreáticas para ablandar y desengrasar las pieles. En la industria de alimentos y bebidas, las enzimas participan en la producción de edulcorantes, de pan, bizcochos y galletas, y de quesos. En la extracción de jugos de fruta, las pectinasas aumentan sustancialmente el rendimiento del proceso, al liberar el jugo retenido en la pectina de las paredes celulares vegetales. También facilitan la clarificación de vinos y cervezas. Diversas enzimas entran en la composición de productos cosméticos como cremas depiladoras, desodorantes y artículos de higiene bucal. En dermatología, se las utiliza para combatir signos de envejecimiento y en los tratamientos de acné y caspa. Como medicamentos, las enzimas se aplican 80 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos TABLA 3. Las enzimas como agentes biológicos Agente biológico Aplicaciones Industria de alimentos y bebidas (clarificación de vinos y jugos de frutas, tratamiento del almidón en reemplazo del malteado en la elaboración de cervezas, fabricación del pan, masitas y galletas, producción de edulcorantes, fabricación de lácteos, suplemento de raciones animales). Productos de limpieza (detergentes y jabones para la ropa para la remoción de manchas difíciles, productos para limpiar dentaduras y lentes de contacto). Industria textil (desengomado de telas, terminación de jeans). Enzimas Curtiembres (ablandamiento de cueros). Industrias de papel y celulosa (blanqueamiento de pulpa de celulosa). Cosmética (productos de higiene bucal, depilatorios, tratamiento de acné y de caspa, cosmocéuticos en general). Industria farmacéutica (reactivos para análisis clínicos, nucleasas para manipulación de ADN). Tratamientos médicos (tratamiento de inflamaciones, edemas y lesiones, disolventes de coágulos sanguíneos, agentes terapéuticos para trastornos digestivos). en varios contextos, especialmente en quimioterapia y en las terapias trombolíticas. Muchos de los ensayos clínicos de diagnóstico comunes dependen de reactivos enzimáticos. Las enzimas permiten resolver las mezclas de dos formas isoméricas de moléculas, tipo “mano derecha” y “mano izquierda”, con diferente actividad biológica. De este modo se pueden evitar problemas como el de la talidomida, un medicamento recetado como tranquilizante que causó el nacimiento de numerosos bebés con malformaciones congénitas, en la década de 1960. La tragedia se debió a la presencia en el producto comercial de la forma molecular “derecha”, de acción teratogénica, junto a la del tipo “izquierda” de acción calmante. Actualmente, se están estudiando métodos enzimáticos para eliminar a los priones responsables del denominado “mal de la vaca loca”. También se contempla el uso de enzimas para limpiar áreas contaminadas con agentes químicos como el gas sarín, en el caso de un ataque terrorista. 81 Biotecnología 3. LOS ANTICUERPOS En la estrategia de defensa de un organismo, los anticuerpos son elementos importantes para reconocer “lo propio” y eliminar “lo no propio” (antígeno). Una parte de la respuesta inmune comprende la producción de anticuerpos que reconocen antígenos extraños, desencadenando los mecanismos de destrucción adecuados. En condiciones experimentales de laboratorio, la reacción antígeno-anticuerpo que ocurre al encontrarse los reactivos en determinadas condiciones, puede ser visualizada como: una precipitación, si los antígenos estuvieran disueltos en un medio líquido o en un gel (poliacrilamida); una aglutinación, si los antígenos estuvieran localizados sobre partículas (glóbulos rojos o bacterias). La molécula de anticuerpo y el reconocimiento del antígeno La molécula de anticuerpo denominada IgG (Inmunoglobulina G) está formada por dos cadenas polipeptídicas livianas y dos pesadas, formando una Y, a la que se asocia un pequeño número de grupos carbohidrato. La molécula tiene regiones constantes y otras variables. Estas últimas se localizan en los extremos de los brazos de la Y, y son responsables del reconocimiento y unión al antígeno (Figura 6). Este tipo de anticuerpo se encuentra en el suero sanguíneo, en la fracción proteica caracterizada por electroforesis como -globulina. La unión antígeno-anticuerpo ocurre cuando un anticuerpo encuentra una forma complementaria (epítopo o determinante antigénico) en el antígeno. Este, que puede ser una molécula libre o anclada en la membrana celular, posee generalmente varias de esas formas complementarias que pueden ser reconocidas por anticuerpos diferentes (Figura 7). La producción de anticuerpos en el organismo Las células responsables de la producción de anticuerpos son los linfocitos B, que se forman en la médula ósea. Después de un proceso de diferenciación que comprende una serie de rearreglos genéticos, cada linfocito fabrica muchas moléculas de anticuerpo iguales, capaces de reconocer a un único epítopo. Al encontrar el epítopo específico, el linfocito B prolifera, originando un clon de células secretoras de anticuerpos (Figura 8). Una vez elimina82 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos FIGURA 6. Estructura de la molécula de anticuerpo (IgG) enal d a C iv ia na enapesa d a C a d e R gió n consta nte e R gió na r via e l b i S tio d e unió n la a ntígeno FIGURA 7. Los anticuerpos y el reconocimiento del antígeno Al compartir estructuras (determinantes antigénicos o epítopos), algunos antígenos pueden ser reconocidos por un mismo anticuerpo, dando origen a una reacción cruzada Antígeno 1 Antígeno 3 Anticuerpos Anticuerpos Antígeno 2 Antígeno 4 Anticuerpos Anticuerpos do el antígeno, algunas células de ese clon permanecerán en el organismo como células de memoria. En un contacto posterior con el mismo epítopo, las células de memoria darán inicio a una respuesta inmune, que será más rápida y más intensa que la primera. 83 Biotecnología FIGURA 8. Encuentro del antígeno con el linfocito B y selección clonal Antígeno Linfocitos B de diferente especificidad Selección del linfocito B específico Proliferación celular y secreción del anticuerpo correspondiente La producción de anticuerpos en el laboratorio Los anticuerpos ocupan un lugar importante en las pruebas de diagnóstico clínico, porque reúnen especificidad y diversidad, dos propiedades que los transforman en una herramienta ideal. Cuando un animal (ratón, oveja, conejo) es inoculado con un antígeno, se produce al poco tiempo una respuesta inmune que incluye la producción de anticuerpos contra ese antígeno, y es posible aislarlos del suero sanguíneo del animal. Si el antígeno utilizado posee varios epítopos, en el suero extraído habrá una mezcla de anticuerpos, llamados “policlonales”, que resultan de la activación de varios clones de linfocitos B, cada uno de los cuales reconoce a uno de los epítopos del antígeno. El suero tendrá también anticuerpos contra las impurezas eventuales de la preparación antigénica y contra otros antígenos a los que el animal estuvo expuesto anteriormente. Por eso, la purificación de un suero es un proceso largo y complejo, que deberá ser repetido cada vez que se extrae sangre del animal. A pesar de estos problemas, los reactivos de laboratorio de este tipo se emplearon normalmente hasta la década de 1980. 84 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos FIGURA 9. Producción de anticuerpos en el laboratorio A. Obtención de anticuerpos policlonales Inyección de una mezcla de moléculas B. Obtención de anticuerpos monoclonales Inyección de una mezcla de moléculas Linfocitos B Células de mieloma Hibridomas Suero con anticuerpos de diferente especificidad Cada hibridoma da origen a un clon A: Se colecta el suero de un animal inmunizado contra una mezcla de moléculas entre las cuales está la molécula X. En el suero se encontrarán, mezclados, anticuerpos de diferentes especificidades, uno de los cuales reconoce a X. B: Se inocula un ratón con la misma mezcla de moléculas. Días más tarde se extrae el bazo del animal y se fusionan los linfocitos B (algunos de los cuales reconocen a la molécula X) con células de mieloma. Los hibridomas obtenidos se separan, cultivan y ensayan para identificar a aquellos que produzcan anticuerpos contra X. Cada clon produce anticuerpos con una determinada especificidad No es posible cultivar separadamente los linfocitos, porque sobreviven poco tiempo in vitro. La obtención de clones que sintetizan anticuerpos específicos contra un único epítopo (“monoclonales”) solo fue posible con el desarrollo de la tecnología de hibridomas (Kohler y Milstein, 1975). Un hibridoma es el resultado de la fusión entre un linfocito B y una célula cancerosa (inmortal) de mieloma (Figura 9). Al reunir las propiedades de ambas células, cada hibridoma es capaz de sintetizar un único tipo de anticuerpo (monoclonal) y de multiplicarse indefinidamente en el laboratorio, sea en cultivo de tejidos o en la cavidad peritoneal de un animal hospedador. 85 Biotecnología FIGURA 10. Ensayos de inmunofluorescencia El anticuerpo marcado puede reconocer al antígeno (reacción directa) o al anticuerpo unido al antígeno (reacción indirecta) A. Reacción de inmunofluorescencia directa Antígeno Anticuerpo específico para el antígeno, asociado a una molécula fluorescente B. Reacción de inmunofluorescencia indirecta Antígeno Anticuerpo específico para el antígeno Anticuerpo específico para la fracción constante de los anticuerpos, asociado a una molécula fluorescente Utilización de los anticuerpos Los anticuerpos monoclonales encontraron inmediatamente aplicaciones. Una de ellas es la purificación de biomoléculas, mediante anticuerpos específicos que, fijados a las partículas de una columna de afinidad, permiten separar moléculas de una mezcla que circule a través de ella. Otra aplicación es la separación de diferentes poblaciones celulares en un aparato denominado “cell sorter” (clasificador de células). Las células, previamente marcadas con anticuerpos ligados a una molécula fluorescente, adquieren cargas eléctricas al pasar a través de rayos láser y son separadas mediante una placa deflectora del equipamiento. La visualización de la reacción antígeno-anticuerpo es más fácil cuando los anticuerpos reciben una marcación fluorescente o radiactiva, siendo posible localizar un antígeno en cortes histológicos o cuantificar sustancias presentes en los fluidos corporales (Figura 10). También pueden ser acoplados a una enzima que reaccione con su sustrato formando un producto coloreado, en pruebas de diagnóstico (Figura 11). Por estas razones los anticuerpos monoclonales han reemplazado prácticamente a los policlonales, tanto en 86 Capítulo IV. Enzimas y anticuerpos FIGURA 11. Ensayos inmunoenzimáticos El antígeno puede ser reconocido por un anticuerpo asociado a una enzima que al reaccionar con su sustrato forma un producto coloreado (reacción directa). También puede ser reconocido por un anticuerpo específico y este, a su vez, por un anticuerpo que reconoce la fracción constante del anticuerpo. El segundo anticuerpo está asociado a una enzima que, al reaccionar con su sustrato específico, forma un producto coloreado (reacción indirecta) A. Reacción inmunoenzimática directa Antígeno Anticuerpo específico para el antígeno, asociado a una enzima Sustrato específico de la enzima Formación de un producto coloreado B. Reacción inmunoenzimática indirecta Antígeno Anticuerpo específico para el antígeno Anticuerpo específico para la fracción constante de los anticuerpos, asociado a una enzima Sustrato específico de la enzima Formación de un producto coloreado las pruebas de diagnóstico clínico o ambiental como en el control de calidad de los alimentos. El empleo de anticuerpos para fines terapéuticos demoró mucho más de lo esperado. Producidos en células de ratón, los anticuerpos monoclonales son reconocidos como extraños (no propios) al ser inyectados en el hombre, formando complejos inmunes que dañan gravemente a los riñones. Para evitar estas reacciones, se comenzó la elaboración de anticuerpos monoclonales quiméricos (33% de proteína animal) y humanizados (10% de proteína animal). Estos anticuerpos conservan parte de las secuencias de ratón, especialmente en las partes que reconocen al antígeno, mientras que el resto de la molécula es reemplazado por secuencias humanas. La incorporación de técnicas de ingeniería genética a la elaboración de los anticuerpos monoclonales abrió nuevos caminos para el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades (Tabla 4). 87 Biotecnología TABLA 4. Los anticuerpos como agentes biológicos Agentes biológicos Aplicaciones Purificación de moléculas Anticuerpos Reactivos de laboratorio Reactivos para diagnóstico Inmunoterapias 88 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes 1. LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Aunque los ácidos nucleicos fueron aislados del pus de los vendajes de heridas, por Miescher en 1869, su papel en la herencia y el control de la actividad celular solo comenzó a esclarecerse a mediados del siglo XX. El ácido desoxirribonucleico (ADN) guarda en su estructura las instrucciones necesarias para la construcción de un organismo. Estas dirigen el desarrollo de sus características bioquímicas, fisiológicas, anatómicas e inclusive de algunas comportamentales. En las células procariotas, además de una gran molécula circular de ADN cromosómico, se encuentran una o más moléculas menores de ADN formando también estructuras circulares, llamadas plásmidos. En las células eucariotas, los cromosomas están compuestos por moléculas lineales de ADN asociadas a proteínas y se localizan en el núcleo celular. También hay ADN en algunas organelas, como los cloroplastos y las mitocondrias. El ácido ribonucleico (ARN) se encuentra en el núcleo y en el citoplasma celular. Desde el punto de vista químico, los ácidos nucleicos (ácido ribonucleico y desoxirribonucleico) son macromoléculas formadas a partir de unidades llamadas nucleótidos. Un nucleótido resulta de la asociación, a través de uniones químicas covalentes, de tres tipos de elementos: una molécula de fosfato, un azúcar de cinco carbonos (pentosa: ribosa o desoxirribosa) y una base cíclica nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina o uracilo. Las cadenas se forman por unión covalente de los nucleótidos entre los extremos 5´ y 3´ (Figura 1). En la década de 1940, una serie de estudios indicaba claramente que el material responsable de la herencia era el ADN. Sin embargo, no estaba claro cómo esta molécula podría desempeñar esa función hasta que, en 1953, Watson y Crick formularon un modelo de la estructura tridimensional del ADN que, según sus propias palabras, podría tener un “considerable interés biológico”. 89 Biotecnología FIGURA 1. Composición de los ácidos nucleicos El fosfato Ácido fosfórico Ion fosfato También representado como Una cadena de nucleótidos Extremidad 5' Base El azúcar (pentosa) También representado como Un desoxirribonucleótido Base Base Base en la ribosa en la desoxirribosa Ribosa Desoxirribosa Las bases Purinas: adenina (A), guanina (G) Pirimidinas: citosina(C), timina (T) e uracilo (U) Extremidad 3' Base ou Al carbono 1' de la pentosa Al carbono 1' de la pentosa En el modelo de Watson y Crick, el ADN está compuesto por dos cadenas de nucleótidos formando una doble hélice, que es una figura parecida a una escalera caracol. En esa escalera, el fosfato y el azúcar son los pasamanos, y las bases nitrogenadas, los escalones (Figura 2, A). Las cadenas son antiparalelas, es decir, si una va en sentido 5´ 3´, la otra va en sentido 3´ 5´. Ambas cadenas están unidas entre sí por puentes de hidrógeno entre las bases, y las uniones ocurren siempre entre adenina y timina (dos puentes) y entre citosina y guanina (tres puentes). De acuerdo con el modelo, cuando en una cadena la secuencia de bases es AGTACG, en la otra será TCATGC. Como ambas secuencias son complementarias, cada hebra puede servir como molde para la síntesis de una nueva molécula. Por lo tanto, en el momento de la división celular, cada célula hija podrá recibir una molécula semejante a la de la célula madre (Figura 2, B). La autoduplicación del ADN permite que cada célula reciba una copia del material genético, con las instrucciones necesarias para la construcción y funcionamiento del individuo. 90 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes FIGURA 2. Estructura de la molécula de ADN A. El apareamiento de las bases ocurre siempre entre una purina y una pirimidina: adenina y timina (o uracilo), guanina y citosina B. La duplicación del ADN da origen a dos moléculas iguales. El proceso de duplicación involucra a numerosas enzimas, y en realidad es mucho más complejo de lo que se muestra en el esquema A. La doble hélice Esqueleto de azúcar y fosfato Esqueleto de azúcar y fosfato B. La duplicación del ADN Nucleótido Puentes de hidrógeno Pares de bases Extremo 3' Extremo 5' 2. EL CÓDIGO GENÉTICO El funcionamiento de una célula depende, fundamentalmente, de dos tipos de moléculas: los ácidos nucleicos y las proteínas. Ambos están relacionados, ya que la estructura primaria de un polipéptido está codificada por un gen, o sea, un segmento de ADN. El código es simple, a cada triplete de bases corresponde un aminoácido (Tabla 1). Algunos aminoácidos están codificados por un único triplete, como el triptofano (UGG) o la metionina (AUG) mientras que otros admiten sino91 Biotecnología TABLA 1. El código genético Primera base Segunda base Uracilo (U) Citosina (C) Adenina (A) Guanina (G) Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Tyr Tyr stop stop His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Cys Cys Stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) Tercera base Uracilo (U) Citosina (C) Adenina (A) Guanina (G) nimia, como la prolina que está codificada por varios codones (CCU, CCC, CCA, CCG). El inicio de la secuencia está indicado por el codón AUG, correspondiente a la metionina, un aminoácido que en general es removido posteriormente. Los codones UAA, UAG o UGA, que significan stop señalizan el fin de la secuencia. Un cambio en la secuencia de bases del ADN puede tener como consecuencia la sustitución de un aminoácido por otro. En el ejemplo de la Figura 3, si el GUG fuera reemplazado por CGU, en el péptido la valina sería sustituida por leucina. Pero, dada la sinonimia existente en el código, si el triplete GUG fuera sustituido por GUA o GUC, el aminoácido codificado continuaría siendo valina. Las pérdidas o inserciones de una base modifican el resto de la secuencia del péptido. Los pequeños cambios o mutaciones puntuales se deben a errores que ocurren en la duplicación del ADN y su frecuencia aumenta en presencia de algunos agentes químicos y físicos (luz UV, rayos X). 92 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes 3. LA EXPRESIÓN GÉNICA El flujo de la información genética La información codificada en el ADN se transcribe a una molécula mensajera que la lleva hasta los ribosomas, donde las instrucciones serán traducidas del lenguaje de los ácidos nucleicos al lenguaje de las proteínas, formándose el péptido correspondiente (Figura 3). De este modo, se establece en la célula un flujo de información genética que sigue un sentido único: del ADN al ARN, y del ARN al péptido. Una excepción a esta regla son los retrovirus, cuyo material hereditario es ARN, porque cuentan con una enzima (transcriptasa reversa) que les permite transcribir la información en el sentido ARN ADN. En la síntesis de proteínas intervienen, básicamente, tres tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. FIGURA 3. El flujo de la información genética 5' 3' TRANSCRIPCIÓN ADN 3' 5' Cadena codificante Cadena molde ARNr 5' 3' ARNt + Aminoácidos Met Pro ILe Cis Ribosoma TRADUCCIÓN Donde ocurre la síntesis Transporta a los aminoácidos y los coloca en el lugar adecuado Leu Val H2N Asn Val Met Pro ILe COOH Met Asn Péptido 93 Biotecnología El ácido ribonucleico mensajero o ARNm, de tamaño variable y cadena simple. La molécula de ARNm lleva hasta los ribosomas la información genética transcripta en tripletes de bases (codones) complementarios a un segmento de una de las dos hebras del ADN. El ácido ribonucleico ribosómico o ARNr. Asociado a proteínas, el ARNr forma las dos subunidades de los ribosomas, que son las estructuras donde ocurre la síntesis proteica. El ácido ribonucleico de transferencia o ARNt, capaz de reconocer simultáneamente un aminoácido y un codón de ARNm, y del cual existen 61 tipos moleculares diferentes. Cabe destacar que así como existen genes codificadores de proteínas, también hay genes codificadores de ARNr y ARNt, ácidos ribonucleicos que no llevan información sobre la secuencia de ninguna proteína. La expresión génica presenta algunas diferencias entre las células procariotas y eucariotas (Figura 4). Diversos mecanismos regulan cada etapa. Células procariotas Una bacteria puede tener aproximadamente 2.500 genes, que no funcionan todos al mismo tiempo. Si hay lactosa en el medio (y falta glucosa), las bacterias sintetizan a las enzimas que permiten su utilización. Y si falta el aminoácido triptofano en el medio, produce a las diferentes enzimas necesarias para sintetizarlo. Esto se ve facilitado por la agrupación de los genes correspondientes en “operones”, que son encendidos o apagados en conjunto (Figura 5). En este proceso de “encender y apagar” participan tres elementos anteriores a las secuencias codificadoras: el promotor, el operador y el gen regulador. La enzima ARN-polimerasa debe unirse al promotor para comenzar a desplazarse a lo largo del gen. El gen regulador sintetiza una proteína que se une al operador, permitiendo o bloqueando el pasaje de la ARN-polimerasa. Este mecanismo posibilita la inducción o represión de la transcripción de las secuencias codificadoras. La organización de los genes de una misma vía metabólica en operones permite que la célula se adapte rápidamente a las condiciones ambientales, con una cierta economía de recursos. El funcionamiento del operón depende de la función que ejercen los productos de los genes (degradación o síntesis). Por eso la presencia de lactosa induce la transcripción del operón Lac, sintetizándose las diferentes enzimas necesarias para degradarla. En ausencia de lactosa, el operón deja de funcionar. En cambio en el operón Trp, la pre94 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes FIGURA 4. Transcripción y traducción A. Células procariotas Transcripción Traducción Modificaciones posteriores Alteración de la actividad de la proteína ADN ARNm Proteína B. Células eucariotas Modificaciones posteriores Alteración de la actividad de la proteína Transcripción Procesamiento Traducción ADN ARN transcripto ARNm ARNm Proteína Para membrana nuclear FIGURA 5. Organización de un gen en las células procariotas p O erón e G n reg ulador 5 ' ADN ' 3 e Scuencia transcripta l Eproducto de este g en es una proteína q ue en alg unos casos bloq uea yen otros desbloq uea el paso de la ARNpolimerasa i F n de la transcripción Promotor p O erador e G n1 e G nes estructurales e G n2 e G n3 sencia de triptofano reprime la transcripción de las enzimas necesarias para sintetizar este aminoácido. Otra característica de la célula procariota es que la síntesis proteica comienza cuando el ARNm todavía está siendo transcripto, de manera que la transcripción y la traducción son simultáneas. 95 Biotecnología Células eucariotas La transcripción Las bacterias no son las únicas que prenden y apagan sus genes. Una célula humana con 20.000 a 25.000 genes no expresa más que el 3 al 5% de ellos, que no serán necesariamente los mismos a lo largo de la vida embrionaria o en diferentes tipos celulares. Sin embargo, salvo en nemátodos, no se encontraron operones en las células eucariotas. Los genes responsables de una secuencia de reacciones metabólicas se hallan dispersos en uno o en varios cromosomas. El control de la transcripción comienza en la compactación del cromosoma y en la metilación de algunas bases, dos mecanismos que pueden dificultar el acceso de la maquinaria de transcripción al ADN. Esa maquinaria comprende factores de activación, factores de transcripción y proteínas reguladoras, algunas de las cuales dependen de otras secuencias estimuladoras o inhibidoras distantes del gen. Las secuencias reguladoras iniciales determinan cuándo, por cuánto tiempo y en qué células el gen será transcripto. Al reconocer la presencia de estos factores y proteínas reguladoras en la región anterior al gen, la ARN-polimerasa se une a las secuencias promotoras de la transcripción. Asociada a otros factores adicionales, la enzima se desplaza abriendo la doble hélice y transcribiendo la secuencia codificadora al ARN. La enzima avanza en sentido 5´ 3´, y varias moléculas de ARN polimerasa pueden transcribir el mismo gen simultáneamente, como en fila india. La síntesis acaba cuando la ARN-polimerasa encuentra una secuencia terminadora. Una vez cumplida su tarea, la molécula de ARN-polimerasa será liberada. Las secuencias reguladoras terminales indican cuál será la vida media de la molécula de ARNm. El procesamiento del ARN transcrito En los organismos eucariontes la estructura del gen está fragmentada (Figura 6). Toda la secuencia génica es transcrita al ARN pero este pasará posteriormente por un mecanismo de “corte y unión” (splicing). Algunas secuencias (intrones) serán eliminadas en el núcleo, mientras que las restantes (exones) formarán el ARN mensajero que saldrá del núcleo en dirección al citoplasma. Las consecuencias biológicas de este mecanismo son importantes, porque formas alternativas de “corte y unión” permiten 96 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes FIGURA 6. Organización de un gen en las células eucariotas Gen Secuencias reguladoras promotoras de la transcripción 5' 3' Secuencias reguladoras terminadoras de la transcripción 3' 5' Inicio de la transcripción Fin de la transcripción que un único gen exprese proteínas diferentes en los diversos tejidos. El número y la extensión de los intrones varían en los diferentes genes y en las diferentes especies. Antes de salir del núcleo, el ARN transcripto sufre otras modificaciones adicionales, con el añadido en la extremidad 5´ de una estructura denominada CAP (7-metilguanosina) que lo dirigirá al ribosoma y, en el extremo 3´ de una cola de poli(A) que le dará estabilidad en su viaje hasta la maquinaria de traducción. La traducción y el destino de las proteínas La síntesis proteica se inicia después de que el ARNm atraviesa la membrana nuclear y migra al citoplasma. Como en la transcripción, en la traducción participan numerosas enzimas y proteínas reguladoras. Algunas proteínas llevan secuencias que, apenas comenzada la síntesis, arrastran el ribosoma al retículo endoplasmático. Es el caso de las proteínas que integran las membranas o cuyo destino es el exterior de la célula. Otras proteínas son traducidas en los ribosomas libres del citosol, y su destino son algunas organelas o el propio citosol. El ARNm reconoce al ribosoma a través de una secuencia específica. La asociación entre ambos da inicio a la síntesis proteica. Los ARNt llevan los aminoácidos correspondientes hasta la cadena peptídica. La complementariedad entre el anticodón del ARNt y uno de los codones del ARNm garantiza que el aminoácido sea colocado en el lugar adecuado de la secuencia. Existen varios mecanismos de regulación que incluyen la acción de proteínas asociadas al complejo ribosómico, variaciones en la vida media del 97 Biotecnología ARNm e inclusive la traducción del ARNm por varios ribosomas al mismo tiempo. El péptido sintetizado pasará por diversas modificaciones y asociaciones hasta transformarse en el producto final activo, una proteína con una estructura cuaternaria determinada. Las etapas de la expresión génica Las diferentes etapas de la expresión génica en células procariotas y eucariotas se encuentran representadas en la Figura 7. 4. EL COMPLEJO MUNDO DEL ARN No todos los genes transcriptos producen proteínas. El ARN ribosómico (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt), por ejemplo, cumplen otras funciones específicas dentro de la célula. En los últimos años comenzó a ser estudiado el rol de unas pequeñas moléculas de ARN no codificador (ARNs, del inglés small RNA) en las actividades celulares, descubriéndose que participan en el procesamiento de intrones y exones, en la regulación de la expresión génica y en la conservación de los telómeros. La importancia del ARN se debe a sus propiedades, una de las cuales es poder asociarse a proteínas y llevar a cabo una acción catalítica. Además, sus características estructurales le permiten aparear con otra cadena de ácido nucleico, siempre que las secuencias sean complementarias. Entre los diversos tipos de ARN descriptos recientemente, hay un subgrupo que impide la expresión génica en el nivel de la traducción. Comprende moléculas de doble cadena que, al ser cortadas por enzimas específicas, forman fragmentos de aproximadamente 20 nucleótidos. Cuando uno de esos fragmentos se asocia al complejo proteico llamado RISC (del inglés RNA-induced silencing complex), una de las dos cadenas es degradada. El pareamiento de la cadena restante con un ARNm de secuencia parcial o totalmente complementaria, bloquea la traducción o provoca su destrucción (Figura 8). El proceso, que puede ocurrir en relación a moléculas de ARN endógenas o exógenas, permite tanto eliminar las moléculas de ARN viral que pudieran haber penetrado en la célula como silenciar la expresión de un gen. Las primeras aplicaciones de la tecnología de silenciamiento génico contemplan la agricultura y la medicina. 98 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes FIGURA 7. Etapas de la expresión génica, en células procariotas y eucariotas CITOPLASMA ADN ADN ARN ARN Núcleo Intrones Exones Gen A AAAAAA B AAAAAA Transcripción Traducción Proteínas ARNm ARNm AAAAAA A: adición de un revestimiento inicial (CAP) y de una cola de Poly-A B: mecanismos de corte y reunión Proteína FIGURA 8. El silenciamiento génico Molé cula de ARN con dos ilamentos de una veintena f de nucleótidos Complej o enz imá tico RISC ARNm o ARN viral Complementariedad entre amb os ARNs (por lo menos 6 a bses) Complementariedad parcial yb loq ueo de la traducción Complementariedad total y destrucción del ARNm 99 Biotecnología 5. LA GENÓMICA El genoma humano El término genoma designa al conjunto haploide completo de cromosomas que contiene toda la información genética de un individuo. El genoma nuclear de la especie humana está representado por 24 cromosomas diferentes (22 autosómicos, el X y el Y), en cada uno hay una molécula de ADN. El genoma mitocondrial, de gran importancia en el área médica, corresponde al ADN presente en las mitocondrias, que es heredado exclusivamente por vía materna. En 1990 se dio inicio al Proyecto Genoma Humano (HGP, del inglés human genome project), uno de los proyectos científicos más ambiciosos realizados alguna vez, en el que participaron investigadores de más de 18 países, con la tarea de mapear y secuenciar el ADN humano y el de otros organismos. En junio de 2000 el International Human Genome Sequencing Consortium, del sector público, y Celera Genomics, una empresa privada norteamericana, anunciaron simultáneamente haber completado el borrador del genoma humano. En febrero de 2001, los resultados obtenidos se publicaron en las revistas Nature y Science, respectivamente. En abril de 2003, cincuenta años después del descubrimiento de la doble hélice, el Consorcio anunció haber completado el 99% del genoma. Los resultados del proyecto están almacenados en bancos de datos públicos a los que se puede acceder por internet. A continuación mencionamos las principales conclusiones del proyecto. El número de bases del genoma humano llega a 3.2 mil millones, y el número de genes está entre 20.000 y 25.000; solo el 2% del genoma codificaría proteínas. El número de genes en organismos como la mosca Drosophila melanogaster o el gusano Caenorrabditis elegans es tres veces menor. Compartimos con esos organismos algunos genes y contamos con otros que son propios de los vertebrados como, por ejemplo, varios de los genes relacionados con el sistema inmune. La densidad de los genes varía entre los diversos cromosomas y entre las diferentes regiones de los cromosomas. Existen grandes espacios entre los genes, mal llamados “ADN basura”. Proyectos posteriores mostraron que la mayor parte de ese ADN tiene alguna función bioquímica (ENCODE, 2012). 100 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes El tamaño de los genes es variable, con un promedio de 3.000 pares de bases. En realidad, el tamaño no parece tener mucha importancia. Como una buena parte de los genes pueden ser leídos de diferentes maneras, el número de proteínas podría ser mayor. Independientemente de nuestro origen étnico, compartimos con el resto de los seres humanos el 99,9% de nuestra secuencia génica. Las diferencias entre los seres humanos se deben a variaciones de una base en 3.000.000 de puntos, dentro y fuera de los genes. Estas variaciones se denominan polimorfismos de un único nucleótido o SNP (del inglés, single nucleotide polymorphisms). Los SNP pueden brindar información sobre las bases genéticas de la susceptibilidad a una serie de enfermedades o servir como marcadores de las mismas (enfermedad cardiovascular, diabetes, artritis y cáncer). En varios genes se encontraron secuencias asociadas a enfermedades (cáncer de mama, ceguera, sordera, enfermedades musculares). El Proyecto Genoma no podría haber avanzado sin el desarrollo de la bioinformática, un conjunto de tecnologías nuevas que utiliza métodos matemáticos y de computación para la secuenciación de los genes. Los laboratorios de secuenciación modernos están altamente automatizados, y gran parte del trabajo fue realizado con robots y computadoras. La cantidad de información, almacenada en grandes bancos de datos, es inmensa. Muchos de los estudios actuales ya no se hacen in vivo o in vitro, sino in silico, es decir en computadoras. La genómica surge como una nueva disciplina que intenta responder a algunas preguntas fundamentales: ¿dónde están los genes? ¿Qué hace cada gen? ¿Cómo difieren los organismos en relación a sus genes? Cada pregunta subdivide a la genómica en genómica estructural, genómica funcional y genómica comparativa. Paralelamente, han sido definidas otras áreas de estudio, como: la transcriptómica, que concierne al ARN transcripto o transcriptoma, es decir, a los patrones de expresión génica; la proteómica, que se refiere al conjunto de proteínas de la célula o proteoma, que varía con la diferenciación celular y con las respuestas a estímulos ambientales; la metabolómica, relativa al conjunto de sustratos y productos de reacciones enzimáticas que inciden en el fenotipo celular. La genómica tiene aplicaciones inmediatas en el campo médico y farmacológico, a través de las pruebas genéticas y del diseño de nuevos medicamentos (Tabla 2). Se estima que de los 20.000 / 25.000 genes humanos 101 Biotecnología TABLA 2. El ADN como agente biológico Agente biológico Aplicaciones Identificación de microorganismos patogénicos. Control de calidad de alimentos. Medicina molecular (diagnósticos, tratamientos personalizados, terapias génicas). ADN y genómica Pruebas genéticas (diagnósticos, evaluación de riesgo para la salud). Agronomía y pecuaria (métodos de selección más eficientes). Industria farmacológica (proteínas terapéuticas, vacunas recombinantes y de ADN). Práctica forense (identificación de personas). Estudios antropológicos y evolutivos. recientemente descubiertos, de 5.000 a 10.000 podrían ser objeto de estudio para nuevos productos farmacológicos. Si se consideran las proteínas, ese número se multiplica por diez. El desarrollo de la genómica en América Latina Paralelamente al genoma humano, fueron secuenciados otros organismos (microorganismos, plantas, animales). El número de genomas mapeados crece cada día. A corto o mediano plazo esta información beneficiará también al desarrollo de la agricultura, de la pecuaria y de la industria química. En América Latina hay numerosos proyectos en marcha (Argentina, Brasil, Chile y México). De un modo general, resultan de la colaboración entre instituciones públicas y privadas y se benefician de los acuerdos internacionales con países desarrollados (Estados Unidos, Francia, Alemania) o de la formación de redes de cooperación interregionales (Brasil, Argentina, Chile, Uruguay y Paraguay). Pionero en la ciencia genómica, Brasil alcanzó resultados significativos en diversas áreas, que mencionamos a continuación. Salud humana: secuenciación del genoma de Schistosoma mansoni (gusano helminto que causa la esquistosomiosis), Leishmania chagasi (proto102 Capítulo V. Ácidos nucleicos y genes zoario que causa la leishmaniasis visceral o kala-azar), Paracoccidioides brasiliensis (hongo que causa micosis), Trypanosoma cruzi (protozoario que causa la enfermedad de Chagas), Leptospira interrogans (bacteria transmitida por la orina de roedores y que afecta al hombre). También con estudios sobre el genoma humano del cáncer y el genoma clínico. Salud animal: secuenciación del genoma de Mycoplasma synoviae (bacteria que afecta a los bovinos) y Mycoplasma hyopneumoniae (bacteria que afecta a los porcinos). Pecuaria: secuenciación de Bos indicus (ganado Nelore adaptado a Brasil). Agricultura: secuenciación de Xylella fastidiosa (causa la clorosis variegada de los cítricos), Xanthomonas (bacteria que causa la cancrosis o tristeza de los cítricos), Leifsonia xyli (bacteria que ataca a la caña de azúcar), Crinipellis perniciosa (hongo que ataca al cacao), Gluconacetobacter diazotrophicus y Herbaspirillum seropedicae (bacterias fijadoras de nitrógeno). Industria: secuenciación del genoma de Chromobacterium violaceum (bacteria que puede dar compuestos de interés farmacológico) y de varios cultivos industriales (guaraná, café, caña de azúcar, eucalipto). Estos proyectos fueron posibles gracias al compromiso pionero de la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de San Pablo (FAPESP) y la creación de la Red Nacional de Secuenciación del Programa Genoma Brasileño (CNPq, Ministerio de Ciencia y Tecnología), con 25 laboratorios regionales y un laboratorio de bioinformática (Laboratorio Nacional de Computación Científica) que dieron la infraestructura necesaria y posibilitaron la capacitación profesional. 103 Las herramientas básicas Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos 1. LOS PROCESOS FERMENTATIVOS Y LA INDUSTRIA El primer proceso fermentativo industrial fue el de la producción de vinos y cervezas. En el transcurso del siglo XX, la expansión de la microbiología industrial y el desarrollo de procesos basados en el metabolismo microbiano posibilitaron la producción de diversas sustancias (acetona, butanol, etanol, ácido cítrico, antibióticos, etc.). Actualmente, las fermentaciones se aplican tanto en la producción de alimentos y aditivos, productos químicos y medicamentos, como en el tratamiento ambiental. Por motivos históricos, el término “procesos fermentativos” aún se usa en biotecnología para referirse a cualquier proceso microbiano realizado a gran escala, sea este una fermentación o no. Y el término fermentador se usa como sinónimo de biorreactor, refiriéndose al recipiente donde ocurre el proceso. Ya sean tradicionales o renovados por las posibilidades de la manipulación genética, los bioprocesos o “fermentaciones” persiguen uno de los siguientes objetivos: multiplicación de microorganismos para la obtención de biomasa (levaduras, rizobios, proteína unicelular); obtención de productos microbianos (antibióticos, aditivos, alcohol, enzimas, etcétera); conversión de una sustancia en otra por acción de microorganismos o enzimas (transformación de esteroides, isomerización de glucosa a fructosa, etcétera); limpieza de un solvente (tratamiento de efluentes, transformación de un contaminante en alguna sustancia fácilmente degradable, etcétera). Un proceso fermentativo comienza con la elección del agente biológico adecuado (microorganismo o enzima), continúa con la transformación de la materia prima, en condiciones que pueden exigir esterilización, aireación y control del proceso (pH, temperatura, etc.), y finaliza con la separación y purificación del producto final (Figura 1). Cabe destacar que las células animales y vegetales también pueden cultivarse en gran escala, como se verá en el próximo capítulo, junto con las técnicas de cultivo de tejidos. 107 Biotecnología FIGURA 1. El proceso fermentativo Para que el proceso sea económicamente viable, se debe contar con una materia prima barata, un procedimiento que pueda ser controlado y una forma de recuperar el producto que simplifique al máximo su purificación Preparación del inóculo FASE DE LABORATORIO Preparación del medio FASE INDUSTRIAL Esterilización Controles (temperatura, pH) Aire Esterilización Tratamiento final Subproductos Productos Residuos 2. LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES Nociones sobre el metabolismo Anabolismo y catabolismo Denominamos metabolismo al conjunto de reacciones químicas de degradación (catabolismo) y de síntesis (anabolismo) de sustancias en un organismo. Las primeras liberan energía, las otras la consumen (Figura 2). Las células y la mayoría de los microorganismos extraen de los compuestos orgánicos la energía que precisan para el mantenimiento de sus estructuras y funciones. En las vías catabólicas, la degradación de compuestos orgánicos en moléculas más pequeñas libera energía; una parte será almacenada en la forma de ATP (trifosfato de adenosina), y la restante se disipará como calor. 108 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos FIGURA 2. Anabolismo y catabolismo Nutrientes liberadores de energía: carbohidratos, grasas, proteínas Macromoléculas celulares: proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos Vías catabólicas ENERGÍA Vías anabólicas Productos finales pobres en energía: CO2, H2O, NH3 Moléculas precursoras: aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, bases nitrogenadas Las principales vías catabólicas son la respiración y la fermentación (Figura 3). Tanto la cantidad de energía liberada como los productos finales difieren si la oxidación del compuesto orgánico es total o parcial. En la glicólisis, la glucosa es degradada hasta una molécula de tres carbonos, el piruvato. En presencia de oxígeno, la entrada del piruvato en el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa permiten la transformación total de la glucosa en CO2 y H2O, liberando una gran cantidad de energía como ATP (respiración aerobia). A través de la reducción del piruvato o de alguno de sus derivados (fermentación), varios microorganismos generan otras sustancias orgánicas: acetona, butanol, etanol, ácido láctico, ácido acético, glicerol, etc. Estas reacciones ocurren generalmente en ambientes donde el sustrato es abundante, obteniéndose una pequeña cantidad de energía. Dependiendo de las condiciones ambientales, es decir, de la presencia o ausencia de oxígeno, algunas levaduras y bacterias (así como las células musculares) pueden respirar o fermentar. La respiración y algunas fermentaciones se representan mediante ecuaciones, como las siguientes: 109 Biotecnología FIGURA 3. Respiración y fermentación En la respiración, donde el último aceptor de electrones es el oxígeno, la oxidación de la glucosa se completa hasta llegar a CO2 y H2O, produciendo 36 a 38 moléculas de ATP. En la fermentación, el último aceptor de electrones es el piruvato o algún otro derivado, produciendo 2 ATP Glucosa GLICÓLISIS (2 ATP) Citoplasma Ácido pirúvico Sin O2 Con O2 FERMENTACIÓN Compuesto orgánico (etanol, ácido láctico) RESPIRACIÓN Ciclo de Krebs y cadena respiratoria Citoplasma (células procariotas) Mitocondria (células eucariotas) CO2, H2O y 36-38 ATP Respiración aerobia: C6H12O6 + 6 O2 +38 ADP + 38Pi 6 CO2 + 6 H2 O + 38 ATP Glucosa Fermentación alcohólica (levadura Saccharomyces cerevisiae y algunas bacterias): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi 2 CH3 CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP Glucosa Etanol o alcohol etílico Fermentación láctica (bacterias como Streptococcus y Lactobacillus): C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi 2 CH3 CHOH COOH + 2 ATP Glucosa Ácido láctico En el metabolismo los caminos de degradación se cruzan con los de síntesis. Hay otras moléculas (aminoácidos, ácidos grasos) que pueden entrar en determinados puntos de la vía catabólica de la glucosa, convergiendo para la producción de energía y de pequeñas moléculas simples (CO2, H2O y NH3). 110 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos Inversamente, algunos de los compuestos intermediarios del catabolismo son los puntos de partida de vías anabólicas. Sin embargo, las vías metabólicas no son reversibles: el camino seguido en la degradación de una sustancia es parcial o totalmente diferente al camino de síntesis correspondiente, pudiendo inclusive ocurrir en compartimientos celulares diferentes. Esta separación facilita la regulación enzimática del metabolismo, que ocurre con el menor desperdicio de materia y energía. Metabolismo primario y secundario Además de las vías metabólicas primarias, que son comunes a todos los microorganismos, existen vías metabólicas secundarias específicas. La activación de unas u otras depende del microorganismo y de las condiciones en que crece, sea en su ambiente natural o de cultivo. Los metabolitos primarios están relacionados con el crecimiento de los microorganismos y la transformación de los nutrientes en biomasa; los principales ejemplos son el etanol, el ácido láctico y los aminoácidos. Los metabolitos secundarios no son necesarios para el metabolismo microbiano, pero permiten la supervivencia en ambientes extremadamente competitivos, donde los nutrientes son escasos. Son metabolitos secundarios los antibióticos, los alcaloides, los pigmentos y algunas enzimas y toxinas. Cuando los microorganismos se multiplican en un medio con una cantidad limitada de nutrientes, la población pasa por diversas fases (estas se representan en la Figura 4, A). Fase lag o de latencia: período de adaptación en el que, a pesar de no dividirse, los microorganismos sintetizan enzimas y otros compuestos celulares. Fase log o logarítmica: la población crece de manera exponencial, sintetizando numerosos metabolitos primarios. Fase estacionaria: debido al agotamiento de los nutrientes y a la acumulación de productos de excreción, algunas células mueren mientras que otras logran dividirse. Hacia el final de la fase log y el inicio de la fase estacionaria comienzan a sintetizarse los metabolitos secundarios. Fase de declinación o muerte: sin la renovación de los nutrientes, las células mueren en un tiempo variable. Para desarrollar un bioproceso se deberá elegir al microorganismo en función de sus vías metabólicas, y las condiciones de cultivo dependerán de si 111 Biotecnología el producto deseado es un metabolito primario o un metabolito secundario (Figura 4, B). El origen de las cepas industriales Para que el cultivo en un fermentador resulte económicamente viable, el microorganismo debe ser capaz de multiplicarse rápidamente, sintetizando una gran cantidad de productos a partir de una materia prima barata. Existen bancos y colecciones de cultivos especializados que venden cultivos puros de microorganismos, genéticamente estables y aptos para el cultivo en gran escala. A pesar de haber sido aisladas del medioambiente, las cepas industriales difieren sustancialmente de las cepas originales, en virtud de una serie de alteraciones genéticas (mutaciones, recombinaciones) obtenidas en el laboratorio. Algunas vías metabólicas, especialmente las del metabolismo secundario, pueden haber sido alteradas, con la intención de aumentar al máximo la síntesis del producto deseado y de evitar la producción de algunas sustancias innecesarias o indeseables. Debido a esas alteraciones genéticas y metabólicas, las cepas industriales sobreviven poco tiempo en el medioambiente. La producción de medicamentos y vacunas, así como la de ingredientes de alimentos y cosmética, exigen medidas de seguridad muy estrictas. Las cepas utilizadas no deben ser patógenas ni producir toxinas. Como los microorganismos constituyen un grupo biológico muy diverso y aún poco conocido, existen muchas expectativas en relación a la prospección de cepas en ambientes extremos o poco usuales. No es necesario desarrollar un proceso nuevo para cada microorganismo que presente alguna característica comercial interesante; la tendencia actual es transferir los genes correspondientes a alguno de los microorganismos conocidos y adaptados a las condiciones industriales. Medios de cultivo y materia prima Si se quiere cultivar un microorganismo, habrá que incluir en el medio a todos los nutrientes necesarios, en concentraciones adecuadas. El diseño varía en función del microorganismo y del objetivo del proceso pero, en general, la composición de un medio de cultivo de uso en el laboratorio incluye: agua; una fuente de energía y de carbono: glucosa, almidón, etc.; una fuente de nitrógeno inorgánica (sulfato de amonio, nitrato de potasio, etc.), orgánica (asparragina, succinato de amonio, glutamato, urea, etc.) o 112 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos FIGURA 4. La producción de metabolitos A. Las fases de crecimiento de una población Las células y los metabolitos primarios se producen a lo largo de la fase log; los metabolitos secundarios, hacia el final de la fase log e inicio de la fase estacionaria Logaritmo del número de células Tiempo Fase lag Fase log Fase estacionaria Fase de declinación B. La producción de metabolitos primarios y secundarios Los nutrientes del medio permiten la multiplicación celular y la formación de metabolitos primarios, que pueden ser utilizados por las células para sintetizar metabolitos secundarios (a). Estos pueden sintetizarse también directamente a partir de alguna sustancia del medio (b) a e M tab olito secundario b e M dio nutritiv o C élulas e M tab olito primario compleja (harina de soja, peptona, etc.); sales minerales, tales como fosfato de potasio (K2HPO4 o KH2PO4), sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O), cloruro de calcio (CaCl2), etc.; micronutrientes: hierro, zinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno. Para una explotación comercial, los medios definidos son sustituidos en la industria por materias primas de bajo costo, como por ejemplo, suero 113 Biotecnología de leche, melaza de caña o de remolacha, almidón de maíz, etc. En algunos casos, la materia prima se trata previamente con métodos físicos o químicos. En un proceso enzimático, el medio deberá llevar, además del sustrato adecuado, los elementos necesarios para que la enzima pueda ejercer su actividad catalítica (precursores, co-factores, etcétera). 3. LOS DIFERENTES TIPOS DE BIOPROCESOS Los procesos tradicionales Algunas fermentaciones se realizan sobre residuos agroindustriales o forestales, como granos, paja, bagazo, aserrín, etc. Este tipo de fermentación en medio sólido humedecido se utiliza en la producción de alimentos, como por ejemplo, el levado de la masa en la panificación, la maduración de quesos por acción de hongos (roquefort, gorgonzola), el cultivo de hongos, la fermentación del cacao, del café, del té, etc. En Asia, estos procesos son la base, a través de la preparación del koji, de alimentos tradicionales como el tofu, el miso, el shoyu y el sake. En algunos lugares estas fermentaciones se hacen artesanalmente dentro de hojas de plátano, cestas de bambú, o “montones”, pero actualmente también hay equipos sofisticados con bandejas, columnas, frascos y tambores rotativos, algunos totalmente automatizados (Figura 5). Una variante interesante del proceso fermentativo es la producción tradicional del vinagre (proceso francés o de Orleáns) en barriles de roble. El vino se inocula con bacterias del género Acetobacter, que forman en la superficie la “madre del vinagre”, una película que flota, sostenida por una cuadrícula de madera que impide que se hunda. Así, el microorganismo crece en la superficie, donde se encuentra en contacto, al mismo tiempo, con el medio nutriente líquido y con el aire. Este proceso brinda excelentes vinagres, pero es lento y requiere mucho espacio, porque la capacidad de cada barril solo llega a 200 litros (Figura 6). Existen otros procesos similares, llevados a cabo por hongos y que forman una película de micelio en la superficie del líquido. Los procesos sumergidos Actualmente, la mayoría de los procesos industriales se desarrollan en cubas de vidrio o acero. El medio de cultivo ocupa aproximadamente el 75% de la 114 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos FIGURA 5. Modelo de biorreactor para fermentaciones en fase sólida Inyección de aire Humedad Controles Salida de aire Bandeja con la materia prima para el cultivo de microorganismos FIGURA 6. Un proceso tradicional, la producción de vinagre (Método de Orleáns) ub T o para agregar el vino n Etrada de aire a M “ dre”del vinagre o M sto x t E racción del vinagre cuba, ya que a veces es necesario inyectar aire, y en muchas fermentaciones se forma espuma. Los agentes biológicos se encuentran sumergidos en el medio. El diseño del biorreactor debe adecuarse al objetivo del proceso, teniendo en cuenta la esterilización del sistema, la aireación y homogenización del medio, el agregado de nutrientes y de aditivos antiespuma, el mantenimiento del pH, etc. Los modelos de fermentadores más utilizados con microorganismos son los que cuentan con aireación y agitación mecánica, porque facilitan la distribución de los nutrientes en la cuba. Tienen el inconveniente 115 Biotecnología de generar calor, y este debe ser eliminado mediante la circulación de agua fría (Figura 7). En algunos biorreactores la homogenización depende de la inyección de aire. Los modelos en columna o torre pueden llegar a tener una gran capacidad. Es el caso de los fermentadores donde se produjo durante un tiempo la proteína unicelular (o SCP, por sus siglas en inglés, Single Cell Protein), de la Imperial Chemical Industries (ICI) del Reino Unido, o el de los biorreactores utilizados en la producción de etanol. Los sistemas sumergidos son apropiados para el cultivo de microorganismos libres, pero resultan poco económicos cuando se trabaja con células o enzimas caras. Estas pueden ser inmovilizadas por unión a un soporte inerte o por inclusión dentro de un polímero que permita el contacto con el medio de cultivo (Figura 8). Además de simplificar la purificación del producto, la inmovilización posibilita la reutilización de las células o de las enzimas, que permanecen dentro del biorreactor, generalmente pequeño. FIGURA 7. Modelo de biorreactor para fermentaciones sumergidas El crecimiento de la población microbiana y la cantidad de producto formado son monitoreados a partir de muestras extraídas durante el proceso Motor Vapor Entrada de células o nutrientes Bomba Entrada de ácido o de base Indicador de presión Sonda de pH (control) Mezclador Salida de gases Sonda de temperatura (control) Vapor Salida del producto Entrada de aire 116 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos Si el proceso exige asepsia, esta puede conseguirse mediante: la esterilización del medio (dentro o fuera del fermentador); la desinfección o esterilización del equipamiento por inyección de vapor o mediante el calor generado por serpentinas. Esta última medida se aplica también a todos los conductos de entrada y de salida de las válvulas correspondientes; la esterilización del aire con filtros adecuados. FIGURA 8. Fermentaciones sumergidas, agentes biológicos y biorreactores Los biorreactores se adaptan a las necesidades de cada agente biológico y de cada tipo de proceso FERMENTACIONES Llevadas a cabo por CÉLULAS Y ENZIMAS Libres Inmovilizadas En reactores con agitación mecánica En reactores con agitación neumática En soportes inertes Entre membranas Reactores de lecho fijo Reactores de fibra hueca Gases Gases Salida de líquido Reactores STR o de lecho fluidizado o con membranas planas Aire Entrada Aire Columna de esferas Reactores air-lift Producto Medio Producto Producto Reactores en torre 117 Biotecnología 4. DEL LABORATORIO A LA INDUSTRIA El cambio de escala La capacidad de una cuba varía entre 1 y 10 litros para un fermentador de laboratorio, alcanzando 5.000 litros en una planta piloto y 100.000 litros en una planta industrial. Una operación simple de laboratorio puede ser impracticable o poco rentable si se realiza a gran escala. Después de las primeras experiencias en la mesa, el proceso se estudia en el laboratorio en un biorreactor de hasta 10 litros de capacidad. En este reactor se analizan las variables fisicoquímicas, con vistas a un cambio de escala. Como al aumentar el tamaño del equipamiento se altera la relación superficie/volumen, las condiciones de operación del fermentador en la planta piloto deben ajustarse de forma tal que las aproxime a las de un proceso comercial. Si la experiencia en la planta piloto es exitosa, el proceso podrá dimensionarse en un fermentador industrial (Figura 9). La automatización del monitoreo y del control de la fermentación permite que la información relativa a los parámetros físicos y químicos (pH, temperatura, oxígeno, velocidad de agitación, nivel del medio, etc.) sea colectada en línea por sondas y sensores. Para que el proceso se aproxime a las condiciones ideales, la información se analiza comparándola con un modelo previamente establecido. Pero como, por otro lado, el modelo se elabora a partir de la experiencia obtenida en cubas más pequeñas (laboratorio, piloto), los ajustes del cambio de escala son muy complejos. La operación del proceso El proceso fermentativo puede operarse de forma continua o discontinua (por cargas), y ambas formas presentan ventajas e inconvenientes. En un sistema de producción discontinuo, una vez cargado el fermentador con la materia prima y el inóculo correspondientes, la fermentación prosigue hasta agotarse los nutrientes. Una vez concluido el proceso se extrae el producto y, antes de recibir la carga siguiente, se procede a vaciar, limpiar y esterilizar el fermentador. A pesar de haber un tiempo improductivo entre una carga y la siguiente, el sistema puede ser relativamente flexible al permitir el uso del mismo equipamiento para la fabricación de otros productos. Con un riesgo de contaminación relativamente bajo, la producción por cargas es bastante utilizada en la industria farmacéutica. El tiempo improductivo es eliminado en el sistema de producción con118 Capítulo VI. Procesos fermentativos o bioprocesos FIGURA 9. El cambio de escala, del laboratorio a la industria El cambio de escala entre el proceso de laboratorio y el proceso industrial origina varios problemas de índole tecnológica 200 ml - 1.000 ml Bancada Fermentador de laboratorio 1 - 10 litros Fermentador piloto 50 - 200 - 500 litros Fermentador industrial 5.000 - 50.000 - 200.000 litros 5 - 50 - 200 m3 INDUSTRIA LABORATORIO PILOTO tinua, donde la adición de nutrientes y la separación del producto ocurren continuamente a lo largo del proceso. Como el riesgo de contaminación es mayor, el sistema se adapta a los procesos que no exigen asepsia (producción de proteínas microbianas y de alcohol; tratamiento de aguas). Entre el sistema por cargas y el sistema continuo existe un sistema intermedio denominado semicontinuo, en el que periódicamente el producto y parte del medio de cultivo son sustituidos por medio fresco. La recuperación del producto La recuperación del producto representa una fracción considerable del costo de un proceso fermentativo. El producto que es secretado fuera de la célula se dispersa en un volumen grande de agua, y hace necesario separarlo por decantación o filtración. Pero si el producto permanece dentro de las células, habrá que romperlas para extraerlo. 119 Biotecnología El producto se concentra por sedimentación, precipitación, filtración, centrifugación, extracción con solventes, destilación, evaporación del solvente y secado. Si fuera necesario purificarlo, se echará mano de otros procedimientos, como la cristalización y los métodos cromatográficos. Un problema que hay que considerar siempre es el descarte de los residuos de una fermentación porque pueden representar riesgos para el medioambiente (vinaza de la producción de etanol, suero de las industrias lácteas). El crecimiento de biomasa sobre los residuos industriales es una forma de tratamiento que elimina el problema y permite obtener un producto adicional. 5. LOS BIOPROCESOS EN LA INDUSTRIA DE FERTILIZANTES El término biofertilizante se aplica a algunos productos con biomasa microbiana, capaces de favorecer el crecimiento vegetal. Uno de los microorganismos utilizados es Rhizobium, una bacteria simbionte de las raíces de leguminosas que fija el nitrógeno atmosférico, reduciendo la necesidad de aplicar fertilizantes nitrogenados en la labranza. La producción de biofertilizantes o inoculantes agrícolas en América Latina se hizo posible gracias a un sólido soporte tecnológico, originado en universidades e instituciones públicas de investigación agronómica. Actualmente, esta industria, basada en las tecnologías fermentativas clásicas, está representada por numerosas empresas (pequeñas y medianas) en varios países. Entre ellos, Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Cuba, México, Perú y Uruguay. Las cepas bacterianas son líneas seleccionadas por su eficiencia en una amplia gama de cultivos y ampliamente adaptadas a las condiciones locales. La multiplicación de los microorganismos se realiza en etapas sucesivas, utilizando recipientes cada vez más grandes, hasta llegar a biorreactores de 1.500 litros. Una vez recuperados, los microorganismos generalmente se inoculan en turba estéril, se empaquetan, y posteriormente se venden o distribuyen a los agricultores. Según la legislación del Mercosur, durante el plazo de validez del producto, la concentración deberá ser de 108 microorganismos viables por gramo de producto. Con la secuenciación del genoma de microorganismos como Rhizobium etl, (México) y Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), la biotecnología moderna comenzará a insertarse en este campo. 120 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos 1. LA MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS La reproducción asexual permite obtener un gran número de plántulas a partir de una única planta (Figura 1). Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos (gladiolo), rizomas (helechos), tubérculos (papa), tallos (banana), raíces (batata, manzana, mora), hojas (begonia, sansevieria o lengua de suegra), estacas (vides), etc. Las plantas que resultan de la propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta madre e idénticas entre sí. En otras palabras, son clones. La capacidad de una célula de regenerar réplicas del organismo del cual deriva se denomina totipotencia. Esta propiedad es característica de las plantas pero no de los animales. Según las condiciones fisiológicas y ambientales, las células vegetales se orientan hacia diferentes vías metabólicas. La totipotencia permite la supervivencia de las plantas superiores, luego del ataque de herbívoros, plagas y patógenos o en condiciones ambientales desfavorables. Si bien los primeros intentos de cultivo de tejidos vegetales datan de 1902, la primera experiencia exitosa fue la germinación in vitro de semillas de orquídea (Knudson, 1922). Transferidas asépticamente al medio de cultivo e incubadas en condiciones favorables, las semillas, y más tarde las plántulas, se mantuvieron protegidas del ataque de hongos y bacterias. Con algunas variaciones, el método aún es utilizado por numerosos floricultores, ya que las posibilidades de supervivencia de las plántulas de orquídea después de la germinación in vivo son muy bajas. Ello se debe al tamaño minúsculo de las semillas y a la ausencia de reservas nutritivas. Las etapas necesarias A diferencia de las experiencias anteriores, la micropropagación se inicia a partir de explantos, es decir, pequeños fragmentos de tejido extraídos de diversas partes de la planta, tales como hojas, raíces, segmentos nodales y yemas axilares, florales y apicales (Figura 1). Los explantos se cultivan asépti121 Biotecnología FIGURA 1. Morfología de una planta angiosperma Yema apical (terminal) Hoja Limbo Pecíolo Yema axilar (lateral) Tallo Tejido vascular Raíz central Raíz lateral camente en medios de composición adecuada, posibilitando la regeneración directa de la planta. El proceso comprende cuatro etapas. Etapa 1: establecimiento de un cultivo aséptico. Una vez retirados de la planta madre, los explantos se desinfectan con un agente químico, generalmente hipoclorito de sodio, que se retira más tarde por lavado. Los explantos se transfieren al medio de cultivo en condiciones asépticas similares a las utilizadas para el cultivo de microorganismos (Figura 2). La incubación se realiza a una temperatura entre 23 y 28 °C, recibiendo luz durante 12 a 14 horas diarias. Etapa 2: multiplicación. Los propágulos que se desarrollaron se transfieren a un medio de multiplicación, obteniéndose numerosos subcultivos (Figura 3). Etapa 3: preparación de las plántulas para la transferencia al suelo. Las plántulas pasan del medio de multiplicación a un medio de enraizamiento donde, además de desarrollar raíces, adquieren vigor y comienzan la fotosíntesis. 122 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos FIGURA 2. Obtención de un cultivo aséptico en el laboratorio Separación de los explantos Esterilización Lavados Disección y siembra Incubación Agua + detergente + hipoclorito de sodio u otro agente químico Agua estéril Condiciones asépticas 20 - 25 oC, a la luz FIGURA 3. Micropropagación, por multiplicación de explantos nodales l P anta madre Etapa 4: aclimatación. Transferencia de las plantas, primero al suelo o a algún otro sustrato y más tarde a un invernadero. Protegidas de la luz solar directa, aumentarán su capacidad fotosintética adaptándose lentamente a las condiciones ambientales. La capacidad de regeneración es mayor en las plantas herbáceas que en las leñosas, distribuyéndose en forma desigual entre algunas familias (solanáceas, crucíferas, gesneriáceas, compuestas, liliáceas) y géneros. También depende del genotipo y de las condiciones ambientales, disminuyendo con la edad de la planta. El cultivo in vitro tiene la ventaja de ser más rápido, además de ocupar mucho menos espacio que la multiplicación in vivo. Las principales aplica123 Biotecnología ciones se encuentran en el cultivo de plantas ornamentales, de hortalizas y en la silvicultura. Los medios de cultivo El medio de cultivo incluye agua, una fuente de carbono, sustancias inorgánicas (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del crecimiento (Tabla 1). Algunos de los elementos anteriores pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas, más económicas o simples de manipular (agua de coco, jugo de tomate, jugo de naranja). Generalmente, el pH del medio varía entre 5,0 y 6,5. La composición del medio de cultivo depende de las necesidades de cada especie. El crecimiento y la diferenciación celular se controlan modificando la proporción entre las hormonas y reguladores de crecimiento. De un modo general, si la relación citoquininas/auxinas es mayor que 1, se desarrollarán brotes, si es menor, raíces, y si es igual, callos. Las diferentes modalidades El cultivo de meristemas La regeneración de una planta puede ocurrir a partir de un órgano tan pequeño como la yema apical (0,5 a 2 mm). En ella, asociado a los primordios foliares y al tejido subapical, se encuentra un pequeño fragmento (0,01 a 0,3 mm) de meristema, un tejido embrionario a partir del cual se forman todos los otros tejidos de la planta. Por eso, el cultivo de la yema apical puede ser reemplazado por el de meristemas (Figura 4). Una manera de obtener plantas libres de virus y de otros patógenos es asociando el cultivo de meristemas con la termoterapia, que consiste en una incubación a 32-34 0C por un tiempo determinado (geranio, dalia, crisantemo, caña de azúcar, papa, frutilla, alcaucil, etc.). De esta manera se pueden recuperar plantas amenazadas de extinción por la contaminación con un virus y que solo se reproducen naturalmente de forma asexual. Los ejemplos citados en la bibliografía son, como mínimo, impresionantes. Si un tubérculo de ñame (también llamado yame o batata de China) de 100 g produce 25 kg de tubérculos en dos años, por micropropagación producirá 300.000 kg. A partir de una yema apical se pueden obtener 4.000.000 de claveles en un año. 124 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos TABLA 1. Composición del medio de cultivo para células vegetales Componentes Agua destilada Fuente de carbono Características y ejemplos Representa el 95% del medio nutriente Generalmente se utiliza sacarosa. La fuente de carbono es necesaria porque los explantos no son totalmente autotróficos y la fotosíntesis in vitro no suple las necesidades de las células Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción que depende de la planta elegida Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6 (piridoxina), pantotenato de calcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina H (biotina), ácido paraaminobenzoico y vitamina E (tocoferol) Auxinas. Promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, la embriogénesis en suspensiones celulares. Ejemplos: IAA (ácido indol acético), NAA (ácido naftaleno acético), IBA (ácido indol butírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético) Citoquininas. Promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Ejemplos: quinetina, 2iP (2-isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina Otras sustancias. Ejemplos: giberelinas, ácido abcísico, etileno Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona. La tendencia actual en investigación es la de reemplazarlos por medios de composición definida Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros polisacáridos (Gelrite, Phytagel), lana de vidrio, papel de filtro, arena, esponjas de poliestireno Sustancias inorgánicas Vitaminas Hormonas y reguladores del crecimiento Mezclas de sustancias poco definidas Materiales inertes 125 Biotecnología FIGURA 4. El cultivo de meristemas Meristema Yema apical Transferencia a un medio de diferente composición Planta madre Cultivo de meristema Formación de órganos Planta hija La técnica también permite la multiplicación de especies que se reproducen lenta o difícilmente, como las orquídeas, y acelerar la producción de plántulas en aquellas que tienen un ciclo anual o bianual. Otra variante de esta modalidad es el microinjerto, que se aplica a especies forestales (eucalipto) y árboles frutales (cítricos). La técnica genera una productividad alta de plántulas sanas, que se cultivan en poco espacio (más de 1.000 plantas/m2), sin depender de factores climáticos o de la época del año. Desde el punto de vista económico, el costo de estas plántulas es alto, porque el cultivo en medio sólido necesita un trabajo minucioso y una mano de obra especializada. Una manera de reducir los costos es multiplicar los propágulos en biorreactores análogos a los fermentadores microbianos. En este sentido, se prefieren cubas pequeñas de 1 a 5 litros, donde los propágulos permanecen en sistemas de inmersión permanente o temporaria, en lugar del modelo tradicional de palas giratorias que dañan los tejidos y las células. A pesar de los costos, la tecnología es interesante cuando plantea introducir una especie en una región sin contaminación previa o para iniciar la propagación vegetativa con plántulas certificadas para la amplificación posterior de los cultivos. El cultivo de callos El cultivo de callos es el método alternativo para las plantas que pueden propagarse directamente a partir de meristemas. Un callo es una masa de células desdiferenciadas que prolifera de manera irregular a partir de un explanto. Se trata de un tejido de tipo tumoral que se produce in vivo como respuesta a las heridas sufridas por los órganos y tejidos. 126 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos FIGURA 5. Diferentes posibilidades del cultivo de callos Planta madre Explanto Callo Formación de órganos Planta hija Metabolitos secundarios Biorreactor Células Embrioides Semillas artificiales Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede subdividirse cada tres o cuatro semanas, manteniendo indefinidamente las células en un medio nutriente con la misma composición. Si el callo es transferido a medios con una concentración de hormonas diferente, se formarán órganos o embriones, a partir de los cuales podrán regenerarse numerosas plantas (Figura 5). A diferencia de los otros métodos, es decir, de la micropropagación y cultivo de meristemas, en el cultivo de callos la proliferación celular está acompañada por variaciones genéticas e inestabilidad cromosómica (variación somaclonal). Debido a esta variabilidad, el cultivo de callos resulta menos conveniente que el cultivo de meristemas para micropropagación. Sin embargo, su empleo es inevitable en el caso de algunas especies económicamente importantes (cereales, leguminosas, forrajeras, especies forestales y palmeras tropicales). Por otro lado, la variación somaclonal permite la selección de variedades de plantas con propiedades nuevas, tales como la resistencia al estrés, al ataque de insectos, a patógenos, a herbicidas, a concentraciones salinas elevadas y a compuestos químicos (Al, Mn). La variabilidad puede ser aún mayor si se utilizan agentes mutagénicos. 127 Biotecnología El cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores Al disgregar un callo en medio líquido se obtiene una suspensión de células que pueden ser cultivadas en biorreactores industriales especiales para la producción de embrioides o de metabolitos secundarios. Los embrioides son embriones formados a partir de células somáticas, que pueden ser encapsulados en una sustancia gelatinosa que contiene nutrientes y está envuelta por un plástico biodegradable. Estas semillas artificiales se desarrollan normalmente cuando se las siembra en la tierra, por eso una de las aplicaciones es la dispersión desde aviones para la reforestación de regiones de difícil acceso. Los metabolitos secundarios, o compuestos naturales, se consideran productos de química fina, con un alto valor agregado en el mercado. Se trata de alcaloides, glucósidos cardíacos, sustancias antitumorales y antimicrobianas, hormonas esteroides, etc., para la industria farmacéutica, y también de colorantes, edulcorantes y aromas para las industrias de alimentos y cosmética. La posibilidad de reemplazar los métodos tradicionales de extracción o síntesis por la producción a partir del cultivo de suspensiones celulares en biorreactores generó grandes expectativas comerciales. Al comienzo de la década de 1990, varios estudios analizaron las condiciones necesarias para que la síntesis o la bioconversión de compuestos naturales en productos de alto valor agregado resultaran ventajosas. Los cálculos mostraron que si el mercado fuera suficientemente amplio y el valor del producto superara los 500 o 1.000 dólares por kg, la productividad del sistema debería ser, por lo menos, de un gramo de compuesto por litro de cultivo celular, condiciones difíciles de alcanzar. Desde el punto de vista tecnológico, como las células vegetales son grandes (100 µm), sedimentan con facilidad. La tendencia a formar agregados las torna muy sensibles a la ruptura y, siendo baja la velocidad de crecimiento, los riesgos de contaminación aumentan. También existen problemas relacionados con la transferencia de oxígeno. Hay diversos modelos de biorreactores para el cultivo de células vegetales, entre los que se encuentran el tradicional de palas giratorias adaptadas para el cultivo de células vegetales y otros del tipo air-lift o de lecho fluido. El proceso puede ser discontinuo, semicontinuo o continuo. En este último caso se utilizan células inmovilizadas. La elección de la modalidad depende del producto ser intra o extracelular y estar o no asociado al crecimiento celular. 128 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos El cultivo de órganos y especialmente de raíces transformadas (hair roots) ha dado buenos resultados, aunque pocos procesos de este tipo hayan alcanzado un nivel comercial. Entre ellos se destaca la producción de shikonina a partir de raíces (Lithospermum erythrorhizon) por la compañía Mitsui Petrochemical Ind. Ltd.; de gingenósidos (Panax ginseng) y de purpurina (Rubia akane) por Nitto Denko Corp.; y de paclitaxel (Taxos cuspidata), comercializado como Taxol por Phyton Inc., una empresa asociada a BristolMyers Squibb. Se espera que las estrategias para aumentar la producción, combinando ingeniería metabólica y nuevos procesos industriales, puedan llegar a establecer las bases de una agricultura molecular. Por ahora las aplicaciones se restringen a la producción de algunos fármacos y de aditivos para la industria de alimentos (aromatizantes y colorantes). El mejoramiento y la conservación de la biodiversidad vegetal Existen varios tipos de cultivo de tejidos que contribuyen a facilitar la tarea de mejoramiento (Figura 6). El método genético tradicional por autofecundación demora entre ocho y diez años hasta obtener líneas puras (homocigotas) en las que se manifiesten los caracteres recesivos. Este tiempo puede ser reducido a algunos meses mediante el cultivo de anteras, generando plantas haploides (n cromosomas) que, tratadas con colchicina, originan plantas diploides (2n) homocigotas. La digestión enzimática de la pared celular genera protoplastos, en los que se puede introducir material genético foráneo (transformación). También es posible fusionar protoplastos de diferentes cultivares o especies (hibridación somática). La pared celular puede ser regenerada posteriormente en el medio de cultivo. Las plantas resultantes de estas manipulaciones genéticas originan semillas que suelen desarrollarse con dificultad, pero retirando los embriones del resto de la semilla se los recupera por cultivo in vitro. Protoplastos, células, callos, yemas apicales y laterales, meristemas, semillas, embriones somáticos y cigóticos, todos pueden ser congelados en nitrógeno líquido a –196 0C. La criopreservación facilita la conservación de numerosas plantas ornamentales, frutales, oleaginosas, leguminosas, medicinales y aromáticas. Finalmente, cabe destacar la importancia de estas técnicas de cultivo de células y tejidos vegetales en la conservación del germoplasma, tanto de las especies cultivadas como de las especies silvestres. La conservación de la bio129 Biotecnología FIGURA 6. Los diferentes tipos de cultivo de células y tejidos vegetales Constituye una herramienta poderosa para el mejoramiento y la conservación del germoplasma MODALIDADES DEL CULTIVO DE TEJIDOS Y CÉLULAS VEGETALES Cultivo de fragmentos de hojas, tallo o raíces y de yemas apicales, axilares y radiculares Cultivo de meristemas Cultivo de callos Raíces (hair roots) Cultivo de órganos Anteras Cultivo de protoplastos Propagación clonal Plantines sanos Semillas Metabolitos Nuevas variedades Ingeniería artificiales secundarios mejoradas genética Conservación del germoplasma diversidad es importante no solo desde el punto de vista del mejoramiento agronómico, sino también del farmacológico, ya que la mayoría de los medicamentos disponibles contienen principios activos extraídos de plantas. La difusión de la tecnología Las técnicas de cultivo in vitro de plantas fueron rápidamente incorporadas por empresas e instituciones de investigación y desarrollo, porque facilitan el mejoramiento genético de las variedades y, también, porque representan una etapa indispensable en la obtención de una planta transgénica. Como las técnicas son de dominio público, además de relativamente simples y de bajo costo, numerosas empresas de todo el mundo las usan para garantizar la calidad genética y fitosanitaria de los plantines y semillas que comercializan. En Cuba, por ejemplo, el IBP (Instituto de Biotecnología de Plantas) ha desarrollado, junto con otros centros científicos, protocolos para papa, caña de azúcar, plátano, banana, guayaba, ananá, maracuyá, etc. El IBP está asociado a una red de 15 biofábricas con capacidad de producir 60 millones de plántulas in vitro y semillas artificiales. 130 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos Esta tecnología está ampliamente difundida en América Latina donde representa el segundo producto más comercializado de la biotecnología agrícola, con amplia difusión en la olericultura, horti-fruticultura, floricultura y en la propagación de plantas ornamentales, así como en la producción de plantas de interés industrial (caña, café) y plántulas de especies forestales para la industria del papel. 2. EL CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES Manipulación in vitro de las células animales Aunque los primeros estudios datan de 1912, el cultivo de células animales comenzó a desarrollarse exitosamente recién en la década de 1950, cuando H. Eagle consiguió definir los nutrientes necesarios para el crecimiento celular. Básicamente, un medio para el cultivo de células animales incluye agua, sales minerales, aminoácidos, vitaminas, glucosa, suero bovino, de caballo o humano (factores de crecimiento) y antibióticos (para prevenir contaminaciones microbianas). Las células deben aislarse, inocularse y mantenerse asépticamente en condiciones bastante estrictas de temperatura (35 a 37 0C), pH y humedad (Tabla 2). Una de las primeras técnicas desarrolladas es el cultivo de leucocitos, que brinda en pocos días el número adecuado de células para el análisis del cariotipo. Este sirve para detectar las alteraciones cromosómicas estructurales y numéricas que puedan ser la causa de disturbios en el funcionamiento del organismo. Los leucocitos extraídos del paciente se colocan en un medio líquido que induce la división celular. El agregado de colchicina inhibe la formación del huso mitótico, bloqueando la división celular en la metafase. Con un choque hipotónico se provoca la lisis de las células y la liberación de los cromosomas (Figura 7, A). Pero hay otros tipos de células de mamíferos que también se cultivan in vitro. Se pueden multiplicar células aisladas a partir de fibroblastos o de tejido epitelial en la superficie de un soporte inerte (vidrio, plástico, etc.), formando una monocapa. Transfiriendo algunas células a un medio nuevo (“repique”), un cultivo primario genera sucesivos cultivos secundarios (Figura 7, B). A diferencia de los microorganismos que pueden ser repicados indefinidamente, las células animales sufren un tipo de muerte programada (apoptosis) después de aproximadamente unas cincuenta divisiones. Se debe 131 Biotecnología TABLA 2. Composición de un medio de cultivo básico para células animales Componentes Agua Fuente de carbono Sustancias inorgánicas L –aminoácidos Características y ejemplos Desmineralizada, destilada Glucosa NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, 6H2O, NaH2PO4, H2O, NaHCO3 Arginina, cisteína, fenilalanina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptofano, tirosina, valina Biotina, ácido fólico, colina, nicotinamida, ácido pantoténico, piridoxal, riboflavina, tiamina Suero animal de diversos orígenes, inclusive humano Antibióticos (penicilina, estreptomicina) y rojo fenol (pH 7,2-7,4) Vitaminas Mezclas de sustancias poco definidas Otros entonces reiniciar el cultivo a partir de una nueva muestra. Existen algunas excepciones que escapan a esa limitación, como las células tumorales o las células madre, y también los linfocitos B inmortalizados por infección con el virus de Epstein-Barr o por fusión con células de mieloma (hibridomas). Aplicaciones del cultivo in vitro de células de mamíferos En las colecciones de cultivos se encuentran líneas celulares de diversos tipos, conservadas por criopreservación (Tabla 3). El cultivo in vitro de células animales se usa en la fabricación en gran escala de varios productos, tales como vacunas y anticuerpos monoclonales. También es adecuado para la producción de citoquinas (linfoquinas, interferones, eritropoyetina) y de otras proteínas de origen recombinante (factor activador del plasminógeno, por ejemplo) que, por requerir modificaciones postraduccionales complejas, no pueden ser producidas en bacterias o levaduras transformadas. En el momento de pasar de la escala de laboratorio a la escala industrial, hay que tener en cuenta algunas consideraciones. El cultivo de células animales exige un cuidado extremo, además de condiciones muy controladas y de medios de cultivo caros y complejos. Las células son muy frágiles y sensibles 132 Capítulo VII. Cultivo de células y tejidos FIGURA 7. Etapas del cultivo de células de origen animal A. Cultivo de leucocitos para análisis del cariotipo Muestra de sangre con anticoagulante Separación de los leucocitos por centrif ugación Cultivo de los leucocitos d Aición de colch icina y lisis celular i F jación y coloración andeo) b ( b s O ervación y comparación B. El cultivo de células a partir de un fragmento de tejido Suspensión celular Pedazo de tejido Medio de cultivo Repique Disgregación mecánica o enzimática Cultivo primario Cultivo secundario a la ruptura. La demanda de oxígeno es alta y como las células se multiplican lentamente (cada 20 horas aproximadamente), hay que mantener la asepsia durante períodos prolongados. Las concentraciones celulares resultantes son bajas, al igual que la productividad y la rentabilidad del proceso. Mientras algunas células pueden crecer libremente en suspensión, como los linfocitos, otras solo crecen sobre un soporte. En el biorreactor, este problema puede resolverse de diversos modos: mediante el confinamiento de las células dentro de membranas semipermeables, inmovilización en geles y cápsulas o fijación sobre soportes, tales como pequeñas partículas de 100 a 400 µm de vidrio, plástico o dextrina. Los biorreactores pequeños (hasta 15 litros) y los procesos discontinuos presentan menos problemas de contaminación, ya los de mayor tamaño (hasta 1.000 litros) exigen el reemplazo de la agitación mecánica por sistemas de tipo air lift o lecho fluido (capítulo VI) en los que es necesario renovar 133 Biotecnología TABLA 3. Origen y utilización de algunas líneas celulares Células HeLa* MDCK 3T3 Nawalwa WI-38 VERO MRC-5 Origen Carcinoma cervical humano Riñón de perro Tejido conjuntivo de ratón Linfoma humano Pulmón embrionario humano Riñón de mono verde africano Pulmón embrionario humano Aplicaciones Investigación Producción de vacunas veterinarias Técnicas de laboratorio Producción de -interferón Producción de vacunas humanas Producción de vacunas humanas Producción de vacunas humanas * Henrietta Lacks murió a los 31 años de un carcinoma uterino. La línea de células HeLa aislada en ese momento continúa cultivándose desde hace más de 50 años. periódicamente parte del medio para retirar los productos excretados y evitar la apoptosis o muerte celular. En los últimos años, las técnicas de cultivo in vitro de células animales dieron un amplio impulso a la investigación básica y aplicada, a los ensayos de diagnóstico y a las técnicas de fertilización in vitro. También han sido determinantes en la producción de compuestos biológicos (proteínas recombinantes), de tejidos para trasplante y de vacunas para uso humano y veterinario. En los estudios toxicológicos, esta tecnología sustituye, al menos parcialmente, a la experimentación con animales, una actividad que suscita una fuerte resistencia de la sociedad debido a cuestionamientos éticos. Se estima que las ventas de medios de cultivo, sueros y reactivos alcancen un valor de US$ 3,4 mil millones, en 2013. 134 Capítulo VIII. Tecnología del ADN 1. LAS HERRAMIENTAS DISPONIBLES La tecnología del ADN engloba una serie de procedimientos para extraer, cortar, sintetizar, marcar, identificar, amplificar y secuenciar el ADN. Estas técnicas, desarrolladas a lo largo de una década (1985-1995), constituyen en la actualidad un conjunto de herramientas que es utilizado en forma rutinaria en los laboratorios, generalmente en sistemas automatizados especialmente diseñados para efectuar muy rápido un número altísimo de operaciones. La extracción del ADN La extracción del ADN es un procedimiento relativamente simple. De un modo general, la ruptura de paredes y membranas libera el contenido celular, del cual se eliminan el ARN y las proteínas antes de separar el ADN, que precipita con alcohol. Una vez extraído y purificado, el ADN se trata de diversas maneras. Numerosas empresas comercializan diferentes tipos de kits para la extracción de ácidos nucleicos, reemplazando a los protocolos tradicionales por sistemas más fáciles de automatizar. Se estima que el mercado llegará a los US$ 158 mil millones, en 2014. Las nucleasas y las enzimas de restricción Entre las numerosas enzimas utilizadas diariamente en los laboratorios, las nucleasas merecen una atención especial. Estas enzimas rompen las uniones entre los nucleótidos de una cadena de ADN; algunas comienzan por los extremos, eliminándolos de a uno, otras cortan a la molécula por adentro. A este último grupo (endonucleasas) pertenecen las “enzimas de restricción”, que son capaces de cortar el ADN en sitios específicos. Normalmente, las enzimas de restricción son producidas por bacterias, como un arma de defensa contra el ataque de virus (bacteriófagos), ya que al cortar el ADN viral impiden su multiplicación. El ADN bacteriano no 135 Biotecnología es atacado por sus propias enzimas, ya sea porque no posee las secuencias correspondientes o porque las secuencias están camufladas por la adición de grupos metilo. Desde su descubrimiento por Werner Arber en la década de 1960, ya se aislaron centenas de enzimas de restricción. Todas actúan como tijeras químicas que cortan el ADN al reconocer determinadas secuencias de 4 a 8 bases. Por ejemplo, la enzima EcoRI –cuyo nombre deriva de Escherichia coli cepa RY13, primera endonucleasa en ser descubierta– corta el ADN originando dos fragmentos de extremos que sobresalen (protruyentes): Las flechas indican el punto de corte. La secuencia anterior es un palíndromo, es decir, puede leerse de la misma manera en los dos sentidos (5´ a 3´ y 3´ a 5´), de forma análoga a frases como “amor a Roma”. Así como hay enzimas que cortan el ADN, hay otras que pegan los fragmentos (ligasas). La electroforesis del ADN Los fragmentos de ADN que fueron obtenidos con enzimas de restricción pueden ser separados en un gel al cual se aplica un campo eléctrico. Al estar cargados negativamente, los fragmentos de ADN se desplazan hacia el polo positivo a una velocidad que depende del tamaño. Fragmentos menores encuentran menos resistencia y migran más rápido (Figura 1). El poder de separación varía con el tipo de soporte (gel de agarosa o de poliacrilamida) y su concentración, porque esta determina el tamaño del poro. También depende de las características del campo eléctrico aplicado. Los fragmentos de restricción forman bandas que se pueden observar a la luz ultravioleta, después de la tinción con una sustancia fluorescente. Junto con la muestra se siembra en el gel una mezcla de fragmentos de tamaño conocido o “regla molecular”, que sirve como patrón de comparación para estimar el tamaño de las bandas de tamaño desconocido. Una de las primeras aplicaciones de la electroforesis de los fragmentos de restricción fue el estudio de los polimorfismos. Un cambio (mutación) 136 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 1. Electroforesis del ADN A. Sistemas de electroforesis Horizontal Fuente de electricidad Buffer o tampón Marco de plástico Gel Gel Buffer o tampón Electrodo Buffer o tampón Vertical Cátodo Muestra Fuente de electricidad Ánodo B. Formación de las bandas por migración de los fragmentos de restricción en el gel Muestra C. Migración de diferentes muestras de ADN en el gel Muestras de ADN Electrodo Fragmentos más largos Migración Fragmentos de ADN Electrodo Fragmentos más cortos en el sitio de restricción de una molécula de ADN (como por ejemplo, de GAATTC a GAACTC) origina fragmentos de tamaño diferente, denominados RFLP (del inglés, restriction fragment length polymorphisms). Utilizados como marcadores, los RFLP pueden ser estudiados como cualquier gen asociado a un carácter visible o una modificación bioquímica (Figura 2). Hibridización y sondas génicas En determinadas condiciones de temperatura, pH o concentración salina, las hebras de la doble hélice de ADN se separan. La separación es causada por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementa137 Biotecnología FIGURA 2. Polimorfismos de restricción (RFLP) Una mutación puede generar dos alelos diferentes: A1, sin sitio de restricción, y A2, con un sitio de restricción. En la electroforesis, el ADN correspondiente a A1A1 se verá como 1 banda, el de A1A2 como 3 bandas y el de A2A2 como dos bandas A. Polimorfismo de restricción en un fragmento de ADN A1 A1 Caso 1 Homocigota A1 A2 Caso 2 Héterocigota A2 A2 Caso 3 Homocigota B. Perfil de bandas en el gel de electroforesis I II III La flecha indica el sitio de restricción rias. Al volver a las condiciones iniciales, esos enlaces se reestablecen y las hebras se asocian nuevamente. La reacción de hibridización también ocurre entre hebras de ADN o de ARN de diferente origen y tamaño, siempre que tengan algunas secuencias complementarias. En función de esta propiedad se construyen fragmentos de unifilamentares de ADN o ARN de secuencia conocida, marcados con sustancias fluorescentes o radiactivas. Estos fragmentos se usan como sondas para reconocer la presencia de una secuencia complementaria en un cromosoma o en una hebra de ADN (Figura 3). La técnica de Southern En 1975, E. M. Southern describió un método para analizar fragmentos de restricción usando sondas de ADN. Una vez separados por electroforesis, los fragmentos son transferidos a una membrana de nylon o de nitrocelulosa. La hibridización de una sonda radioactiva con su secuencia complementar se registra en una placa o film apropiado (Figura 4). El método, denominado Southern blotting, ha sido utilizado para el diagnóstico de enfermedades genéticas, algunas de las cuales son causadas por mutaciones que al eliminar o crear un sitio de restricción, modifican el patrón de bandas. Fueron diseñados métodos análogos para estudios de ARN (Northern blotting) y de proteínas (Western blotting). En el primer caso la sonda es un fragmento de ácido nucleico, en el segundo un anticuerpo específico. 138 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 3. Hibridización de una sonda con la secuencia complementaria Moléculas de ADN Sonda radiactiva Desnaturalización Hibridización La técnica del Fingerprint Descrita por A. Jeffreys en 1985, la técnica es una variante del método de Southern que está focalizada en las regiones del genoma que no se expresan, donde se acumulan mutaciones que confieren a cada individuo una secuencia única (exceptuando a los gemelos). Muchas de ellas son secuencias repetidas y están dispersas a lo largo del genoma. Esas secuencias se denominan VNTR (del inglés, variable number of tandem repeats) y están repetidas un número variable de veces en cromosomas homólogos. En consecuencia, los fragmentos de restricción correspondientes tendrán un tamaño diferente que será detectado mediante una electroforesis (Figura 5). Al aumentar el número de sondas para el reconocimiento de otros tipos de VNTR, se obtiene un perfil de bandas individual que se parece al código de barras que se usa en el comercio. Así como las impresiones digitales identifican a las personas, las sondas revelan la identidad genética de cada uno de nosotros. El procedimiento, no por casualidad llamado Fingerprint (huella dactilar, en inglés), fue adoptado rápidamente para la investigación de paternidad (o maternidad) y la identificación de las personas, en asuntos policiales o forenses. La síntesis y amplificación del ADN La síntesis de oligonucleótidos de ADN y ARN se realiza actualmente en máquinas automatizadas (sintetizadores) capaces de construir, en pocos minutos, moléculas de hasta 60 pares de bases (Figura 6). Estos oligonucleótidos pueden ser usados como sondas o como cebadores (primers) para amplificar una molécula de ADN (véase un poco más adelante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR). 139 Biotecnología FIGURA 4. Técnica de Southern La sonda identifica la homocigosis de I (sin sitio de restricción) y de III (con un sitio de restricción) y la heterocigosis de II (un cromosoma sin sitio de restricción, el otro con un sitio de restricción) 1. Preparación de los fragmentos de restricción Tres muestras de ADN de diferente origen + Enzima de restricción 2. Electroforesis Se separan los fragmentos de restricción por electroforesis 3. Transferencia Peso Papel absorbente Membrana Gel Desnaturalización el ADN y transferencia de los fragementos de cadena simple a una membrana de nitrocelulosa Papel de filtro para garantizar la hidratación Soporte Buffer 4. Sonda radioactiva Se agrega una sonda radioactiva de cadena simple, complementaria al gen buscado. La sonda hibridiza en el fragmento que tiene la secuencia complementaria 5. Autorradiografía Después de lavar para eliminar el exceso de reactivo, se coloca sobre la membrana una placa sensible a la radioactividad 140 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 5. Polimorfismos de VNTR A. Número de VNTR presentes en el mismo fragmento de restricción, en tres individuos diferentes B. Separación de los fragmentos de restricción en el gel de electroforesis a M rcador aso I(6 C 2) , 7 6 5 aso I(3, C 3) 4 3 aso I(5, C ) 4 2 R T N V Sitio de restricción I I I 1 FIGURA 6. La síntesis de oligonucleótidos Bloqueo Base 2 5’ 3’ Base 2 5’ 5’ Soporte 3’ Se fija el primer nucleótido a un soporte. Se agregan nucleótidos simples bloqueados en el sitio 5’ Base 1 Base 1 5’ Base 1 Base 1 3’ El nucleótido fijo se une al segundo nucleótido (Base 2). El bloqueo en 5’ impide la incorporación de más de un nucleótido 3’ Se retira el bloqueo después de eliminar por lavado los nucleótidos que no se incorporaron a la cadena 3’ Se reinicia el proceso con la incorporación del nucleótido siguiente (Base 3) Base 2 Base 2 Bloqueo Base 3 5’ 3’ 5’ Base 3 Si bien es fácil aislar los ARNr o ARNt debido a que son pequeños, abundantes y están en todas las células, un ARNm debe aislarse de los tejidos donde se expresa. Por ejemplo, el ARNm de la proteína de la seda o fibroína se extrae solo de las glándulas salivales del gusano de la seda. 141 Biotecnología FIGURA 7. Síntesis de ADNc, mediante la transcriptasa reversa ADN (con intrones) ADNc Cadena doble de ADN (sin intrones) Síntesis del ADN complementario Transcripción y procesamiento Degradación del ARN ARNm Transcriptasa reversa ARNm Traducción Cadena de aminoácidos Una enzima de origen viral, la transcriptasa reversa, transcribe la información en el sentido ARN ADN, permitiendo que los virus con un genoma de ARN (como el VIH, por ejemplo) se multipliquen en el hospedador. Como herramienta de laboratorio, la transcriptasa reversa posibilita la fabricación de hebras de ADN complementarias (ADNc) a cualquier molécula de ARN (Figura 7). A diferencia del gen original, no habrá intrones en el ADNc construido a partir del ARN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) es un método que permite obtener millones de copias de ADN en pocas horas (Figura 8). Los elementos necesarios son el ADN que contiene la secuencia que se desea amplificar, los cuatro tipos de desoxinucleótidos (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), una ADN-polimerasa y los primers correspondientes. Estos son pequeños fragmentos sintéticos de ADN, complementarios a los extremos de la secuencia que se quiere amplificar, e indispensables para que la polimerasa comience a sintetizar la cadena de ADN. La clave del proceso es la ADN-polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, que al ser estable a altas temperaturas, le permite a la bacteria sobrevivir en aguas termales. Actualmente, esta enzima se produce por ingeniería genética. En un ciclo que comprende varios cambios de temperatura, las cadenas de ADN se separan y se aparean con los cebadores, permitiendo que la poli142 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 8. Reacción en cadena de la polimerasa Un aparato de PCR puede realizar 25 ciclos en menos de una hora, amplificando 105 veces el fragmento de ADN A. Los elementos necesarios Fragmento de ADN Desoxinucleótidos Enzima Taq ADN-polimerasa Cebadores Los cebadores son fragmentos complementarios a los extremos del segmento que se quiere amplificar y son indispensables para que la polimerasa inicie la síntesis de ADN B. La reacción en cadena de la polimerasa Primer ciclo 95 ºC Molécula original 68 ºC Desnaturalización de la doble cadena Apareamiento de los cebadores con el segmento complementario 72 ºC La polimerasa inicia la síntesis de ADN a partir del cebador Dos copias Segundo ciclo 2 copias Cuatro copias Tercer ciclo Cuatro copias Ocho copias 143 Biotecnología merasa sintetice el resto de la secuencia. Repitiendo el ciclo varias veces se generan en poco tiempo numerosas copias, que pueden usarse en cualquier tipo de análisis (Figura 8). Una de las grandes ventajas de la PCR es que no es necesario aislar previamente el fragmento que se quiere amplificar. Basta con conocer los extremos de la secuencia y elegir los primers adecuados. El procedimiento, que se realiza de forma totalmente automatizada, admite múltiples variantes. La empresa Cetus le compró a su inventor, K. Mullis, la patente de la PCR por US$ 10.000, vendiéndosela al poco tiempo a Hoffmann-LaRoche por US$ 300 millones. Dado que actualmente es una técnica corriente en cualquier laboratorio de biología molecular, es probable que ninguno de los dos haya hecho un buen negocio. Más tarde, en 1993, K. Mullis recibió el Premio Nobel por su invención. Así como se mencionó para los sintetizadores de oligonucleótidos, una de las claves del éxito de la PCR es el hecho de ser un procedimiento automatizado, que se realiza en aparatos rápidos y eficientes, construidos integrando el conocimiento de la biología molecular, la informática y la electrónica. El éxito de la PCR se debe también a su extraordinaria versatilidad, que le permite ser empleada con diversos objetivos y en campos tan diferentes como la agricultura, la medicina, la veterinaria, los estudios ambientales, las pruebas de diagnóstico y la medicina forense. Entre sus muchas aplicaciones cabe citar también los estudios antropológicos y evolutivos, tales como la extracción de ADN de momias egipcias, de animales extinguidos como el quagga (un tipo de cebra) o de insectos atrapados en el ámbar 40.000.000 de años atrás. La secuenciación del ADN Desarrollado por F. Sanger en 1977, la secuenciación de un fragmento de ADN es también un procedimiento de tipo iterativo que se lleva a cabo en aparatos automatizados, capaces de realizar rápidamente el trabajo (Figura 9). Existen hoy secuenciadores capilares automatizados donde un brazo robot coloca el gel en los capilares, agrega el ADN y hace la limpieza, después de realizada la corrida electroforética. En el año 2000 estos secuenciadores permitían el tratamiento de una centena de muestras en cuatro horas, sin exigir más de 15 minutos diarios de atención humana. Las secuencias son almacenadas en gigantescos bancos de datos. Ensamblar la información exige un tratamiento matemático para ordenar las secuencias, completar las lagunas y verificar los datos. Esta etapa se realiza en supercomputadoras. En el auge del estudio del genoma humano, 144 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 9. Secuenciación de un fragmento de ADN El sistema automatizado permite identificar en la corrida electroforética a cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos, generando directamente la secuencia del fragmento secuenciado 1. Preparar numerosas copias del fragmento a estudiar (tamaño aproximado: 500 pares de bases) 5’ 3’ 3’ 5’ 2. Incubar la preparación con las moléculas necesarias para la síntesis de cadenas complementarias y agregar algunos didesoxinucleótidos marcados por fluorescencia con diferentes colores Cebador ADN-polimerasa Desoxinucleótidos Didesoxinucleótidos (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) (ddATP, ddCTP, ddTTP y ddGTP) 3. Iniciar la síntesis de las cadenas complementarias, que será bloqueada cuando en lugar de un desoxinucleótido se incorpore un didesoxinucleótido, ya que este no forma uniones fosfodiéster Síntesis bloqueada debido a la incorporación de ddTP 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 4. Después de varios ciclos tendremos fragmentos de todos los tamaños 5. Los fragmentos se separan por electroforesis. El secuenciador identifica a cada uno por el didesoxinucleótido incorporado y genera la secuencia Fragmentos mayores Migración Secuencia Fragmentos menores 145 Biotecnología una empresa relacionada con Celera (Biosystems Applied) mantenía a sus computadoras funcionando día y noche, llegando a gastar en electricidad un millón de dólares mensuales. El dato impresiona, pero una década después, en 2006, la tecnología ya era 500 veces más veloz. A pesar de haber posibilitado el estudio de numerosos genomas, en esa fecha el método automatizado de Sanger comenzó a ser considerado poco eficiente y comenzó el desarrollo de una nueva generación de tecnologías de secuenciación, más rápidas y baratas. Actualmente, muchas empresas cuentan con tecnologías en diferentes etapas de desarrollo y comercialización (IBM, Oxford Nanopore Technologies, Intelligent Bio-systems, LaserGen Inc. y NABsys) y son varias las plataformas comerciales que coexisten en el mercado (Roche/454, Illumina-Solexa, Life/APG, Helicos Biosciences). Los costos de secuenciación han disminuido enormemente. El precio por secuenciar una megabase (1.000.000 de pares de bases), cayó de 1.598,91 dólares (2004) a 0,12 dólares (2011). En consecuencia, tenemos una avalancha de datos que permite realizar estudios evolutivos innovadores y abre el camino para desvendar las diferencias genéticas que afectan la salud y la enfermedad. Los arrays o matrices Gracias al conocimiento acumulado sobre el genoma humano y de otros organismos, ya es posible estudiar algunos aspectos relacionados con la expresión y la interacción de los genes. El manejo de un volumen enorme de información demanda nuevos avances tecnológicos, entre los cuales se encuentra la construcción de micromatrices de ADN, conocidos como microchips y microarrays. Los microchips y microarrays son pequeñas placas de vidrio, nylon o silicio en las que se fijan centenas de sondas, mediante diferentes tecnologías (robótica, fotolitografía). Las moléculas de la muestra son marcadas con un colorante fluorescente. Al colocar la muestra sobre la placa, algunas moléculas de la muestra hibridizan con las sondas complementarias. Las otras son eliminadas por lavado. Los puntos en que hubo hibridización son identificados por barrido con un rayo láser y un software apropiado para el tratamiento de la información (Figura 10). Las sondas corresponden a secuencias génicas codificadoras de proteínas, o sea a genes que se expresan en la célula. Se excluyen los genes que corresponden al ARNr, a los ARNt, a las secuencias que controlan la expresión y al ADN intergénico. La elección de las secuencias transcriptas, denominadas 146 Capítulo VIII. Tecnología del ADN FIGURA 10. Fundamentos de la tecnología de arrays Si las sondas representaran EST, sabríamos que los genes representados por B7, C2, D4, E10, G8 y H6 están activados. El tamaño de las sondas depende de la tecnología utilizada en la construcción del array. Obsérvese que cada una de las sondas representadas en el esquema corresponde a un conjunto de moléculas iguales Microarray con las sondas (oligonucleótidos de ADN) fijadas a un soporte A partir del ARNm extraído se separa el ADNc, que se marca por fluorescencia Hibridización Eliminación del ADNc marcado que no se apareó con ninguna sonda Barrido (scanner) para detectar qué sondas hibridizaron con el ADNc 147 Biotecnología EST (del inglés, expressed sequence tags), aumenta la probabilidad de identificar a los genes que determinan una respuesta fisiológica o patológica. Actualmente, la tecnología se utiliza con los siguientes objetivos: determinar cuáles genes son activados en un tejido, en un momento del desarrollo o en un estado fisiológico, como el sueño, por ejemplo; comparar las secuencias de dos alelos, uno de ellos normal y el otro asociado a alguna patología; determinar cuál es el medicamento adecuado para un paciente; prever el riesgo de una persona al exponerse a una determinada sustancia. La información necesaria para la construcción de estos arrays está disponible en internet, y hay también varias empresas que los fabrican comercialmente. Algunas estiman que en poco tiempo se podrán construir arrays del tamaño de una moneda que contengan al genoma humano. Los alcances de esta tecnología son difíciles de prever, pero se estima que el mercado anual será de 1.470 millones de dólares en 2012. 2. LA BIOLOGÍA SINTÉTICA Con el desarrollo de las nuevas plataformas tecnológicas surge, en la interface entre la biología y la ingeniería, una nueva disciplina, denominada biología sintética. Eminentemente práctica, su objetivo es diseñar y construir sistemas biológicos simplificados que cumplan funciones determinadas. El punto de partida son moléculas de ADN sintetizadas automáticamente, asociadas entre sí como los ladrillos de un juego Lego, de modo de crear genomas mínimos. En la primera década del siglo XXI fueron sintetizados varios genomas virales (hepatitis C, 2000; poliomielitis, 2002; PhiX174, 2003). En 2010, varios investigadores del J. Craig Venter Institute crearon una bacteria sintética al introducir unidades básicas de ADN de Mycoplasma micoides en una bacteria de la especie Mycoplasma capricolum, y eliminar el genoma de esta última. Denominada Synthia, la bacteria sintética lleva secuencias específicas que confirman su origen artificial y se reproduce normalmente. Varias universidades (Harvard, MIT, etc.) y organizaciones (Biobricks Foundation, DIYBIO, SYNBIO , etc.) están comprometidas con el desarrollo de la biología sintética en beneficio de la humanidad y del planeta. Promueven la creación de una comunidad que comparta valores y normas de trabajo, mediante la difusión libre de protocolos y secuencias biológicas estándar que puedan ser usadas con seguridad como ladrillos básicos. Se espera que la biología sintética traiga mejoras sustanciales en áreas tan diferentes como la medicina, la industria, la energía y el medioambiente. 148 Capítulo IX. Ingeniería genética 1. EL NACIMIENTO DE LA BIOTECNOLOGÍA MODERNA Conocida como “tecnología del ADN recombinante”, la ingeniería genética es también sinónimo de manipulación génica, clonación génica, modificación genética, nueva genética, etcétera. El término “recombinante” se refiere a la recombinación genética, un fenómeno que ocurre normalmente durante la meiosis, como consecuencia del intercambio de fragmentos cromosómicos. La manipulación génica del ADN en el laboratorio permite cortar y unir pequeños pedazos de ADN, pertenecientes o no a individuos de una misma especie. Con la tecnología del ADN recombinante se pueden transferir genes de una especie a otra y obtener combinaciones nuevas, inexistentes en la naturaleza. La tecnología del ADN recombinante es un instrumento valioso para el estudio de los genomas, la producción de proteínas en organismos modificados genéticamente o la generación de organismos transgénicos con propiedades nuevas. Los primeros experimentos La genética y la biología molecular se desarrollaron rápidamente al finalizar la Segunda Guerra Mundial. En un período de 25 años, se esclarecieron temas importantes, como la estructura de los ácidos nucleicos, el código genético, la acción de los agentes mutágenos, la genética de las bacterias y de los virus, la estructura y la síntesis de las proteínas, la regulación de la expresión génica, etcétera. En 1972, en la Universidad de Stanford (California), Paul Berg consiguió asociar el ADN de dos organismos diferentes, formando una molécula mixta de ADN. También en Stanford, Stanley Cohen se había especializado en la biología de los plásmidos microbianos, pequeñas moléculas de ADN circular que llevan algunos genes y son capaces de replicarse de manera autónoma. Y en la Universidad de California (San Francisco), Herbert Boyer aisló la primera enzima de restricción que corta el ADN dejando fragmentos 149 Biotecnología con extremos protruyentes (que sobresalen), una característica que facilita enormemente la tarea de unir los fragmentos. Cohen y Boyer se encontraron en una conferencia científica. La idea de una colaboración entre ambos surgió una noche, frente a la playa de Waikiki, entre sándwiches y cerveza. Al regresar a sus laboratorios en San Francisco, iniciaron las experiencias conjuntas. Boyer disponía de la enzima de restricción EcoRI, Cohen de dos plásmidos, uno de ellos con un gen de resistencia a kanamicina (pSC102) y otro con un gen de resistencia a tetraciclina y un sitio de restricción para EcoRI (pSC101). En la primera experiencia los investigadores abrieron el pSC101 e insertaron fragmentos del pSC102, utilizando la enzima de restricción para cortar y una ligasa para pegar. Luego, introdujeron este plásmido quimérico en la bacteria Escherichia coli. El éxito de la experiencia quedó demostrado con la obtención de clones resistentes a ambos antibióticos (kanamicina y tetraciclina). Boyer y Cohen repitieron la experiencia, pero en vez de insertar ADN bacteriano en el plásmido, colocaron un fragmento de ADN del sapo Xenopus laevis. Aislaron el gen codificador de ARNr del sapo y lo insertaron en el plásmido pSC101. Cuando el plásmido recombinante fue introducido en Escherichia coli, la bacteria comenzó a sintetizar el ARNr de Xenopus (figuras 1 y 2). La extraordinaria novedad del experimento consistió en la transferencia de genes de una especie a otra muy distante en la escala evolutiva, un fenómeno normalmente limitado a una misma especie o a especies muy próximas. Mitos y realidades Las infinitas posibilidades de la tecnología del ADN recombinante despertaron algunos de los antiguos mitos. Por desobedecer a Zeus y entregar el fuego al hombre, Prometeo sufrió el terrible castigo de ser encadenado a una montaña y que le devore el hígado un águila. Como una forma de venganza divina, Pandora abrió la caja de la cual salieron todos los males de la humanidad. En las dos caras de Jano, un rey con el don de ver el pasado y el presente, se representa la ambigüedad de la nueva biotecnología, con sus desafíos y promesas. En 1974, Paul Berg y otros investigadores publicaron una carta en las revistas científicas Science, Nature y Proceedings of the National Academy of Science, alertando a sus colegas sobre los posibles riesgos de la nueva 150 Capítulo IX. Ingeniería genética FIGURA 1. Cortar, pegar y copiar, la experiencia que dio origen a la ingeniería genética A. Preparación de los plásmidos recombinantes Bacterias TR CORTAR Enzimas de restricción pSC101 pSC102 PEGAR Ligasas Bacterias KR B. Transferencia de los plásmidos y selección de los plásmidos recombinantes Bacterias TR KR recombinantes COPIAR O CLONAR Multiplicar Medio de cultivo con tetraciclina y kanamicina Plásmidos recombinantes Bacterias T K S S T: tetraciclina, TS: sensibilidad a la tetraciclina, TR: resistencia a la tetraciclina, K= kanamicina, KS: sensibilidad a la kanamicina, KR: resistencia a la kanamicina, pSC101: plásmido de Stanley Cohen n0 101; pSC102: plásmido de Stanley Cohen n0 102 FIGURA 2. ¿Sapobacter o bactosapo? Al incorporar un plásmido con ADN de Xenopus, la bacteria comienza a sintetizar moléculas de Xenopus. Xenopus ADN de Xenopus Bacteria recombinante Molé culas de Xenopus 151 Biotecnología tecnología y pidiendo una moratoria para los experimentos que se realizaran con ella, hasta que fueran establecidos los cuidados y salvaguardas necesarios. Después de considerar que “el uso de esta tecnología presenta riesgos potenciales, ya que si no existieran los controles adecuados podrían introducirse en el ambiente nuevos tipos de organismos, algunos de ellos potencialmente peligrosos”, la organización de los National Institutes of Health (NIH, Institutos Nacionales de la Salud de Estados Unidos) formó el Recombinant DNA Advisory Committee (RAC, Comité asesor sobre el ADN recombinante). En 1975, la conferencia de Asilomar (Monterrey, California), que reunió a 139 investigadores de 17 países, clasificó los experimentos en función de su riesgo (bajo, medio o alto), determinando que no debían realizarse experimentos de alto riesgo mientras no se establecieran las formas de contención adecuadas, tanto físicas como biológicas. Enfatizó también la necesidad de trabajar con microorganismos debilitados, incapaces de sobrevivir fuera del laboratorio. En 1976, el RAC publicó un conjunto de normas de trabajo que, además de ser revisadas periódicamente, deben ser seguidas por todos los investigadores y las instituciones que reciban dinero del NIH para proyectos con ADN recombinante. A partir de los trabajos publicados en 1973, la Universidad de Stanford y la Universidad de California en San Francisco obtuvieron una patente. ¿Cuál fue el invento patentado? El proceso consiste en insertar un ADN foráneo en un plásmido bacteriano que, al ser introducido en una bacteria, la transforma en una fábrica capaz de reproducir ese gen en cantidades ilimitadas. Los detentores de la patente han licenciado el uso de la tecnología a más de 400 empresas, entre ellas Amgen, Eli Lilly, Genentech, Johnson & Johnson y Schering Plough. En esta breve recapitulación del nacimiento de la biotecnología moderna, vale destacar la preocupación mostrada por los investigadores y las instituciones científicas involucradas con la seguridad de los experimentos. No hay en la historia de la ciencia o de la tecnología un episodio de responsabilidad colectiva comparable al de la Conferencia de Asilomar. Paralelamente a su explotación comercial, la tecnología del ADN recombinante se utiliza en la actualidad en centenares de laboratorios de universidades e institutos de investigación. Y treinta años después no hay registro o relato de ningún accidente relacionado con la tecnología del ADN recombinante. Tal vez valga la pena recordar que Prometeo fue liberado después de 30 años, y que en el fondo de la caja de Pandora estaba la esperanza. 152 Capítulo IX. Ingeniería genética 2. LAS BIBLIOTECAS DE GENES El tamaño de un genoma dificulta tanto el mapeo como la localización de un gen. Pero es posible cortar el ADN de un organismo, insertar los fragmentos en plásmidos e introducir esos plásmidos en bacterias. El conjunto de clones formado representa al genoma entero de un organismo y constituye lo que se llama una biblioteca genómica (Figura 3). Como una buena parte del ADN no tiene genes, un método alternativo consiste en organizar una biblioteca que incluya exclusivamente los genes que se expresan, o sea, los genes que son transcriptos y traducidos en un lugar o momento dado. Con los ARNm y una transcriptasa reversa se construyen moléculas de ARNc y se las introduce en los plásmidos. Con este procedimiento, obviamente, el número de clones bacterianos en la biblioteca es menor. En realidad, el número de clones depende no solo del número de genes, sino también del tamaño del fragmento que puede cargar el vector. Como los plásmidos bacterianos y el bacteriófago únicamente transportan fragmentos pequeños de ADN (10 a 20 kpb), fueron diseñados otros vectores capaces de contener insertos más grandes: cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC o yeast artificial chromosomes) y bacterianos (BAC o bacterial artificial chromosomes). La construcción de bibliotecas representa el primer paso para mapear un genoma. Después de secuenciar los fragmentos comienza la etapa del ensamblado de la información en la que se alinean las secuencias, se completan las lagunas y se verifican los datos. El tratamiento matemático de la información demanda algoritmos sofisticados y computadoras poderosas. Una vez organizada la secuencia, se la almacena en bancos de datos. En muchos casos se tiene acceso a la secuencia a través de internet mediante programas especializados que acumulan un enorme número de datos. 3. LA CONSTRUCCIÓN DE UN MICROORGANISMO RECOMBINANTE La primera proteína de origen recombinante fue la hormona de crecimiento, o somatropina. Como la enzima de restricción eliminaba la secuencia correspondiente a los primeros aminoácidos de la molécula, estos debieron agregarse después químicamente, en un proceso muy ingenioso (Figura 4). La transferencia de genes de una especie a otra permite obtener microorganismos que sinteticen alguna sustancia diferente, generalmente 153 Biotecnología FIGURA 3. Construcción de bibliotecas genómicas y de ADNc El rastreo de los clones puede hacerse reconociendo la presencia de secuencias características en el ADN (STS, o Sequence Tagged Site; EST, o Expressed Sequence Tagged) como si fueran etiquetas de identificación BIBLIOTECA GENÓMICA Contiene todas las secuencias del genoma BIBLIOTECA GÉNICA Contiene solamente las secuencias que codifican proteínas Extracción del ADN Extracción del ARNm Digestión con enzimas de restricción Transcriptasa reversa Síntesis del ADNc Inserción en un vector Inserción en un vector Plásmidos Incorporación del vector en la célula hospedadora (transformación) Plásmidos Incorporación del vector en la célula hospedadora (transformación) Bacterias Bacterias Multiplicación y selección de las células transformadas Caracterización de los clones Cuando el gen no se expresa en la bacteria transformada Cuando el gen se expresa en la bacteria transformada Mediante sondas génicas Mediante anticuerpos específicos para esa proteína 154 Capítulo IX. Ingeniería genética FIGURA 4. Producción de la hormona de crecimiento (somatropina) por ingeniería genética La señal de inicio de la transcripción es eliminada con la enzima de restricción Hae III, que remueve también 72 bases que codifican los primeros 24 aminoácidos de la molécula ADNc de la hormona de crecimiento Fragmento de ADN sintético con las 72 bases correspondientes a los primeros 24 aminoácidos de la hormona de crecimiento Unión de los dos fragmentos de ADN Inserción en un plásmido Plásmido recombinante Transformación Las bacterias transcriben y traducen el gen Hormona de crecimiento pensando en un cultivo a gran escala. De un modo general, el gen de interés siempre es seleccionado y estudiado utilizando como sistema de clonado a la bacteria de laboratorio Escherichia coli. Una vez concluida esa etapa se lo podrá transferir a la especie donde se irá a producir la proteína correspondiente. Además de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, existen varios otros microorganismos bien estudiados, entre bacterias y hongos, que pueden ser usados como hospedadores: Bacillus subtilis, Picchia pastoris, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, etc. Estos microorganismos se utilizan en la producción de fármacos (insulina, hormona de crecimiento, vacunas) o de enzimas (quimosina), y en la degradación de contaminantes. 155 Biotecnología Encontrar el gen En general, encontrar un gen es algo así como buscar una aguja en un pajar. Para localizarlo habrá que rastrear una biblioteca genómica o de ADNc. Pero si esta no existiera, su construcción será el primer paso para hallar el gen de interés. La segunda dificultad está en obtener numerosas copias del gen. Una manera de hacerlo es multiplicar el clon correspondiente de la biblioteca. Otra es amplificar el gen por PCR, a condición de conocer las secuencias de los extremos del gen o de las que lo flanquean en el genoma. Si las secuencias conocidas son relativamente cortas, se pueden construir oligonucleótidos y asociarlos, formando un gen sintético que podrá ser amplificado por PCR. Existen numerosas estrategias que dependen de cada caso en particular y, también, de las características y posibilidades del laboratorio (Figura 5). Transferir el gen Independientemente del camino seguido para obtener las copias del gen, estas copias tendrán que ser transferidas, mediante un vector, a un hospedador definitivo que produzca la proteína correspondiente. Un vector es una molécula de ADN que se multiplica de manera autónoma dentro de una célula. Contiene varios genes, algunos de los cuales son marcadores que permiten reconocer su presencia dentro de la célula. El fragmento de ADN foráneo será insertado en el vector, para que se replique junto con él o se integre en el genoma. Construidos según las necesidades, existen hoy vectores bacterianos, de levaduras y bifuncionales, que pueden ser utilizados tanto en bacterias como en levaduras. Además de los plásmidos (bacterianos y de levaduras) y los bacteriófagos (, M13), también se utilizan como vectores los transposones, que son elementos genéticos móviles capaces de saltar de un lugar a otro del genoma, desparramando o no copias del gen. Las primeras experiencias de ingeniería genética se hicieron en la bacteria Escherichia coli, un microorganismo muy bien conocido y fácil de cultivar en el laboratorio. Sin embargo, Escherichia coli no es el organismo ideal para la expresión de genes eucarióticos, porque las células procariotas difieren de las eucariotas en el procesamiento del ARNm y en las modificaciones sufridas por las proteínas después de la traducción. Por eso, para la expresión de genes de mamíferos, Escherichia coli ha sido reemplazada por otras células eucariotas, como la levadura Saccharomyces cerevisiae (un hongo empleado 156 Capítulo IX. Ingeniería genética FIGURA 5. Algunas de las posibles estrategias de clonado Biblioteca genómica (ADN) Biblioteca génica (ADNc) Síntesis in vitro Identificación del gen con las secuencias que se buscan Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Clonado o subclonado del gen aislado en Escherichia coli Transferencia a células de otro organismo para expresión desde hace siglos para la producción de alimentos y bebidas) y las células de mamíferos. Para que un gen se exprese en una célula hospedadora es necesario que esta reconozca sus señales de expresión. La célula deberá leer la secuencia codificante reconociendo las señales para la transcripción (promotor) y la traducción (sitio de unión a los ribosomas e “inicio y final” de la traducción). Lo ideal es construir un vector que además de contener sitios de restricción y un gen marcador de selección, también tenga una secuencia promotora y las señales adecuadas para iniciar y terminar la traducción. Al insertar en este vector la secuencia codificante, el vector funciona como un casete de expresión (Figura 6). Otros factores adicionales son considerados en la construcción de un vector de expresión. Un promotor fuerte permitirá sintetizar una gran cantidad de proteína, una propiedad interesante desde el punto de vista comercial si el producto fuera una enzima. Pero si la proteína en cuestión fuera una toxina que pudiera afectar al hospedador, sería mejor elegir un promotor débil. Una posibilidad interesante es la utilización de un promotor que responda a un factor externo controlable (sustrato, temperatura), de manera tal que el gen pueda encenderse o apagarse en el momento conveniente. También debe considerarse en la construcción del vector, cuál será el destino de la proteína sintetizada. Para que sea excretada habrá que acoplar en la construcción una señal que la transporte fuera de la célula. Existen diversos métodos para introducir el ADN recombinante en la célula. Algunas manipulaciones facilitan la entrada del ADN, como la adición de cloruro de calcio (CaCl2) al medio y la modificación de la tempera157 Biotecnología FIGURA 6. Estructura de un vector de expresión Debe incluir los elementos genéticos de la célula hospedadora para la transcripción y traducción Origen de replicación ARNm Promotor Señales para el inicio de la traducción Señales para la finalización de la traducción Gen foráneo tura. La aplicación de pulsos eléctricos también facilita la entrada del ADN a la célula, al abrir poros en la membrana (electroporación). Los plásmidos atraviesan la membrana celular en un proceso denominado transformación, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas de la célula hospedadora. En el caso de vectores virales, la infección promueve la entrada del ADN foráneo dentro de la célula. También puede introducirse solo el ADN del virus (vector viral desnudo) y luego recuperar partículas virales completas dentro de la célula. En este caso no se habla de transformación sino de transfección (transformación + infección). Este término se usa también para la introducción de cualquier ADN foráneo en las células eucariotas. Identificar a los microorganismos recombinantes La tecnología del ADN recombinante se basa en fenómenos que ocurren en frecuencias muy bajas. La existencia de métodos de selección eficientes permite la detección y recuperación de las células que incorporaron al gen foráneo. Una posibilidad es asociar el gen a un marcador de selección como, por ejemplo, un gen de resistencia a algún antibiótico. En su presencia, solo se multiplicarán y formarán clones o colonias las células que hayan incorporado ambos genes. Sin embargo, el uso de genes de resistencia a 158 Capítulo IX. Ingeniería genética antibióticos es considerado polémico, porque existe una posibilidad remota de que estos genes pasen de las bacterias transformadas a las bacterias del ambiente. También se pueden usar como marcadores de selección genes relacionados con la síntesis de aminoácidos. Hay genes que si bien no son marcadores de selección, permiten identificar a las células transformadas. Son particularmente útiles para identificar a las células transformadas en una monocapa de células o en un tejido. Entre estos genes, llamados “reporteros”, se destacan: GAL, gen de la -galactosidasa, una enzima que transforma el sustrato X-gal en una sustancia azul. GUS, gen de la glucuronidasa que también forma un compuesto coloreado. GFP, gen proveniente de la medusa Aequorea victoria, que sintetiza una proteína fluorescente verde brillante a la luz ultravioleta. LUC, gen de la luciferasa, una enzima de luciérnaga que emite luz en presencia de un sustrato. Hay métodos alternativos que permiten identificar una proteína específica (anticuerpos marcados) o un gen determinado (hibridización con una sonda). 4. LA CONSTRUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Las plantas transgénicas se originan por cultivo in vitro a partir de células vegetales modificadas genéticamente. Su obtención tiene como objetivos el mejoramiento de las propiedades agronómicas y nutritivas de los vegetales y, también, la producción de sustancias nuevas (bio-fábricas). El transgén Para transferir una determinada secuencia génica, hay que construir alrededor una estructura compleja que incluya también un gen marcador, un promotor y secuencias iniciales y terminales de lectura. El transgén es el conjunto formado por la secuencia génica y la estructura que la acompaña. La función del promotor es desencadenar la transcripción de la secuencia génica que interesa. Algunos promotores permiten la expresión de un gen 159 Biotecnología en la mayoría de los tejidos y a lo largo de toda la vida de la planta, otros son más específicos, funcionando como una llave que los “enciende” o “apaga” en determinados tejidos o en respuesta a estímulos ambientales internos o externos. El gen marcador confiere resistencia a sustancias como los antibióticos o los herbicidas, que normalmente son tóxicos para las células vegetales. Por consiguiente, en un medio selectivo solo sobreviven las células que integraron el transgén. Transferencia de genes a células vegetales Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que lleva un plásmido denominado Ti (del inglés, tumour-inducing plasmid). En la naturaleza, las plantas dicotiledóneas infectadas por este plásmido desarrollan agallas o tumores característicos (agalla de la corona o crown gall). Si se eliminan algunos genes en la región T del plásmido Ti, este pierde la capacidad de inducir tumores, pero conserva la de insertarse en el cromosoma de la célula hospedadora. Esta característica lo transforma en un vector valioso para transferir genes foráneos a las células vegetales. El transgén es colocado en la región T del plásmido “desarmado”, junto con un gen de resistencia a antibiótico. El plásmido recombinante será transferido nuevamente a Agrobacterium o introducido directamente en las células vegetales donde, al insertarse la región T en el cromosoma, se integrará también la construcción génica (Figura 7). La transformación se realiza en protoplastos, es decir células en las cuales la pared celular fue eliminada con enzimas. Una forma de aumentar la probabilidad de entrada del ADN foráneo es por electroporación de los protoplastos. Otra es el tratamiento con una sustancia que desestabiliza la membrana plasmática (polietilenglicol o PEG). Un método que también está muy difundido actualmente es la biolística. Con un revólver especial (gene gun) se disparan microproyectiles de oro o tungsteno recubiertos de ADN en dirección a las células. El procedimiento permite la entrada del ADN foráneo en el núcleo y, también, en las mitocondrias y los cloroplastos. El problema de los marcadores de selección Una construcción genética incluye varios elementos: la secuencia codificante, un promotor y un gen marcador de selección. Los marcadores de selec160 Capítulo IX. Ingeniería genética FIGURA 7. Construcción de una planta transgénica ADN foráneo Plásmido Ti Plásmido Ti “desarmado” Plásmido recombinante Transformación de los discos foliares que flotan en el medio con el plásmido Planta que será manipulada genéticamente Cultivo de callos Regeneración de la planta con el gen foráneo integrado en su genoma ción son generalmente genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas. En un medio con alguna de esas sustancias solo se multiplicarán las células que integraron el ADN foráneo, dando origen a callos con los cuales se podrá regenerar a las plantas enteras. El uso de marcadores de resistencia a antibióticos en la construcción de plantas transgénicas ha sido muy cuestionado, a pesar de tratarse de antibióticos sin uso clínico y para los cuales las bacterias del intestino ya tienen genes de resistencia. Estos marcadores pueden ser reemplazados por otros, pero como su utilidad se limita al proceso de transformación, es mejor eliminarlos una vez cumplida su función. Ya han sido desarrolladas varias técnicas para remover los marcadores y es probable que en los próximos años se convierta en una práctica corriente de laboratorio. 161 Biotecnología Del laboratorio al campo La construcción de una planta transgénica comienza con el aislamiento y caracterización del gen de interés. Este gen deberá estar acompañado por una construcción genética compleja, que se transfiere a las células receptoras por alguno de los métodos disponibles (generalmente electroporación, biolística o vectores, como el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens). Luego se seleccionan y recuperan las células transformadas y, por técnicas de cultivo in vitro, se regeneran las plantas correspondientes (Tabla 1). Usando técnicas bioquímicas o moleculares (polimorfismos en la molécula de ADN, repetición de secuencias) se verifica la incorporación del gen, así como el número de copias y el lugar del genoma en que se integraron (aspectos que pueden influir en la expresión génica). Se considera que la transformación fue exitosa si el transgén se expresa en el tejido correspondiente y con buenos niveles de expresión. Sin embargo, aún resta comprobar la estabilidad de la expresión génica y su valor agronómico. Concluida la etapa de laboratorio, comienza una serie de ensayos controlados en el invernadero para conseguir una línea transgénica de alto rendimiento, adaptada a un contexto específico. Conceptualmente, estos procedimientos son los mismos que se siguen en el mejoramiento convencional, pero la caracterización de la progenie con marcadores moleculares y las técnicas de cultivo in vitro permiten que se realicen mucho más rápido. El paso siguiente es un plan de liberación del cultivo al medioambiente, primero con ensayos confinados en invernadero y después en el campo, en diferentes escalas, hasta que la nueva variedad transgénica esté lista para su cultivo comercial. La liberación del cultivo dependerá del marco regulatorio local, generalmente muy estricto. 5. CÉLULAS Y ANIMALES TRANSGÉNICOS La transferencia de genes a células animales Uno de los objetivos de la ingeniería genética es la producción de proteínas recombinantes en cultivos celulares. En relación a los microorganismos, las células animales tienen la ventaja de poseer todos los mecanismos de transcripción y procesamiento de las proteínas, que son indispensables para la expresión de los genes de organismos superiores. 162 Capítulo IX. Ingeniería genética TABLA 1. Las etapas en la construcción de una planta transgénica Laboratorio Transformación por ingeniería genética Regeneración de la planta, mediante técnicas de cultivo de tejidos Caracterización molecular y bioquímica Evaluación del valor agronómico Mejoramiento genético, mediante cruzamientos con cultivos élite Obtención de una variedad transformada genéticamente Experimentos y ensayos de campo, en pequeña y gran escala Autorización de la legislación local Liberación del cultivo para su explotación comercial Invernadero Plan de liberación del cultivo al medioambiente El método más difundido actualmente para facilitar la entrada del ADN foráneo en las células animales es la electroporación. No es el único, existen otros como la ingestión de micropartículas, formadas por precipitación del ADN con fosfato de calcio. Las partículas son transportadas hasta el núcleo, donde el ADN puede ser transcripto por algunos días. En menos del 0,1% de las células, el ADN se integra de manera estable en el genoma, originando una línea genéticamente modificada (como es un evento muy poco probable, estas células se seleccionan usando un marcador de selección apropiado). El ADN también puede colocarse en liposomas, vesículas formadas por una bicapa lipídica que liberan su contenido en la célula al fusionarse con la membrana plasmática. También es posible trabajar con vectores virales en los que se eliminaron las secuencias patogénicas. Los virus animales tienen la ventaja de infectar tejidos específicos y, en el caso de los retrovirus, pueden integrarse al genoma de la célula hospedadora de manera estable. En mamíferos, los virus usados con mayor frecuencia como vectores son el SV40, el vaccinia, los retrovirus y los adenovirus. Células de insecto son infectadas con vectores basados en los elementos P transponibles de Drosophila o en el baculovirus, a condición de eliminar previamente el gen que permite su proliferación en la naturaleza. En relación a la transferencia de genes a células animales, cabe destacar que, a pesar de tratarse técnicamente de una “transformación”, el término utilizado es “transfección”, ya que en esta área se designa como “transformación” a la conversión de una célula normal en maligna. 163 Biotecnología Así como se mencionó anteriormente para microorganismos y plantas, el transgén se coloca en una construcción génica bien definida. Esta incluye un gen marcador de selección como, por ejemplo, genes con resistencia a antibióticos, genes para características metabólicas (TK o timidina quinasa), secuencias repetitivas (Alu), etcétera. Para conseguir que la construcción genética se integre en un lugar del genoma en particular, se colocan en las extremidades secuencias ADN homólogas a los extremos del segmento que se quiere reemplazar. ¿Cómo se distingue la integración en el lugar deseado (por recombinación homóloga) de la integración ocurrida en cualquier otro lado? Agregándole a la construcción, un poco más lejos de las secuencias homólogas, un gen de “selección negativa”. Si la célula lo integra, se vuelve sensible a un segundo antibiótico. Pero si es resistente es porque no incorporó ese segundo gen selectivo y, por lo tanto, la integración ocurrió en el lugar deseado. Los animales transgénicos La mayor parte de los animales transgénicos fueron obtenidos por microinyección, una técnica con alto número de fracasos. Aunque el procedimiento está actualmente automatizado, todavía tiene algunos inconvenientes. El mayor riesgo es la incorporación de un número variable de copias en cualquier lugar del ADN de la célula receptora, interrumpiendo tal vez la expresión de otros genes o alterando su funcionamiento; un fenómeno que solo será evidenciado en la siguiente generación. Los primeros experimentos de construcción de un animal transgénico datan de 1983 y originaron un ratón con el gen de la hormona de crecimiento de rata (Figura 8). Para construir este animal, primero se preparó un vector con el gen de la hormona de crecimiento y un promotor que respondiera a la presencia de cadmio en el ambiente. A continuación, se inyectó el vector, con una aguja microscópica, en uno de los dos pronúcleos de un óvulo fecundado. Se implantó el cigoto en una hembra receptora y luego se indujo la síntesis de la hormona de crecimiento en la descendencia. Algunos ratones incorporaron el gen, alcanzando más tarde el tamaño de una rata (supermouse). Otra aplicación interesante es la construcción de modelos animales para el estudio de enfermedades humanas. Es posible inactivar genes de células madre en cultivo, las que luego se transfieren a blastocistos. Reimplantados, estos originan animales quiméricos, es decir, que tienen células en las que el gen está activo y otras en las que no. De los cruzamientos entre quimeras 164 Capítulo IX. Ingeniería genética FIGURA 8. Construcción de animales transgénicos por microinyección Después de la transfección, se implantan los óvulos en hembras receptoras (seudopreñadas). Los que incorporaron el transgén originarán, en este caso, animales más grandes (supermouse) Cruzamiento Microinyección del ADN foráneo Descendencia Óvulos fecundados Implantación en hembras seudopreñadas cuyas células germinales llevan el gen inactivado, nacen animales homocigotas para este gen (Figura 9). Esta estrategia se utiliza tanto para construir modelos animales con un gen inactivo (knock out), como para insertar un gen activo (knock in). Así se obtuvieron ratones transgénicos para genes que determinan algunas enfermedades humanas, como cáncer de mama (BRCA 1), enfermedad de Huntington, anemia falciforme, etc. Estos animales son buenos modelos en la investigación farmacológica. Los rebaños farmacéuticos Algunas proteínas terapéuticas (somatropina, insulina) se obtienen actualmente mediante el cultivo de células recombinantes (células animales o bacterianas, levaduras). Sin embargo, es probable que en un futuro próximo estos sistemas biológicos sean reemplazados por animales mamíferos transgénicos. La modificación de las técnicas de producción resulta muy interesante para la industria farmacéutica, porque elimina ciertas dificultades inherentes a la operación de los bioprocesos y a la purificación de los productos. A pesar del alto valor de la inversión inicial, bastan unos pocos animales para obtener una gran cantidad de proteína recombinante, abaratando el precio. Cuando se quiere producir una proteína recombinante en animales transgénicos (cabras, vacas) suele elegirse un promotor que se exprese en la glándula mamaria, de manera que el producto sea secretado en la leche. Ya existen animales productores de diferentes proteínas recombinantes: factor 165 Biotecnología FIGURA 9. Construcción de un animal transgénico por transfección de células madre embrionarias Mediante la implantación de blastocistos de una hembra agutí (y que contiene células modificadas de ratones de pelaje negro), se obtienen animales “quiméricos”, con células que llevan el carácter para el pelaje marrón y células con el carácter para el pelaje negro. Del cruzamiento entre quimeras nacen algunos animales con el pelaje negro, que además incorporaron el ADN exógeno en su genoma Cruzamiento Transfección y selección de las células Animales quiméricos Descendencia Blastocisto Inyección de las células modificadas en el blastocisto Blastocisto Implantación activador del plasminógeno, lactoferrina, somatropina, insulina. El primer producto liberado comercialmente fue el anticoagulante Atryn (GTC Biotherapeutics, 2009), un medicamento producido en la leche de una cabra transgénica. Un caso interesante es el de Biosidus, una empresa argentina del Grupo de Empresas Farmacéuticas Sidus, que inició las experiencias de clonación de bovinos en 1997. Las dificultades técnicas fueron muchas y hubo varios intentos antes de alcanzar el éxito. Este llegó a partir de 2002 con el nacimiento de Pampa, una vaca de raza Jersey que fue el primer bovino clonado en América Latina. El paso siguiente fue la obtención de un animal que secretara la hormona de crecimiento humana (somatropina) en la leche. Para eso se hizo una construcción genética que incluía el gen de la somatropina y un promotor que permitiera su expresión en la leche. Esta construcción se insertó en fibroblastos fetales obteniéndose, por fusión con óvulos anucleados, embriones que fueron implantados en vacas receptoras. A fines de 2002, nació Pampa Mansa, una vaca clonada y transgénica, que un año más tarde produjo somatropina en la leche. Se estima que bastarían tres animales similares para cubrir la demanda del mercado latinoamericano. A partir de fibroblastos de la oreja de Pampa Mansa se obtuvo una dinastía de vacas, clones de un clon. En 2004, con el nacimiento de Pampero, un 166 Capítulo IX. Ingeniería genética toro transgénico resultante del cruzamiento entre Pampa Mansa y un animal reproductor, la multiplicación de los animales pasó a ser independiente de la clonación. Ahora, el “tambo farmacéutico” está completo. A fines de 2005 Biosidus obtuvo el permiso de las autoridades regulatorias para liberar un número limitado de animales en el ambiente, en condiciones estrictamente controladas. El próximo paso deberá ser la aprobación del producto (la hormona de crecimiento) para uso farmacéutico. El proyecto colocó a Argentina entre los países que dominan esta tecnología: Estados Unidos, Alemania, Francia, Japón, Reino Unido y Australia. Además de la participación pionera de Biosidus, el “tambo farmacéutico” demandó una inversión de US$ 7.000.000, la participación de un equipo multidisciplinario de 40 investigadores y la asesoría del Conicet (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, de la Argentina). Biosidus contempla la ampliación del tambo con otras proteínas terapéuticas (insulina humana, factor activador de plasminógeno). 167 SEGUNDA PARTE BIOTECNOLOGÍA Y SOCIEDAD Capítulo X. Biotecnología, industria y energía 1. EL PROCESO WEIZMANN El proceso Weizmann es considerado un hito en la historia de la biotecnología por ser el primer proceso fermentativo industrial desarrollado en condiciones asépticas. En el transcurso del siglo XIX, el caucho natural se transformó en un material estratégico para el crecimiento de la industria automotriz. C. B. Goodyear descubrió que la vulcanización confiere al caucho elasticidad y resistencia (1839) y J. Dunlop inventó el neumático (1888). Al aumentar el precio (dumping), debido a la disminución de la oferta de caucho natural proveniente de Brasil y de las plantaciones inglesas en Malasia, se desencadenó la carrera por el caucho sintético. Mientras Alemania exploraba la posibilidad de sintetizar caucho a partir de un derivado del petróleo (butadieno), Inglaterra intentaba obtenerlo a partir de un derivado del alcohol isoamílico (isopreno) producido por fermentación. En ese contexto histórico, el químico de origen ruso Chaim Weizmann desarrolló, en la Universidad de Manchester (1914), un proceso fermentativo innovador para producir butanol –que es un precursor del butadieno–, además de acetona, con el uso de la bacteria Clostridium acetobutylicum. El inicio de la Primera Guerra Mundial hizo que Inglaterra abandonara la corrida al caucho para dedicar su atención a la producción de explosivos y especialmente a la cordita, una pólvora a base de nitrocelulosa, en cuya preparación se usa acetona como solvente. La materia prima para la síntesis de acetona era el carbonato de calcio y como este era importado de Alemania, Inglaterra no podía usar la vía química para sintetizar acetona, pero sí la vía biotecnológica desarrollada por Weizmann. Weizmann, que cedió su patente al gobierno británico, fue reclutado por el Comité de Municiones para producir acetona por fermentación microbiana del maíz, en la destilería de gin Nicholson (Londres). Pero debido a la guerra y a la escasez de alimentos, el suplemento de carbohidratos se transformó rápidamente en el factor limitante del sistema. 171 Biotecnología En 1916 los británicos transfirieron la producción a una destilería en Toronto (Canadá) y comenzaron la construcción de otra planta en la India. En 1917, una planta productora de acetona por fermentación del maíz comenzó a funcionar en lndiana (Estados Unidos). Al concluir la guerra, tanto la acetona como el butanol continuaron siendo usados como solventes. Años más tarde, los caminos de la ciencia, de la tecnología y de la política se cruzaron nuevamente. Además de químico, Weizmann era periodista y uno de los principales líderes de la comunidad judía en el movimiento sionista mundial. En 1948, al finalizar el mandato de Gran Bretaña sobre Palestina, Weizmann fue elegido primer presidente del Estado de Israel. El instituto de investigaciones científicas y tecnológicas fundado en Rehovot (Israel) lleva su nombre. El proceso Weizmann está estrechamente ligado a la historia del siglo XX. 2. LA INDUSTRIA QUÍMICA La vía química La industria química se caracteriza por producir sustancias específicas que atienden a las necesidades de otras industrias. Mientras algunas empresas sintetizan los derivados petroquímicos básicos (etileno, propileno, butadieno), otras los transforman en productos finales: polietileno (PE), polipropileno (PP), cloruro de polivinilo (PVC), poliésteres y óxido de etileno. Un tercer grupo convierte esos materiales en objetos de consumo como, por ejemplo, recipientes y otros objetos utilitarios. Las empresas responden a la demanda del mercado, adaptándose rápidamente a cualquier variación de los precios de materia prima y energía. Para subsistir, la industria química tiene que mostrar versatilidad, buscando aplicaciones nuevas y más rentables. Habiendo cambios económicos que reviertan la situación, las aplicaciones descartadas serán empleadas nuevamente. Un ejemplo típico es la evolución del mercado de la acetona. De subproducto de la corrida del caucho, la acetona pasó a ser un producto indispensable para la industria de armamentos durante la Primera Guerra Mundial. Concluido el conflicto, volvió a ser utilizada como solvente en la fabricación de lacas, una función de donde sería desplazada más tarde por otras sustancias. La industria química del siglo XX se basó principalmente en el petróleo y sus derivados. A pesar del alerta en la década de 1970 sobre el riesgo de la dependencia de un recurso no renovable, el petróleo aún resulta suficien172 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía temente barato como para enfrentar la competición con otros procesos. La situación podría cambiar a mediados del siglo XXI, con la disminución o el agotamiento de las reservas mundiales de petróleo. 3. LA VÍA BIOTECNOLÓGICA Para que la vía biotecnológica pueda competir con la sintética, una de las condiciones básicas es que exista, entre el sustrato y el producto final, una ruta metabólica compleja que comprenda varias etapas. De esta manera, resultará más ventajoso utilizar un ser vivo, para realizar toda la secuencia de reacciones, que sintetizar químicamente cada uno de los compuestos intermediarios. La producción de vitamina B2 (BASF) y del antibiótico cefalexina (DSM Life Sciences Products) son dos ejemplos exitosos de sustitución de la síntesis química por la acción microbiana. La vía biotecnológica se fundamenta en la transformación de la biomasa, un recurso barato y renovable. Para sustituir la vía química son necesarios procesos que permitan la obtención de productos, materiales y energía a un costo competitivo y con menos impacto ambiental. Esas condiciones están dadas para numerosas moléculas de interés industrial que pueden ser obtenidas a partir de materias primas como el maíz, los aceites vegetales o la madera (Tabla 1). Desde el punto de vista del conocimiento, la biotecnología industrial se asienta en algunas disciplinas tradicionales, como la microbiología, las fermentaciones y la biocatálisis. Sin embargo, el impacto de la biotecnología moderna (genómica, ingeniería metabólica, ingeniería genética) le ha abierto perspectivas nuevas, en relación al mejoramiento de las cepas microbianas y las variedades vegetales. El uso de organismos genéticamente modificados permite mejorar los procesos productivos y diseñar nuevos productos. En relación a la bioseguridad, cabe señalar que las características metabólicas de las cepas industriales están alteradas de manera tal que solo crecen en condiciones artificiales muy estrictas, siendo incapaces de sobrevivir fuera del laboratorio o de competir, eventualmente, con los microorganismos del ambiente. La opinión pública muestra una actitud neutra o favorable en relación a la biotecnología industrial. En parte porque al ser usados como insumos por otras industrias, sus productos tienen poca visibilidad. Y también porque, al utilizar materias primas renovables y desarrollar procesos menos contaminantes con menor gasto de energía, las biotecnologías ayudan a atenuar la 173 Biotecnología TABLA 1. Diversidad de productos derivados de algunas materias primas renovables Sector Azúcar y almidón Materia prima Caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo sacarino, trigo, maíz, papa, arroz, mandioca, etcétera Canola, soja, coco, girasol, dendé, grasas de origen animal Composición Azúcar, almidón, melaza Aplicaciones Solventes, productos farmacéuticos, adhesivos, resinas, polímeros, selladores, limpiadores, etanol Aceites vegetales Triglicéridos, ácidos grasos, glicerol Surfactantes para jabones y detergentes, ingredientes inactivos para productos farmacéuticos, tintas, pinturas, resinas, cosméticos, ácidos grasos, lubrificantes, materiales de construcción Materiales de construcción, fibras, polímeros, resinas, adhesivos, pinturas, revestimientos, tintas, piche Madera Pino, eucalipto Celulosa, papel y lignina imagen contaminadora de la industria química. No es casual que a la biotecnología industrial se le denomine “biotecnología blanca”. 4. LOS PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS Algunos procesos biotecnológicos generan sustancias en cantidades pequeñas (volumen bajo) que serán vendidas a un precio alto (valor agregado alto). Generalmente se trata de metabolitos secundarios y su producción demanda grandes inversiones, un nivel tecnológico avanzado y mano de obra altamente calificada. En esta categoría, denominada química fina, se clasifican los productos farmacéuticos y agrícolas, algunos aditivos alimentarios, los aminoácidos, las vitaminas y las enzimas. La vía biotecnológica también se aplica a algunas sustancias fabricadas en grandes cantidades (volumen alto), en procesos que demandan inversiones menores y operaciones más simples. Entre estos productos, de valor agregado intermediario, encontramos metabolitos primarios como, por ejemplo, algunos solventes, ácidos orgánicos y polímeros. 174 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía En relación a las sustancias producidas en gran cantidad y con bajo valor agregado, como los biocombustibles líquidos (etanol, biodiesel) y gaseosos (biogás), algunos países todavía mantienen sistemas productivos en pequeña escala, en instalaciones sépticas y con mano de obra no especializada, que no exigen más que equipos simples e inversiones pequeñas. Sin embargo, la eficiencia de esos sistemas productivos es baja, por lo que son sustituidos gradualmente por otros de nivel tecnológico avanzado, administrados por grandes empresas, en emprendimientos económicamente sustentables. Metabolitos de interés comercial En 2010, correspondió a la biotecnología blanca el 9% de las ventas del sector químico, un porcentaje que podría subir rápidamente a 20% si las condiciones fueran favorables. Entre las moléculas de interés comercial se destacan, por su versatilidad, varios metabolitos primarios y secundarios (Tabla 2). Alcoholes y solventes Vimos anteriormente algunos aspectos históricos relacionados con la producción de butanol y acetona por fermentación. Se considera que la inmovilización de microorganismos podría dar un nuevo impulso a la síntesis de solventes aumentando la productividad en 60%. En relación al etanol, 95% es producido actualmente por vía biotecnológica. Ácidos orgánicos La producción de ácido cítrico (4.0 x 105 toneladas/año) se debe casi exclusivamente al cultivo del hongo filamentoso Aspergillus niger, en diversos tipos de procesos fermentativos (cultivo de superficie en medio sólido, cultivo sumergido en medio líquido). El ácido cítrico es utilizado en la industria de alimentos como aditivo (acidulante y antioxidante), en cosmética como regulador del pH y en la industria farmacéutica como anticoagulante y componente de tabletas efervescentes. En relación al ácido acético, los procesos industriales modernos también dependen de la acción bacteriana (géneros Acetobacter, Gluconacetobacter y Gluconobacter). Además de tener muchos usos, el ácido acético es un precursor de varias moléculas intermediarias, como el anhídrido acético y 175 Biotecnología TABLA 2. Metabolitos primarios y secundarios de interés comercial Metabolitos primarios Alcoholes y solventes Ácidos orgánicos Etanol, butanol, acetona, glicerol, manitol Ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, ácido glucónico, ácido itacónico, ácido málico, ácido tartárico, ácido pirúvico, ácido succínico Ácido L-glutámico (monoglutamato de sodio), L-lisina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-carnitina Xantano, dextrano, pululano, gelana, agar, alginatos, carrageninas Ácido guanílico (5’GMP) y ácido inosínico (5’IMP) Vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido L-ascórbico), vitamina B12 (cianocobalamina) -caroteno, astaxantina, ficocianina, monascina Aminoácidos Polisacáridos Nucleótidos e nucleósidos Vitaminas Colorantes Metabolitos secundarios Moléculas para la salud humana y animal Moléculas para la agricultura Moléculas para la industria de alimentos Antibacterianos, antivirales, antifúngicos, antihelmínticos, antitumorales, sueros, inmunoglobulinas, vacunas, inmunosupresores, estatinas, etcétera Insecticidas y pesticidas, factores de crecimiento vegetal Condimentos y aromatizantes para la industria alimentaria los acetatos éster, y de productos como el acetato de celulosa, el celofán, el acetato rayón, etc. También se usa como solvente en la producción de plásticos, caucho sintético, goma, resinas y aceites volátiles. En la industria farmacéutica se usa como acidificante. El ácido láctico es obtenido por fermentación bacteriana (Lactobacillus) o fúngica (Rhizopus oryzae) y es un importante insumo en las industrias de alimentos, fármacos y cosméticos. También es utilizado como monómero en la síntesis del ácido poliláctido (PLA), un polímero biodegradable. El ácido succínico es utilizado por varias industrias (alimentos, fármacos, cosméticos), y también en la producción de plásticos y materiales para 176 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía la industria automotriz. Se trata de otra molécula básica para la síntesis de polímeros, resinas de ABS (acrilo-nitrilo-butadieno), nylon 6.6, solventes, etcétera. Aminoácidos La producción industrial de aminoácidos se destina a la nutrición humana (66%), al enriquecimiento de raciones animales (33%) y, en menor grado, a la industria farmacéutica y cosmética (1%). El método más antiguo de producción es la extracción por hidrólisis de proteínas (soja, cabello). Los otros métodos incluyen síntesis, fermentación y catálisis enzimática. La síntesis química de aminoácidos tiene el inconveniente de generar dos formas isoméricas (acil-D y acil-L), representadas habitualmente como tipo “mano derecha” y tipo “mano izquierda”. Como los organismos vivos solo asimilan los L-aminoácidos, estos deben ser separados de las mezclas originadas químicamente por enzimas estereoespecíficas, inmovilizadas en biorreactores. Los únicos casos en que la separación no es necesaria son el de la glicina, que no tiene las dos formas, y el de la metionina, porque los seres vivos pueden convertir la forma D en L. La vía fermentativa es utilizada para producir varios aminoácidos. La bacteria Corynebacterium glutamicum sintetiza 1,1 millón de toneladas/año de ácido glutámico, que es usado en la cocina oriental como aditivo (glutamato monosódico) para realzar el sabor de los alimentos. El ácido aspártico y la fenilalanina se obtienen por inmovilización conjunta de Escherichia coli y Pseudomonas dacunhae en una columna de fermentación, o por una bacteria genéticamente modificada (Escherichia coli). Ambos aminoácidos son los componentes del edulcorante no calórico Aspartame (15.000 toneladas/año). Otros aminoácidos se emplean como aditivos en alimentos (L-cisteína, 3.000 toneladas/año) o como complemento nutritivo en las raciones animales (L-treonina, 50.000 toneladas/año; L-lisina 550.000 toneladas/año). Por su lado, la industria farmacéutica absorbe 1.000 toneladas/año de L-arginina y 500 toneladas/año de L-valina y L-leucina. Polisacáridos Los polisacáridos de origen microbiano sustituyen parcialmente a los espesantes y gelificantes extraídos de algas marinas. El xantano (20.000 toneladas/año) es un producto de fermentación de la bacteria Xanthomonas campestris que entra 177 Biotecnología en la composición de salsas, flanes, jaleas, helados, dentífricos, etc. Sus propiedades espesantes también son utilizadas en la recuperación del petróleo. Los dextranos (200 toneladas/año) se obtienen por vía fermentativa, a partir de diversos microorganismos. Los de alto peso molecular se utilizan como espesantes en la industria de alimentos, en la preparación de películas protectoras de semillas (industria agrícola) y en la composición de las emulsiones fotográficas. Los de bajo peso molecular se usan como plasma sanguíneo artificial, para mejorar el flujo sanguíneo en casos de traumatismos o cirugía. Vitaminas La mayor parte de las vitaminas son obtenidas industrialmente por vía sintética o extractiva. Sin embargo, la vía fermentativa es ventajosa en el caso de la riboflavina (vitamina B2) y del ácido ascórbico (vitamina C) y la única posible para la cianocobalamina (vitamina B12), una molécula compleja que no es sintetizada naturalmente por animales o vegetales. El -caroteno, un precursor de la vitamina A, es sintetizado por el alga Dunaliella bardawill cultivada al aire libre en grandes tanques de agua salobre, en una región desértica cercana a la costa del Mar Rojo (Israel). Enzimas Algunas enzimas pueden extraerse fácilmente de tejidos u órganos de origen vegetal o animal (Tabla 3). Sin embargo, la producción en gran escala está sujeta a la disponibilidad de tierra, a las fluctuaciones de las cosechas y al sacrificio de los animales. La tendencia es reemplazarlas por otras de origen microbiano, en bioprocesos que garanticen una producción regular y de calidad constante. Diferentes organismos pueden tener enzimas con diferentes propiedades para cumplir la misma función. Un ejemplo de esa versatilidad es la lactasa (- galactosidasa), una enzima que hidroliza la lactosa y puede extraerse de bacterias, levaduras u hongos. Las condiciones óptimas de funcionamiento son, respectivamente, 40 0C, 37 0C y 55-60 0C para la temperatura, y 3,0-4,0, 7,2 y 6,6 para el pH. La elección de una u otra dependerá de las condiciones exigidas por el bioproceso. Si consideramos que recién se está descubriendo la biodiversidad microbiana y el arte de alterar sus vías metabólicas, es muy probable que en un futuro cercano se encuentren enzimas con propiedades diferentes de las conocidas, facilitando el diseño de procesos industriales innovadores. 178 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía TABLA 3. Origen de algunas enzimas Enzimas Amilasas Papaína Ficina Bromelina Pepsina Pancreatina (amilasas, proteasas y lipasas) Renina Catalasa Origen Malta de la cebada Papaya Higo Ananá (piña) Estómago de porcinos Páncreas de porcinos Cuarto estómago de terneros Hígado o sangre de bovinos La optimización de un proceso industrial tiene en cuenta el costo de la materia prima, el tipo de fermentación (sumergida o en medio semisólido) y los controles necesarios para el buen desarrollo del proceso (pH, temperatura). Desde el punto de vista económico, no es conveniente determinar o redimensionar los parámetros de la producción industrial cada vez que se descubre un microorganismo productor de una enzima interesante. Resulta más ventajoso transferir la secuencia codificadora de esa enzima a un microorganismo cuyos requerimientos para el cultivo en condiciones industriales estén bien estudiados, como Escherichia coli, Streptomyces o Bacillus subtilis (bacterias), Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae o Kluyveromyces (levaduras y hongos). Por eso, actualmente, más del 60% de la producción industrial de enzimas se basa en la biotecnología moderna. El costo de una enzima también depende de las dificultades técnicas encontradas en la extracción y la purificación, que son las etapas downstream de un bioproceso. Las enzimas más baratas suelen ser las extracelulares como, por ejemplo, algunas hidrolasas (amilasas, proteasas y celulasas). Las más caras son las enzimas intracelulares, porque requieren métodos de purificación más complejos y son utilizadas como fármacos o en pruebas de diagnóstico. Las enzimas se comercializan como insumos para otras industrias, especialmente las de alimentos, bebidas, raciones, detergentes, analíticas y farmacéuticas. Se estima que en 2013 el mercado global de enzimas podrá alcanzar un valor aproximado anual de 7 mil millones de dólares. Actualmente, el 179 Biotecnología mayor productor es la compañía Novozyme, perteneciente al grupo Novo (Dinamarca), con aproximadamente la mitad del mercado. Esta empresa mantiene en funcionamiento varios fermentadores de 80.000 litros, contabiliza más de 4.000 patentes y dedica casi la totalidad de su presupuesto de investigación y desarrollo a la optimización de los microorganismos, de los productos enzimáticos y de la producción industrial. Biopolímeros y bioplásticos Un plástico se forma por reacción química entre un polímero y un plastificante. Los plásticos tradicionales se sintetizan a partir de polímeros de origen petroquímico y son procesados por extrusión o fusión térmica. Los bioplásticos se sintetizan generalmente a partir de polímeros de origen biológico (celulosa, almidón, aceites vegetales, etc.) o de los formados por polimerización de una molécula básica, como el ácido láctico proveniente de una fuente renovable (maíz) siguiendo la vía fermentativa. Uno de los bioplásticos más versátiles es el ácido poliláctido (PLA), un poliéster formado por polimerización del ácido láctico, que se usa como relleno de almohadas y colchones (NatureWorks), revestimiento de películas y papel (BASF) y embalajes descartables (Ingeo), en empresas como Coca Cola y McDonald’s. También está siendo utilizado en la industria automotriz (Hyundai) y electrónica (Samsung). En el mercado de embalajes de la industria alimentaria, se utilizan los polihidroxialcanoatos (PHA) y el polihidroxibutirato (PHB). Por ser biocompatible, este último tiene también interesantes aplicaciones en el área médica (Biopol). En San Pablo (Brasil), una planta piloto ligada a empresas del sector alcohol-azucarero produce PHB (Biocycle) por fermentación bacteriana de caña de azúcar. Por otro lado, los genes relacionados con la síntesis del PHB y PHA, pertenecientes a las bacterias Alcaligenes eutropus y Ralstonia eutropha, respectivamente, ya fueron transferidos a una bacteria más fácil de cultivar (Escherichia coli) y a una planta (canola). La industria dispone en la actualidad de aproximadamente treinta moléculas esenciales para la construcción de biopolímeros (ácidos carboxílicos, etanol, aminoácidos, triglicéridos, furfural, sorbitol, glicerol, etc.). Estas moléculas son de origen biológico y permiten obtener tanto plásticos innovadores como convencionales, no biodegradables, semejantes a los de origen petroquímico. En esta última categoría se encuadran las resinas de poliuretano sintetizadas a partir de aceite de soja, el poliéster de origen bacteriano Sorona 3GT (DuPont, Genencor) utilizado en la industria textil y el PVC o 180 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía “polietileno verde” (Braskem, Tetrapak), un polímero del etileno obtenido a partir de etanol de caña de azúcar. 5. LOS BIOCOMBUSTIBLES Los combustibles fósiles (carbón, petróleo y gas natural) responden por aproximadamente el 75% de la energía consumida en el mundo. Como las reservas son limitadas y la quema de combustibles fósiles causa diversos problemas ambientales, es indispensable pensar en cómo obtener energía a partir de recursos renovables, y especialmente de biomasa. Las fuentes alternativas de energía son menos contaminantes y abren posibilidades de empleo local, además de garantizar el suministro de energía sobre las bases de un desarrollo sustentable. Considerados durante mucho tiempo como un recurso rural y no comercial, los biocombustibles representan hoy una fuente de energía limpia y competitiva, que contribuye a reducir algunos de los problemas ambientales que nos afectan, como la contaminación del aire, la lluvia ácida y el efecto invernadero. Con respecto a este último, la ventaja de los biocombustibles es que liberan en la atmósfera el CO2 absorbido por la biomasa durante su crecimiento, mientras que los combustibles fósiles liberan el CO2 retirado del ambiente millones de años atrás. La tecnología actual nos ofrece combustibles eficientes, obtenidos por fermentación de la biomasa (etanol, biogás). También existen otras posibilidades, como la producción de biodiesel por transformación química de aceites vegetales, o la de hidrógeno a partir de agua, utilizando la capacidad fotosintética de las microalgas. En relación al sector de los transportes, los biocombustibles son una realidad en Brasil (alcohol de caña de azúcar), en Estados Unidos y Canadá (alcohol de maíz y biodiesel de aceites vegetales) y en algunos países europeos (biodiesel de aceites vegetales). En esos países, sustituyen parcial o totalmente a la gasolina. Curiosamente, los primeros automóviles de Henry Ford, con motores de ignición por centella, funcionaban con etanol de maíz, y los primeros motores de Rudolf Diesel, de ignición por compresión, lo hacían con aceite de maní. Con el petróleo barato, esos combustibles fueron sustituidos por gasolina y aceite diesel. No obstante, el aumento de los precios del petróleo en la década de 1970 renovó el interés por los biocombustibles (etanol, biodiesel). 181 Biotecnología Actualmente, el etanol es el principal biocombustible líquido para el transporte automotor. La mayor parte de la producción (90%) está concentrada en Brasil (fermentación de la caña de azúcar) y en los Estados Unidos (fermentación del maíz). Los otros países productores son Canadá, China, Francia, Alemania e India. A pesar de liberar menos energía que la gasolina, el octanaje del etanol mejora el desempeño de las mezclas etanol-gasolina. ¿Hasta qué punto el etanol podrá sustituir a la gasolina? La respuesta dependerá de la interacción de varios factores, principalmente la tecnología disponible, el tipo de proceso productivo y el precio del petróleo. Se estima que en Brasil, el etanol de caña de azúcar es competitivo cuando el costo del barril de petróleo es de US$ 30-35; en los Estados Unidos, donde el etanol es producido a partir de maíz, eso ocurre con el barril a US$ 55-80. Por otro lado, el desvío de materias primas alimenticias, como el maíz o el aceite de soja, para la producción de biocombustibles tiene el inconveniente de aumentar el precio de los alimentos, perjudicando a los sectores más pobres de la población. También es preocupante que la expansión de los cultivos agroindustriales pueda favorecer el desmatamiento en la región amazónica y afecte la biodiversidad. Una posibilidad interesante sería la producción de etanol a partir de residuos lignocelulósicos, una tecnología compleja, actualmente en desarrollo (Figura 1). Etanol Producción por vía fermentativa La producción de bioetanol se basa en la acción fermentativa de las levaduras sobre un sustrato adecuado: caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo azucarero, maíz (Figura 2). Los residuos del proceso son CO2, bagazo y vinazas. La caña es transportada hasta la usina, donde se la tritura y separa del bagazo, que puede ser utilizado como combustible y generar electricidad para el propio establecimiento. Una vez preparado el caldo se agregan nutrientes y antisépticos, se ajusta la temperatura y el pH, y se inicia la fermentación en los biorreactores, con levaduras naturales o seleccionadas. El caldo puede ser utilizado tanto para la producción de etanol como para la de azúcar. En este último caso se origina un subproducto (melaza) que puede ser reincorporado al caldo nuevamente. La fermentación tiene lugar en las dornas (biorreactores). Dependiendo del establecimiento, el proceso se desarrolla en sistemas simples o automa182 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía FIGURA 1. Materias primas posibles para la producción de etanol ALMIDÓN SACAROSA CELULOSA Hidrólisis enzimática CALDO AZUCARADO Fermentación Destilación Hidrólisis ácida o enzimática ETANOL tizados, de manera continua o discontinua. Concluida la fermentación, se recuperan las levaduras por centrifugación, para una posterior reutilización o para producción de ración animal. De la destilación del vino se obtiene la flema alcohólica, un líquido con mayor concentración de alcohol. Los residuos o vinazas deben ser tratados antes de ser liberados al ambiente. Parte del alcohol hidratado que se recupera por rectificación de la flema, es transformado en alcohol anhidro por deshidratación. La sustitución de la gasolina En Brasil, aproximadamente el 63% de la energía disponible depende de fuentes renovables: grandes centrales hidroeléctricas (42%), madera (10%), caña de azúcar (9%) y otras (2%). La contribución de la caña de azúcar está relacionada con el uso del etanol como combustible. En otros países se utilizan materias primas diferentes, como la remolacha azucarera en la Unión Europea y el maíz en Estados Unidos y Canadá. La desventaja de las materias primas amiláceas (como el maíz) es que deben pasar por un tratamiento enzimático adicional (sacarificación) antes de la fermentación (Figura 1). Al aumentar el precio del petróleo, Brasil inició el Programa Nacional del Alcohol (Pró-Alcool, 1975) con el objetivo de reemplazar la gasolina por alcohol. En la década de 1980 funcionaban 5.000.000 de automóviles con etanol (94% de etanol, 6% de agua) y otros 9.000.000 con “gasohol” (78% de gasolina, 22% de alcohol). 183 Biotecnología En 1989 la caída del precio del petróleo, la existencia de excedentes nacionales y algunos problemas inherentes al propio Pró-Alcool (subsidios, baja productividad) provocaron una crisis de desabastecimiento que debilitó al programa. Reactivado en la década de 1990, y esta vez obedeciendo a criterios de productividad, tanto en el manejo del cultivo como en la industria, el programa ya no recibe subsidios. Actualmente, más de 3 millones de automóviles utilizan alcohol hidratado. El alcohol anhidro se agrega a la gasolina como aditivo, en una proporción que varía entre 20 y 24% en función de la oferta y la demanda. La tecnología flexfuel, que permite abastecer los coches tanto con gasolina como con alcohol hidratado, deja al consumidor la posibilidad de elegir el combustible según su interés económico. En 2009, la producción de etanol en Brasil fue de 24 billones de litros, calculándose que será de 36 billones de litros en 2012. El sector alcohol-azucarero de hoy es un enorme complejo industrial con más de 400 industrias y la participación de varias multinacionales, en un mercado consolidado a través de ciclos de adquisiciones y fusiones. Las pequeñas usinas fueron suplantadas por otras más avanzadas tecnológicamente, que establecieron sistemas de producción integrados. En un futuro próximo, la mecanización de la cosecha eliminará la quema y modificará las condiciones de trabajo en los cañaverales. Además de etanol, las instalaciones industriales fabrican aglomerado, ración animal, abono, celulosa, etc. El aprovechamiento del bagazo es fundamental porque permite generar la energía necesaria para el funcionamiento de las usinas e inclusive exportarla, incrementando la matriz energética renovable del país. El mejoramiento genético de la caña de azúcar posibilitó la obtención de variedades de desarrollo rápido, medio y tardío, cuya siembra secuencial disminuye las variaciones en la oferta de la materia prima. El proyecto Genoma de la Caña, un convenio entre fuentes financiadoras, universidades y el sector alcohol-azucarero, contribuye al mejoramiento del cultivo (tenor de azúcar, resistencia a plagas y enfermedades). La ingeniería genética ha permitido obtener microorganismos más productivos y tolerantes al etanol, o capaces de fermentar directamente materias primas amiláceas (mandioca), evitando la sacarificación. También se han modificado por esta tecnología algunas características de las levaduras, de modo de facilitar su recuperación (floculación) una vez concluida la fermentación. 184 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía FIGURA 2. Las principales etapas de la producción de etanol por fermentación Cosecha Transporte CAÑA DE AZÚCAR Tratamiento de la materia prima (molienda, extracción del caldo) CALDO, GUARAPO O MOSTO BAGAZO (combustible) LEVADURAS (reaprovechamiento) Fermentación MELAZA AZÚCAR CO2 Destilación VINO LEVADURAS (ración animal) FLEMA Rectificación ETANOL HIDRATADO Deshidratación ETANOL ANHIDRO VINAZA (fertilizante) Biogás En condiciones aerobias, la digestión microbiana de la materia orgánica produce H2O y CO2. En condiciones anaerobias, la descomposición es llevada a cabo por varios grupos de microorganismos en sucesión biológica; los productos finales son metano (CH4), dióxido de carbono (CO2) y agua (Figura 2). 185 Biotecnología En ambientes confinados como pantanos y sepulcros, el gas formado genera algunos fenómenos inquietantes de combustión espontánea, como las “luces de cementerio” o “luces de camposanto”. Pero en las condiciones más controladas de un relleno sanitario o de un biorreactor (biodigestor), el gas acumulado podrá ser utilizado como combustible (biogás). En el proceso fermentativo o biodigestión, las materias primas son residuos rurales (estiércol), agroindustriales (vinazas, efluentes de las industrias lácteas y de los mataderos), domésticos o municipales (fango de cloaca) y, también, plantas (camalotes). La materia orgánica se coloca en el biodigestor, en anaerobiosis y a pH neutro (6,7-7,7), evitando la presencia de solventes o insecticidas que perjudiquen el desarrollo del proceso. Dependiendo de la temperatura, crecerán bacterias mesófilas (35 0C) o termófilas (55 0C). En el primer caso, la materia prima es procesada en 15 a 30 días, mientras que en el segundo, el tiempo disminuye a 12 o 14 días. Esta última opción permite una producción mayor de metano, pero requiere también un consumo de energía mayor y un monitoreo cuidadoso, ya que las bacterias termófilas no toleran bien las variaciones de temperatura. Como el proceso de descomposición anaerobia depende de las poblaciones naturales de microorganismos, las mejoras tecnológicas se concentran exclusivamente en la ingeniería del proceso. Este puede operar de manera discontinua o continua, en biodigestores especialmente construidos para permitir el abastecimiento diario de materia prima y la remoción de biogás. Existe un gran número de diseños de fermentadores, desde los muy simples (modelo tailandés, chino, indio) hasta los automatizados, que procesan un gran volumen de materia prima. Concluido el proceso de biodigestión, el biogás puede ser usado directamente, para consumo doméstico (cocinas, faroles o estufas) o para generar energía eléctrica. Después de pasar por una planta purificadora y ser almacenado en tanques de baja presión, el biogás se emplea para el encendido de motores de automóviles (Figura 3). Uno de los residuos de la biodigestión es un material sólido fibroso que, una vez compostado y prensado, es aprovechado como suelo artificial (compost) o adicionado para mejorar el terreno alrededor de árboles y plantas. Otro de los residuos es un efluente líquido que se emplea como abono (Figura 4). La utilización del biogás El biogás está formado por 50-65% de metano y 35-50% de dióxido de carbono, con trazas de gas sulfhídrico (corrosivo), nitrógeno, oxígeno e 186 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía FIGURA 3. Biodigestión aerobia y anaerobia La biodigestión anaerobia genera metano, un gas combustible RESIDUOS ORGÁNICOS MOLÉCULAS ORGÁNICAS SIMPLES O2 ACETATO Aerobiosis Anaerobiosis H2O H2O CO2 CH4 BIOGÁS CO2 hidrógeno. Tiene menor poder calorífico que el gas natural, un combustible fósil que, además de metano, contiene etano, propano y butano (Tabla 4). La primera planta de biogás comenzó a funcionar en Bombay (India) en 1859. Esta tecnología fue expandiéndose en su forma más sencilla; en 1980 existían 150.000 biodigestores en el país. Tal vez sea por eso que la digestión anaerobia es frecuentemente presentada como un proceso biotecnológico limitado a comunidades rurales y pequeñas ciudades. Sin embargo, la producción de biogás puede encararse como una tecnología moderna para la producción de calor y electricidad. En 1995, cuando contaba con más de cinco millones de pequeños biodigestores rurales, China decidió construir reactores tecnológicamente avanzados que permitieran el tratamiento de desechos urbanos y la generación de electricidad. Entre los países que siguieron el mismo camino están Dinamarca, líder mundial en la producción de biogás, además Estados Unidos, Alemania, Francia, Japón y Suecia. En pequeñas comunidades de América Latina, la construcción de generadores populares de biogás permite el abastecimiento de energía suficiente para cocinar alimentos o utilizar motores. El tratamiento de desechos agroindustriales es una fuente de combustible, especialmente a partir de los residuos de la industria azucarera y la cría de cerdos. Actualmente hay varios proyectos ambiciosos para la explotación del potencial existente en los rellenos sanitarios urbanos (Argentina, Brasil, Chile, México, Uruguay). Cuba cuenta con más de 100 plantas productoras de biogás. 187 Biotecnología FIGURA 4. La producción de biogás Los productos secundarios del proceso se utilizan como fertilizantes (efluentes) y como compost (fibras) A. Las principales etapas, dentro del biodigestor MATERIA PRIMA MOLÉCULAS COMPLEJAS (POLÍMEROS) Bacterias fermentadoras MOLÉCULAS SIMPLES (MONÓMEROS) Bacterias acidogénicas ÁCIDOS Y ALCOHOLES Bacterias acetogénicas ACETATO Bacterias metanogénicas BIODIGESTOR BIOGÁS + EFLUENTE LÍQUIDO MATERIAL SÓLIDO FIBROSO B. El uso del biogás BIOGÁS ENERGÍA TÉRMICA ENERGÍA ELÉCTRICA Plantas purificadoras y de almacenamiento Combustible TRANSPORTE AUTOMOTOR 188 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía TABLA 4. Poder calorífico de varios combustibles Gas Butano Propano Metano Gas natural Biogás Gas de ciudad Poder calorífico (kcal/m3) 28.000 22.000 8.500 7.600 5.500 4.000 Biodiesel El biodiesel es un combustible compuesto por los ésteres (etílicos o metílicos) resultantes de la reacción química entre aceites vegetales y alcohol (etanol o metanol), en presencia de un catalizador inorgánico o enzimático. La reacción (Figura 5) deja un subproducto, el glicerol, que es aprovechado por algunas industrias (alimentos, cosmética, medicamentos). Para aumentar la producción de biodiesel habría que encontrar nuevos usos del glicerol, porque al ser quemado genera una sustancia tóxica (acroleína). El biodiesel puede usarse directamente o mezclado con un diesel convencional (B20, con 20% de biodiesel). Una de sus ventajas es que reduce la formación de material particulado, gases (efecto invernadero) y azufre (enfermedades respiratorias y lluvia ácida). El costo todavía es alto, pero ya es producido en varios lugares: en Estados Unidos a partir de soja, en la Unión Europea y Canadá a partir de canola. En la Argentina, las principales fuentes de producción de biodiesel son la soja y el girasol. En Brasil, donde se prevé sustituir el 20% del diesel convencional por biodiesel, se investigan fuentes alternativas a la soja (ricino, babasú, dendé, girasol, maíz, maní, etcétera). Aunque desde el punto de vista energético, los sistemas productivos más eficientes sean los que están asociados a complejos agroindustriales (soja, maíz, girasol), tienen el inconveniente de desviar las materias-primas de alimentos y raciones para la producción de energía. 189 Biotecnología FIGURA 5. La reacción de transesterificación H 2C - O - CO - R HC - O - CO - R H 2C - O - CO - R Triglicéridos Alcohol + 3R´- OH CH2OH HCOH CH2OH Glicerol Ésteres + 3R - O - CO - R 6. PERSPECTIVAS La primera generación de biocombustibles comprende el etanol (caña de azúcar, remolacha, maíz) y el biodiesel (aceites vegetales). La segunda generación tendrá etanol formado a partir de la biomasa lignocelulósica proveniente de los residuos agroindustriales, como el bagazo y las hojas de la caña, paja y sabugo de maíz, aserrín y viruta de madera, etcétera. La mayor dificultad tecnológica se encuentra en la propia estructura de esa biomasa. La celulosa (un polímero de hexosas) y la hemicelulosa (un polímero de pentosas y hexosas) están rodeadas por lignina, una sustancia que da rigidez y soporte a las plantas. Se necesita un tratamiento que la elimine, posibilitando la hidrólisis enzimática y la liberación de los azúcares (hexosas y pentosas) para la fermentación. La tendencia actual es la construcción de complejos industriales (biorrefinerías) con instalaciones que permitan el procesamiento biotecnológico, químico, físico y térmico de la materia prima renovable, transformándola en numerosos intermediarios químicos y bioquímicos con los que se pueda alimentar un conjunto de líneas de producción muy diversificadas. Existen instalaciones especialmente diseñadas y enzimas celulolíticas (celulasas y hemicelulasas) para uso industrial. Algunas industrias funcionan experimentalmente en Suecia, España, Dinamarca, Canadá y Estados Unidos. Brasil tendrá una instalación piloto en 2012. También se han hecho inversiones en el desarrollo de procesos termoquímicos en que el gas obtenido por combustión de la biomasa es transformado en etanol, por catálisis o por acción microbiana. Independientemente de la forma de producción, la expectativa es muy alta en relación al biodiesel y al bioquerosene, que adicionado al querosene disminuiría los costos del combustible de avión. En la línea de trabajo de la biología sintética, el metabolismo de la levadura es modificado y direccionado a la producción de moléculas intere190 Capítulo X. Biotecnología, industria y energía santes para el sector de energía y de química fina (Amyris do Brasil). Con la liberación comercial en Brasil de una levadura transgénica que sintetiza farneseno, un precursor de biodiesel, a partir de caña de azúcar, se espera que a partir de 2011 puedan ser fabricados dos millones de toneladas/año de biocombustibles. 191 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente 1. EL DESARROLLO SUSTENTABLE ¿Cuál es el impacto de las actividades humanas sobre el medioambiente? ¿Cuál es el legado que le dejaremos a las próximas generaciones? A partir de estas preguntas emerge el concepto de desarrollo sustentable, definido como “la capacidad de atender las necesidades del presente sin comprometer la capacidad de las generaciones futuras de atender sus propias necesidades” (Informe Brütland, 1987). El desarrollo sustentable depende del progreso en tres áreas: económica, social y ambiental. Ese es el consenso alcanzado a lo largo de dos décadas y varias conferencias internacionales (Río de Janeiro y Agenda 21, 1992; Kyoto, 1997; Johannesburgo, 2002; Copenhague, 2009; Cancún, 2010; Durban, 2011; Río de Janeiro, 2012). Sin embargo, las relatorías publicadas en 2007 por el Panel Intergubernamental sobre Mudanzas Climáticas (IPCC, sigla en inglés) de las Naciones Unidas destacan la responsabilidad del hombre en el futuro del planeta y muestran que no podemos seguir postergando acciones concretas de protección del medioambiente. La contribución de las biotecnologías al desarrollo sustentable debe ser analizada en función del impacto causado en cada una de esas áreas. Con respecto a la economía, las biotecnologías disminuyen los costos de la materia prima y de la producción industrial con procesos y productos nuevos o de mayor valor agregado. En el área social se espera que el desarrollo de nuevas plataformas tecnológicas posibilite la conservación y la creación de empleos. En el área ambiental las biotecnologías desempeñan un importante papel en la prevención, remediación y monitoreo de la contaminación. 2. LAS TECNOLOGÍAS LIMPIAS Aunque muy lentamente, nuestra sociedad está admitiendo que es preferible no contaminar a tener que desarrollar métodos para limpiar el ambiente. En el contexto de las llamadas “biotecnologías blancas”, varias tecnologías 193 Biotecnología limpias reemplazan a otras más contaminantes en procesos industriales y agrícolas, ayudando también a reducir el volumen de residuos domésticos, agrícolas e industriales. La sustitución de procesos industriales La tecnología enzimática es la primera alternativa para disminuir la polución porque permite sustituir algunos procesos y productos industriales por otros menos agresivos para el medioambiente. A diferencia de los catalizadores no biológicos, las enzimas son altamente específicas, no tóxicas y biodegradables. Utilizadas como agentes biológicos, permiten procesos productivos más limpios y seguros, con menor consumo de energía y menor generación de residuos secundarios. El desarrollo de enzimas activas a altas temperaturas, en solventes no acuosos y en sólidos ampliará las aplicaciones futuras. La tecnología enzimática alcanza a sectores muy diversos, algunos reconocidamente contaminantes, como las industrias de alimentos, detergentes, textiles, de papel y celulosa, de cueros, etc. En las curtiembres, por ejemplo, el uso de enzimas reduce el consumo de derivados del azufre en 40%, y produce cuero de mejor calidad. La introducción de hasta ocho enzimas en los detergentes evita el lavado de la ropa a muy altas temperaturas, disminuyendo el consumo de energía. Los plásticos representan el 20% del volumen de desechos en los países industrializados, y la mayor parte proviene de los embalajes convencionales de la industria de alimentos. Constituyen un problema para el medioambiente porque además de perdurar por largo tiempo en la naturaleza, su fabricación emplea una materia prima no renovable (petróleo) y un proceso muy contaminante que gasta una gran cantidad de energía. A corto o mediano plazo, los plásticos podrán ser reemplazados por otros polímeros de propiedades similares y biodegradables, pero de origen bacteriano o vegetal. La industria de papel y celulosa es otro caso a considerar. Consume alrededor de 4.000 millones de árboles por año, principalmente pinos y eucaliptos y produce 40 millones de toneladas de papel y celulosa al año. Brasil cuenta con 1,5 millones de hectáreas de bosques plantados, abasteciendo una actividad industrial que genera 100.000 empleos directos y exportaciones por valor de US$ 2,8 mil millones. Es el mayor productor latinoamericano de papel y celulosa, seguido por Chile. La madera está compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina. Aproximadamente, el 90% de esta última es eliminada mediante un trata194 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente miento a altas temperaturas, realizado en medio alcalino. El 10% de la lignina restante le da el color pardo característico al producto resultante o pasta kraft, que se usa para hacer cartón y papel madera. El blanqueo requiere un tratamiento con oxígeno y cloro, en un proceso en el que se forman derivados clorados tóxicos. Un procedimiento alternativo es el biopulping, un tratamiento enzimático con xilanasas que degradan el xilano de la hemicelulosa, eliminando la lignina a la que está asociada (Figura 1). El secuenciamiento del genoma del eucalipto ayudará en el mejoramiento de la calidad de la madera, al aumentar la proporción de celulosa y disminuir la de lignina en árboles de crecimiento más rápido. Por otro lado, el secuenciamiento del genoma del hongo lignilolítico Phanerochaete chrysosporium (pudrición blanca) reveló la existencia de más de 240 genes que codifican para enzimas extracelulares que participan en la degradación de carbohidratos. Este hongo es el más eficiente en la descomposición de la madera y se lo usa en la industria para el blanqueo de la pulpa de papel y de las telas y, también, en la degradación de numerosos contaminantes de origen orgánico. FIGURA 1. Blanqueo de la pasta kraft en la industria de papel y celulosa El blanqueo de la pulpa kraft admite tratamientos químicos (cloro) y biológicos (xilanasa), estos últimos disminuyen la carga contaminante del efluente MADERA Lignina + celulosa + hemicelulosa Extracción alcalina a alta temperatura PASTA KRAFT Lignina (90%) Lignina (10%) + celulosa + hemicelulosa Blanqueo con cloro Blanqueo con xilanasa Derivados clorados de la lignina PULPA BLANCA Celulosa + hemicelulosa Eliminación de la lignina EFLUENTE EFLUENTE 195 Biotecnología En la fabricación del papel se usa almidón para aumentar la rigidez de la masa y mejorar el acabamiento. El almidón está formado por cadenas de amilosa y amilopectina, estas últimas de mayor interés industrial. En Brasil se aprovecha el almidón de mandioca porque tiene menos amilosa que el de maíz o de la papa. La Comisión Europea autorizó recientemente la papa genéticamente modificada Amflora (BASF Plant Science) que produce almidón de alta calidad con 100% de amilopectina. Esta papa se destina al uso industrial y no puede ser incluida en la alimentación humana o en raciones animales. La sustitución de insumos agrícolas Una segunda alternativa es la aplicación de tecnologías limpias para sustituir parcialmente algunos insumos utilizados en la agricultura, tales como los fertilizantes y plaguicidas. Debido a la aplicación masiva de fertilizantes agrícolas, el nitrógeno (N) y el fósforo (P) que no fueron absorbidos por las plantas acaban siendo arrastrados por las lluvias hacia los ríos y las reservas de agua. El exceso de nutrientes estimula la proliferación de algas, impidiendo la vida en los cursos de agua y produciendo toxinas que afectan a los peces y al ganado. Microorganismos versus productos químicos El nitrógeno es un nutriente indispensable para los cultivos vegetales porque forma parte de las proteínas y de los ácidos nucleicos. Se encuentra en la atmósfera como N2 y en el suelo como nitrato, como resultado de la descomposición de la materia orgánica o proveniente de los fertilizantes agrícolas. Algunos microorganismos libres (Azotobacter, Azospirillum) o simbiontes (Rhizobium, Bradirhizobium) que viven en los nódulos de las raíces de las leguminosas (soja, poroto), pueden fijar directamente el nitrógeno atmosférico en una forma utilizable por las plantas. Inoculando las semillas con rizobios, por ejemplo, se disminuye la cantidad de nitrógeno que hay que agregarle al suelo. Se trata de una práctica muy simple, facilitada por la producción industrial de microorganismos seleccionados. La inoculación se hace antes de la siembra, mezclando el producto con las semillas humedecidas en tambores giratorios. El fósforo se origina a partir de las rocas del suelo y de la descomposición de los seres vivos. En los suelos ácidos, propios de las regiones tropicales, la 196 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente mayor parte de los fosfatos (95-99%) forma compuestos minerales orgánicos insolubles que no son directamente aprovechables por la plantas. Por eso, el fósforo se transforma en un nutriente limitante para su crecimiento. Las micorrizas son asociaciones simbióticas entre hongos y raíces vegetales. Los primeros absorben los nutrientes minerales y el agua del suelo, transfiriéndolos a la planta hospedadora. La inoculación de los suelos, o micorrización, diminuye la cantidad de fósforo que hay que adicionar para el crecimiento vegetal. Como tecnología agrícola, la micorrización está vinculada con la reforestación. Además de los fertilizantes agrícolas, otra de las causas de liberación excesiva de fósforo al medioambiente es la cría intensiva de animales, porque ni los cerdos ni las aves metabolizan el fitato, que es la forma natural del fósforo en el forraje. La complementación de estas raciones con la enzima fitasa tiene un efecto importante en el medioambiente, ya que reduce en más del 30% la cantidad de fósforo excretado y la contaminación de los cuerpos de agua. La fitasa es producida industrialmente con un microorganismo genéticamente modificado. Manejo integrado de plagas versus agroquímicos Prácticas agrícolas como el uso de variedades seleccionadas y la rotación de cultivos reducen sustancialmente la aplicación de agroquímicos. Una herramienta adicional es la sustitución de los productos químicos por alternativas biológicas, tales como bacterias, hongos y virus entomopatogénicos. En su clásico libro La primavera silenciosa, de 1972, Rachel Carlson ya alertaba sobre los daños causados por el DDT, recomendando la búsqueda de soluciones biológicas. Actualmente, tenemos varios casos de sustitución de pesticidas por agentes biológicos específicos (Tabla 1). Un ejemplo es la aplicación de partículas de baculovirus, un virus que infecta y mata a las orugas (Anticarsia gemmatalis) de las leguminosas (soja). Otro es la pulverización con esporas del hongo Metarhizium anisopliae, para combatir la cigarrita de la hoja de la caña de azúcar o la broca de los cítricos. El ejemplo más conocido de “tecnología verde” es el control biológico de insectos mediante las toxinas de una bacteria del suelo (Bacillus thuringiensis o Bt) utilizada como insecticida agrícola desde hace más de treinta años, sin registro de daños en las personas, la vida silvestre o los insectos benéficos (Dipel, Bac-control, Bactur, Thuricide, Ecotech Pro, etc.). Con el desarrollo de la ingeniería genética, se transfirieron los genes codificadores de 197 Biotecnología TABLA 1. Principales contaminantes del medioambiente Categoría Inorgánicos Ejemplo Metales (cadmio, mercurio, plata, cobalto, plomo, cobre, cromo, hierro), isótopos radioactivos, nitratos, nitritos, fosfatos, cianuros, asbestos. Efluentes y residuos sólidos de origen doméstico, agrícola e industrial. Residuos petroquímicos: petróleo, gasoil, compuestos aromáticos (benceno, tolueno, etilbenceno, xileno). Productos sintéticos: pesticidas, organohalogenados como los bifenilos policlorados (PCB) o los hidrocarburos poliaromáticos (PHA). Gases: SO2, CO2, NOx, metano. Compuestos volátiles: clorofluorocarbonatos (CFC), compuestos orgánicos volátiles (VOC). Orgánicos Gaseosos estas toxinas a varias plantas (maíz, algodón, arroz, etc.) que ahora producen directamente la toxina insecticida. Como un aliado de los biofertilizantes y la rotación de cultivos, el control biológico busca preservar los cultivos y proteger la producción de alimentos. El empleo de estas herramientas constituye lo que se conoce como manejo integrado de plagas (MIP). Además de biopesticidas, en el control biológico se aplican otras estrategias económicas muy ingeniosas, como la de Cuba en el combate al tetuán del boniato, un gorgojo (Cylas formicarius) que ataca las plantaciones de boniato (batata o papa dulce). Para protegerlas, se cuelga en el campo una lata con una pequeña cantidad de feromona, pulverizando alrededor esporas del hongo Beauveria bassian. Atraídos por la feromona, los machos se aproximan a la lata y así se contaminan con el hongo, que les causa la muerte. El hongo es inocuo para plantas, seres humanos y animales. Para Cuba resultó crucial la experiencia de varias décadas de trabajo con control biológico cuando, debido al embargo de Estados Unidos, el país tuvo que sustituir el uso de agroquímicos en la agricultura. Actualmente participan del programa cubano de control biológico de plagas 14 laboratorios regionales, 60 estaciones de protección vegetal, 27 puestos equipados con laboratorios de diagnóstico y más de 200 CREE (Centros de Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos). Entre los organismos utilizados 198 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente hay bacterias (Bacillus thuringiensis, Verticillum lecanii), hongos (Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae), nematodes, insectos parásitos (moscas y avispas) y predadores (hormigas). 3. LA REDUCCIÓN DE LOS RESIDUOS La degradación de la basura (residuos sólidos) y el tratamiento de las aguas servidas y efluentes (residuos líquidos) son ejemplos clásicos de aplicaciones de la biotecnología tradicional. Son aplicaciones no siempre valoradas, a pesar del inmenso volumen de materia involucrado y de su importancia para el medioambiente. La degradación de la basura En condiciones adecuadas, todos los compuestos naturales pueden ser degradados. Las poblaciones microbianas del ambiente degradan las sustancias orgánicas a través de numerosas reacciones, sin necesidad de cuidados asépticos o de cultivos puros. Vimos en el capítulo anterior que en condiciones aerobias los productos finales de la biodegradación de la materia orgánica (mineralización) son el dióxido de carbono (CO2) y el agua; en condiciones anaerobias se forma biogás. En el compostaje, los propios microorganismos de la basura mineralizan la materia orgánica previamente fragmentada y mezclada (Figura 2). Al comenzar la degradación, la liberación de energía provoca un aumento de la temperatura suficiente para eliminar a la mayoría de los microorganismos indeseables (sanitización). A medida que la actividad microbiana disminuye, el sistema se estabiliza y madura hasta perder todo su potencial de biodegradación. El proceso puede desarrollarse en sistemas simples (pilas al aire libre) o complejos (silos, biorreactores), en ambos casos es necesario remover el material, manual o mecánicamente, para asegurar la aeración durante el proceso de biodigestión. Las condiciones se optimizan controlando la relación carbono/nitrógeno, el oxígeno, la humedad y la temperatura. El tratamiento de los residuos sólidos urbanos (RSU) en usinas de compostaje es un procedimiento alternativo a la incineración y al depósito en basurales y rellenos sanitarios. En estas usinas, la separación previa de los componentes permite reciclar algunos materiales (metales, vidrio, etc.). La biodegradación aerobia o mineralización de los restos orgánicos los transforma en un compost, utilizado en el mejoramiento de los suelos, 199 Biotecnología FIGURA 2. Compostaje El proceso comprende la biodegradación aerobia de la materia orgánica en la cual, además del compuesto, se produce agua, CO2 y otras sustancias. El calor liberado disminuye la cantidad de microorganismos indeseables (sanitización) AIRE DESECHOS ORGÁNICOS AGUA FUENTE DE NITRÓGENO Fragmentación y mezcla de las partículas Aumento de la temperatura (sanitización) Disminución y estabilización de la temperatura Maduración BIODIGESTIÓN AEROBIA Calor COMPOST CO2 Agua Otras sustancias en actividades de reforestación, para colmatar terrenos, para contrarrestar la erosión, etcétera. Por otro lado, la descomposición in natura de la basura en los rellenos sanitarios crea una zona de anaerobiosis donde se produce biogás. Este es liberado a la atmósfera, donde contribuye al efecto invernadero y al aumento de la temperatura, afectando el clima. El tratamiento de las aguas residuales Las aguas cloacales están formadas por excrementos (heces y orina), aguas de uso doméstico (baño, lavado de ropa, etc.) y, eventualmente, algunos desechos de origen industrial. Liberadas directamente a los cursos de agua, las aguas cloacales desestabilizan a las poblaciones microbianas que al multiplicarse consumen el oxígeno provocando la muerte de peces y crustáceos. 200 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente Su tratamiento combina métodos físicos (filtración y sedimentación) con métodos biológicos de degradación. Los microorganismos aerobios (bacterias y protozoarios ciliados) mineralizan parte de la materia orgánica del efluente. Las bacterias anaeróbicas proceden a la biodigestión de los lodos, permitiendo la obtención de biogás y la remoción de algunos nutrientes (N y P, principalmente) que podrían crear desequilibrios ecológicos (Figura 3). El tratamiento ocurre en cuatro etapas. Tratamiento primario. Las aguas cloacales pasan por un proceso de filtración que remueve objetos grandes, basura y arena. En el tanque de sedimentación, la grasa sobrenadante se separa del lodo sedimentado, que puede ser transferido a un biodigestor. Tratamiento secundario. El líquido efluente del tanque de sedimentación puede tratarse en lagunas de escasa profundidad o en filtros de goteo (Figura 3, 1), colonizados por los propios microorganismos de la cloaca, que se desarrollan digiriendo la materia orgánica del medio. También puede tratarse en tanques de lodo activado (Figura 3, 2), donde inyectando aire comprimido se oxigena y agita el medio. Un segundo tanque de sedimentación separa el efluente del lodo. Tratamiento terciario. Elimina sustancias inorgánicas y orgánicas, mediante procedimientos tales como la filtración, la volatilización del amoníaco, la precipitación del fosfato, etcétera. Tratamiento avanzado. Si bien la degradación microbiana de los residuos orgánicos no elimina totalmente a los microorganismos patógenos, la carga restituida al ambiente disminuye considerablemente. Solo algunos procedimientos adicionales eliminan a los microorganismos patógenos recalcitrantes (cloración, irradiación UV y tratamiento con ozono). El tratamiento de los efluentes industriales Además de ser fundamental para la población y el medioambiente, el tratamiento de los efluentes industriales es también estratégico, porque permite mejorar la imagen de las industrias más contaminantes, entre las que figuran las químicas, de pulpa y papel, textiles y curtiembres, de alimentos, de extracción de metales y minerales y productoras de energía. Cuando las vinazas resultantes de la obtención de alcohol se liberan directamente a los ríos y cuerpos de agua, estos sufren eutrofización, con consecuencias nefastas para los seres vivos. Para evaluar la dimensión del problema, basta recordar que por cada litro de alcohol la industria puede generar hasta 12 litros de vinazas. Las soluciones contemplan el uso de tecnologías 201 Biotecnología FIGURA 3. Tratamiento de las aguas residuales Comprende el tratamiento del efluente por medios físicos, químicos y biológicos AGUAS CLOACALES Tamizado Filtro de arena Lodo activado Tanque de Lodo sedimentación Lodo Fosas sépticas Lagunas de oxidación Filtros de goteo 1 2 EFLUENTE Tanque de sedimentación Lodo EFLUENTE EFLUENTE Biodigestor anaeróbico RESIDUO SÓLIDO más eficientes que permitan reducir el volumen de vinazas, y también su biodigestión anaerobia para la generación de biogás y de electricidad. Los efluentes de las industrias lácteas son usados como materia prima para el crecimiento de microorganismos que se agregan a las raciones animales. De la misma manera, el licor sulfítico de los efluentes de la industria del papel y de la celulosa puede ser eliminado con el hongo Paecilomyces, produciendo biomasa. Con respecto a los residuos gaseosos de origen industrial, el tratamiento de los compuestos orgánicos volátiles (VOC) se hace a través de filtros biológicos, de diferentes tipos y complejidad tecnológica. Las emisiones de gases y el efecto invernadero Existen algunas fuentes naturales de emisión de gases, como los volcanes o las termitas. Estas últimas liberan 40 millones de toneladas de metano por año, gracias a la actividad de su flora intestinal simbionte, que les permite alimentarse de celulosa. Sin embargo, el aumento del dióxido de carbono y del metano atmosférico se debe principalmente a algunas actividades humanas, tales como el depósito de basura en los rellenos sanitarios, los cultivos de arroz, la cría de ganado, la liberación de efluentes agroindustriales no tratados, y la extracción de gas natural y carbón. Cabe destacar que la contribución del metano al efecto invernadero es 20 veces superior a la del dióxido de carbono. 202 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente Como actualmente los niveles de metano atmosférico son dos veces superiores a los de la era preindustrial, su utilización como combustible eliminaría una fuente de contaminación atmosférica. América Latina, que emite el 6% de los gases contaminantes, tiene varios proyectos de reaprovechamiento del metano (rellenos sanitarios, residuos agroindustriales) en Argentina, Brasil, Chile, Cuba, México y Uruguay. Las iniciativas dependen de empresas privadas y de organismos gubernamentales, y algunos estudios preliminares contaron con financiamiento del Banco Mundial. En relación a la gasolina, la quema de biocombustibles emite cantidades menores de monóxido de carbono (CO), óxidos de azufre (SOx), hidrocarburos y otras sustancias contaminantes. En compensación, los biocombustibles liberan aldehídos cancerígenos y, dependiendo del motor, óxidos de nitrógeno (NOx). Sin embargo, entre 2004 y 2008, el uso de biocombustibles en la flota flexfuel brasileña habría dejado de liberar en la atmósfera 35 millones toneladas de CO2. Se calcula que mezclando con alcohol 10% de la gasolina disponible, podría evitarse la emisión de 530 millones de toneladas de CO2. El Protocolo de Kyoto (1997) preveía la reducción de la emisión de gases contaminantes (dióxido de carbono, metano, óxidos nitrosos, clorofluorocarbonatos). Fue ratificado por numerosos países, pero no por Estados Unidos ni Rusia, que son responsables por el 36% y el 17% de las contaminaciones, respectivamente. A pesar de no alcanzar los resultados esperados, el Protocolo de Kyoto creó un mercado paralelo de la descontaminación a través de la compra y venta de créditos de reducción de emisiones (CER, del inglés emission reduction credit), que no son más que bonos sobre la cantidad de contaminación que se deja de emitir. Así, un país que superó la cuota de gases emitidos puede seguir contaminando la atmósfera, a condición de comprar bonos de un país que no la contamina o ha reducido su contaminación. 4. LA BIORREMEDIACIÓN Entre las sustancias sintetizadas químicamente por el hombre, hay muchas que se parecen a las naturales, mientras que otras difieren de cualquier molécula fabricada por un organismo vivo (xenobióticas). Entre más de 300 sustancias orgánicas e inorgánicas peligrosas de este grupo, hay algunas que son biodegradadas muy lentamente y persisten por mucho tiempo en el ambiente. 203 Biotecnología Los contaminantes Aproximadamente, 2,5 millones de toneladas de sustancias químicas peligrosas se liberan anualmente al ambiente, como producto de las actividades humanas (Tabla 1). En algunos casos se trata de emisiones deliberadas y reglamentadas (residuos industriales), en otros se trata de escapes accidentales (manchas de aceite o petróleo). A diferencia de los residuos agrícolas y urbanos, los metales provenientes de las actividades extractivas e industriales no son biodegradados. Sin embargo, algunos vegetales los absorben y concentran (bioacumulación), un proceso limitado, obviamente, a las capas poco profundas del terreno. Existen plantas genéticamente modificadas para transformar los compuestos organomercuriales formados en diversas actividades (por ejemplo, extracción de carbón y de oro), en una forma volátil menos tóxica. Al ser mucho más solubles en lípidos que en agua, los bifenilos policlorados (PCB), como el DDT, se acumulan en los tejidos adiposos de los animales. Compuestos halogenados también se degradan muy lentamente, pero ya se han aislado microorganismos que participan en el proceso. Buscar microorganismos con características especiales es el primer paso para resolver problemas ambientales. Algunos ya son conocidos: Deinococcus radiodurans, resistente a la radiación; Bacillus infernus, resistente a altas temperaturas; Methanococcus jannaschi, resistente a presiones de hasta 230 atmósferas y a altas temperaturas, etcétera. El problema de cómo detectar y eliminar las 60 a 70 millones de minas antipersonales diseminadas por el mundo es de difícil solución. Una posibilidad podría ser la siembra de plantas de Arabidopsis transgénicas (Aresa, Dinamarca) que degradan la nitroglicerina liberando NO2, un gas que al ser absorbido por la planta modifica en tres semanas el color de las hojas. Los tratamientos Existen varios métodos para remover sustancias recalcitrantes del medioambiente. Las opciones contemplan la construcción de barreras físicas, el lavado o ventilación del suelo contaminado y su destrucción por incineración o por biorremediación. Esta última apela al uso de agentes biológicos y opera a menor costo y más rápidamente. Una forma de biorremediación es la producción de biomasa en el lugar contaminado (in situ). Desde el punto de vista práctico, hay dos estrategias posibles que son la inoculación del suelo con microorganismos especializa204 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente dos, o el agregado de nutrientes que estimulen la acción de los microorganismos presentes en el sitio contaminado. En ambos casos, las bacterias u hongos degradan los desechos peligrosos transformándolos en productos inofensivos. Una vez consumido el material tóxico utilizado como alimento, los microorganismos mueren o vuelven a su nivel poblacional normal en el ambiente. Otra forma de biorremediación de los suelos contaminados es el tratamiento ex situ, en que el suelo excavado es transferido a un biodigestor. Como la liberación de microorganismos genéticamente modificados al ambiente aún es vista con desconfianza, su empleo se restringiría a estos sistemas cerrados. La modificación genética de los microorganismos puede originar cepas con un potencial de degradación de los contaminantes mayor que el de los organismos naturales. También permite el diseño de microorganismos que combinen varias características de diferentes cepas, como la degradación de PCB y la adaptación a un amplio rango de temperaturas. Introduciendo los dos genes correspondientes en una bacteria inocua y de fácil cultivo, esa contaminación podría ser tratada de manera específica. Entre las formas ingeniosas de biorremediación, cabe destacar el uso de microorganismos que sobreviven en el ambiente contaminado y tienen sistemas enzimáticos capaces de digerir los contaminantes, aunque sean ligeramente diferentes a sus sustratos normales. Esta propiedad, denominada metabolismo gratuito, fue utilizada para descontaminar el río Savannah (Estados Unidos) de tricloroeteno (TCE), un residuo de la fabricación de componentes de armas, donde era usado como desengrasante. Vertido en el suelo, el TCE contaminó las napas subterráneas, creando un problema ambiental muy serio. Para eliminar la contaminación se usó una bacteria que metaboliza metano y es capaz de degradar el TCE. La bacteria se multiplica inicialmente utilizando el metano inyectado en el suelo. Cuando este acaba, la bacteria consume TCE durante un tiempo, pasado el cual necesitará nuevamente metano. La repetición cíclica del proceso redujo la contaminación a niveles aceptables. Se considera que esta tecnología es viable desde el punto de vista comercial. Los problemas de contaminación que requieren biorremediación son muy puntuales, de modo que cada uno de ellos precisa de un tratamiento particular. Como no es un producto patentable, sino una prestación de servicios, la tecnología está en manos de organizaciones gubernamentales o de pequeñas empresas que actúan localmente (Figura 4). 205 Biotecnología FIGURA 4. Estrategias de biorremediación Para eliminar la sustancia indeseada del medio estimulan el desarrollo de microorganismos del ambiente o seleccionados Microorganismos del ambiente Microorganismos seleccionados Microorganismos genéticamente modificados (en sistemas confinados) MEDIO CONTAMINADO Optimización de los factores que estimulan la acción microbiana (estructura del suelo, pH, aceptores de electrones) Suplemento de nutrientes MEDIO DESCONTAMINADO Los derrames de petróleo Uno de los problemas más serios de contaminación ambiental es el derrame de petróleo en los mares, causado por accidentes graves (Prestige, Exxon Valdez, Torrey Canyon, Amoco Cadiz, Braer and Sea Empress y British Petroleum) o por situaciones bélicas (Guerra del Golfo). Las manchas de petróleo vertidas en el mar contienen compuestos tóxicos que representan una amenaza para la ecología marina y costera, afectando todas las formas de vida acuática y constituyendo un riesgo para la salud del consumidor. La formación de carbón y petróleo en las profundidades de la tierra fue posible porque, en condiciones anaerobias, la lignina y los hidrocarburos son compuestos químicos estables. Solo son biodegradados en condiciones aerobias. El petróleo derramado en el mar flota en la superficie, donde sus componentes volátiles evaporan rápidamente. Si no es recuperado por el hombre, el resto del derrame se dispersará con el movimiento de las olas, permanecerá en alta mar o será empujado hacia la costa. El petróleo derramado acabará siendo degradado por los microorganismos naturalmente presentes en el ambiente marino, pobre en nitratos y fosfatos. Por eso se agregan nutrientes a los dispersantes químicos (detergentes) o a las espumas de limpieza de las rocas de la costa. Se estima que hasta el momento se ha tratado por biorremediación el suelo de más de 30.000 206 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente sitios contaminados con petróleo, causados por derrames de tanques de almacenamiento. En 1971, A. Chakrabarty obtuvo la primera patente de un ser vivo (Pseudomonas putida), una bacteria genéticamente modificada que es capaz de degradar algunos de los componentes del petróleo. Lamentablemente, el uso de este organismo no tuvo mayor éxito en la limpieza del petróleo derramado en accidentes como el del Exxon Valdez en Alaska (1989). Las investigaciones actuales se centran en los microorganismos del ambiente y especialmente en Alcanivorax borkumensis, una bacteria capaz de eliminar 70% de los componentes del petróleo. La secuenciación de sus 2.755 genes, terminada recientemente, dará informaciones nuevas sobre sus rutas metabólicas y sus requerimientos de fósforo y nitrógeno. 5. LA RECUPERACIÓN DE RECURSOS NATURALES Los procesos biológicos también se usan para la extracción del petróleo y de metales (cobre, oro, uranio). El petróleo En la extracción de petróleo se usan técnicas especiales (recuperación mejorada del petróleo o EOR, del inglés enhanced oil recovery) que comprenden el uso de polímeros de origen microbiano (xantano), para aumentar la viscosidad y facilitar su bombeo. La introducción directa de los microorganismos en el pozo (MEOR, del inglés microbial enhanced oil recovery) parece menos interesante desde el punto de vista económico, pero eso puede cambiar cuando el petróleo empiece a agotarse. Los metales La extracción de metales solubilizados en las ácidas y oscuras aguas del río Tinto (Andalucía, España) remonta al dominio romano. Abandonadas durante siglos, las minas fueron explotadas a partir del siglo XIX por una empresa inglesa. En 1947, con el aislamiento de bacterias quimiotróficas del género Thiobacillus, se mostró que la acidificación de las aguas y la consiguiente solubilización de los metales era el resultado no solo de una reacción química, sino también de la acción bacteriana. 207 Biotecnología Las bacterias transforman los sulfuros metálicos insolubles en sulfatos solubles, mediante una reacción de oxidación que libera la energía requerida para su reproducción y crecimiento. La fijación de dióxido de carbono les brinda el carbono que necesitan para la síntesis de los componentes celulares. Sus únicos requerimientos son el oxígeno y pequeñas cantidades de otros nutrientes, como nitrógeno y fósforo. Este proceso, conocido como biolixiviación, se aplica especialmente a la extracción de cobre, oro, zinc, níquel y cobalto. La tecnología es relativamente simple y demanda poca inversión, ha sido adaptada a los países en desarrollo. En América Latina, se usa la biolixiviación para la extracción de cobre (Chile, México y Perú) y de oro (Brasil, Chile y Perú). La biominería Los Andes chilenos guardan las mayores reservas de cobre del planeta. En la época precolombina las culturas tiahuanaco e inca lo utilizaron en la producción de bronce, una aleación de cobre y estaño. Si bien durante el período colonial la producción de cobre fue baja, de 1820 a 1900 se extrajeron dos millones de toneladas. A fines del siglo XIX, los yacimientos con alta concentración de cobre comenzaron a mostrar indicios de agotamiento. En el siglo XX, los consorcios internacionales que dominan la tecnología necesaria para la extracción del cobre en bajas concentraciones asumieron el control de la industria del metal (Braden Copper Co., Kenecott Corporation, Chile Exploration Company). En 1971, el proceso de “chilenización” culminó con la nacionalización de la mineralización del cobre. Chile es el mayor productor de cobre del mundo. En 2004 generó 5,4 milones de toneladas que representaron ventas por un valor de 8.204 millones de dólares. La Codelco (Corporación Nacional del Cobre), una empresa estatal creada en 1976 y que emplea a 16.000 personas, es responsable por el 36% de la producción de cobre del país. El resto es producido por el sector privado. Las primeras experiencias de biolixiviación se realizaron entre 1950 y 1980 en Río Tinto (España), Cananea (México), Toromocho (Perú). A mediados de la década de 1980 comenzó la explotación de la mina de Pudahuel de la Codelco, usando tecnología nacional de biolixiviación. En el año 2000, la biohidrometalurgia se extendió a por lo menos otras cinco minas, y luego comenzaron a funcionar los primeros establecimientos que extraen cobre exclusivamente por biolixiviación (Cerro Colorado, Quebrada Blanca). 208 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente Las operaciones son apropiadas especialmente para minas de baja calidad o semiagotadas, así como para la recuperación del cobre en los refugios existentes. La oxidación biológica ocurre generalmente en montones y pilas, recuperándose entre el 75 y el 90% del cobre, en períodos que van de 6 a 12 meses, y a un costo muy bajo. Actualmente, el 5% de la producción chilena de cobre depende de la biolixiviación. En el desarrollo de estos procesos participaron universidades e institutos de investigación, además del sector productivo, con apoyo del gobierno y del PNUD (Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo). Las investigaciones actuales contemplan el uso de microorganismos termófilos (Sulfobolus) y la optimización del proceso de biooxidación. Recientemente fundada por Codelco y Nippon Mining & Metals Co. Ltd., la empresa BioSigma desarrolla estudios microbiológicos y genómicos, así como tecnologías para la producción de biomasa. 6. EL DIAGNÓSTICO DE CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Para emitir un diagnóstico de contaminación ambiental se debe monitorear el agua, el aire y el suelo. Las tecnologías incluyen el uso de indicadores biológicos, de biosensores y de técnicas inmunológicas y genéticas. Indicadores biológicos Son plantas y animales capaces de acumular metales pesados y contaminantes orgánicos persistentes. Es posible evaluar la contaminación ambiental midiendo la concentración del contaminante en un organismo específico. También se puede obtener una valoración indirecta a partir de otras variables, como el número de plantas y de especies microbianas, el número de individuos de esas especies, etcétera. Técnicas inmunológicas Estas técnicas emplean anticuerpos específicos, marcados o asociados a enzimas. Las técnicas inmunoenzimáticas, cuyos resultados pueden apreciarse simplemente por un cambio de color, resultan especialmente apropiadas para los ensayos de campo. Poco a poco, van sustituyendo las pruebas tradicionales que, además de ser lentas, exigen un equipamiento complejo (test para coliformes en agua). Los inmunoensayos de diversos tipos permiten el 209 Biotecnología monitoreo continuo, automatizado y barato de pesticidas como el dieldrin, el paratión y los PCB. Técnicas genéticas Se usan para identificar poblaciones microbianas. Como no sabemos cultivar en el laboratorio a la mayoría de los microorganismos del ambiente, una buena parte de la biodiversidad microbiana permanece desconocida. Sin embargo, las secuencias génicas correspondientes al ARN ribosómico (ARNr 16S) permiten identificar a numerosas especies en una muestra ambiental. La tecnología del ADN también ayuda a monitorear los cambios en las comunidades microbianas a medida que remueven los contaminantes, permitiendo que se detecte cualquier variación ambiental y se restauren rápidamente las condiciones óptimas del sistema. Micromatrices (microarrays) específicas permiten evaluar la expresión de los genes de una cepa o una comunidad microbiana, en relación a un agente ambiental (genosensores). Biosensores Estos dispositivos combinan varios componentes biológicos y electrónicos inmovilizados en un sustrato, generalmente en la forma de un chip. Algunos son muy selectivos, mientras que otros son sensibles a un espectro amplio de sustancias. El componente biológico puede ser una enzima, un anticuerpo o un microorganismo. Respondiendo a un estímulo ambiental, se verifica un cambio en sus propiedades, que es detectado óptica o electrónicamente, proporcionando una medida cuantitativa del contaminante (Figura 5). Bacterias o levaduras inmovilizadas pueden indicar la presencia de una determinada sustancia, ya sea porque la metabolizan o porque esta inhibe su propio metabolismo microbiano. Es especialmente interesante la utilización de organismos genéticamente modificados, asociando el promotor del gen de una enzima que reacciona con la sustancia buscada (arsénico, por ejemplo) a genes indicadores (luminiscencia, fluorescencia o producción de una sustancia coloreada). 210 Capítulo XI. Biotecnología y medioambiente FIGURA 5. Funcionamiento de un biosensor La señal aumenta o disminuye según la concentración del sustrato contaminante, que estimula o inhibe la acción del agente biológico Sustrato Membrana Biodetector inmovilizado El sustrato reacciona con el biodetector originando un producto específico Al detectar un producto específico, el transductor genera una señal eléctrica Amplificador Circuito Señal de salida (output) 211 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad El concepto de biodiversidad abarca la totalidad de la variación hereditaria en todos los niveles de organización biológica, es decir, desde los genes y cromosomas de una especie hasta el espectro de especies, de comunidades y de ecosistemas. En este capítulo analizaremos la importancia de la biotecnología para la biodiversidad vegetal. 1. LA DESAPARICIÓN DE LOS ECOSISTEMAS NATURALES Las plantas cultivadas que hoy nos resultan familiares se desarrollaron en un período de tiempo relativamente corto. El cultivo de plantas y la domesticación de animales acompañaron al hombre en su paso de una vida nómada a una vida sedentaria, un acontecimiento histórico que ocurrió varias veces y en diferentes lugares (Tabla 1). En el continente europeo, la agricultura se limitaba antiguamente a un pequeño número de especies, a las que se fueron agregando poco a poco plantas originarias de otros lugares, muchas veces obtenidas como trofeos de guerra (romanos, cruzados). Con el descubrimiento del Nuevo Mundo y los grandes viajes, los navegantes comenzaron a transportar especies de un TABLA 1. La aparición de la agricultura Planta cultivada Cebada Trigo Arroz Zapallo Maíz Época -13.000 -10.000 -10.000 - 9.000 - 7.000 Lugar Medio Oriente, valles del Eufrates y del Nilo Medio Oriente, valles del Eufrates y del Nilo Extremo Oriente, regiones fluviales de China e India América Central América Central 213 Biotecnología continente a otro. Se introdujeron en Europa el maíz, la papa, el tomate, el poroto, el girasol y el tabaco. Procedentes de diferentes lugares, el trigo, el garbanzo, el arroz, los cítricos, la banana, el café y la caña de azúcar se aclimataron a América (Figura 1). Junto con el tráfico de esclavos se inició el ciclo de la agricultura de las plantaciones, con el cultivo de plantas productoras de fibras (algodón, yute) y caucho, de azúcar (caña de azúcar), de aceite (maní, palma), de frutos (banana), de sustancias estimulantes (té, café, cacao), etc. En este marco histórico se definen claramente algunas de las características de la agricultura moderna, dirigida a satisfacer las necesidades de los consumidores, no solo en la producción de alimentos, sino también en la generación de insumos industriales. En relación a los animales, la historia sigue un curso parecido que comienza en Asia con la domesticación del perro, a fines del paleolítico. Entre 8.000 y 7.000 a.C. fueron domesticadas la cabra y la oveja (Mesopotamia), el buey y el cebú (Mesopotamia, Egipto), el chancho (China) y el gato (Mediterráneo). La domesticación del caballo ocurriría bastante más tarde (Ucrania, 4.000 a.C.). En el continente americano, antes de la llegada de los europeos, los pueblos originarios criaban llamas, alpacas, vicuñas, pavos y cuises. Después de la Conquista, los europeos llevaron al Nuevo Mundo sus animales domésticos: caballos, vacas, cerdos y perros. Estos se multiplicaron rápidamente, devastando la flora local. Las grandes planicies se tornaron un lugar ideal para la cría de ganado. En el transcurso de los siglos siguientes, la productividad agrícola aumentó significativamente con la introducción de nuevas prácticas agronómicas y, en especial, con el mejoramiento genético de los cultivos. Sin embargo, al reducir el número de especies cultivadas, el progreso de la agricultura tuvo un impacto negativo sobre la biodiversidad. Con la expansión del hombre sobre la Tierra, los ecosistemas naturales fueron reemplazados por los ecosistemas agrícolas, que hoy ocupan el 35% de la superficie terrestre disponible, concentrando la mitad de la fuerza de trabajo humana, distribuida irregularmente según el grado de desarrollo alcanzado en cada región (Figura 2). La desaparición de los ecosistemas naturales puede ser evitada con la práctica de una agricultura y una pecuaria sustentables, que permitan la conservación y la manutención de los suelos, del agua, de los procesos ecológicos y de los recursos genéticos. 214 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad FIGURA 1. Transporte de los cultivos de un continente a otro Las grandes navegaciones modificaron el perfil de las plantas cultivadas en los diferentes continentes 1: Trigo, avena, vid, garbanzo. 2: Zapallo, poroto, maíz, pimienta, tabaco, papa, tomate. 3: Café, ñame. 4: Ananá, maní, cacao, caucho, mandioca, maíz, pimienta, tabaco, cinchona, tomate. 5: Cítricos, banana, soja, caña de azúcar, arroz. 6: Ananá, maní, cacao, caucho, mandioca, maíz, tomate, algodón, palta 1 2 5 6 3 4 FIGURA 2. Área dedicada a la producción agrícola Al estar cubiertos por océanos, mares, desiertos, montañas y regiones polares, los dos tercios de la superficie terrestre son inhabitables por el hombre. En el tercio restante, representado en el esquema, el área dedicada a la producción agrícola (granos y cereales + pasturas y praderas + cultivos diversos) corresponde al 35% de la superficie habitable Cultivos diversos (1%) Praderas y pasturas (24%) Otros usos (34%) Granos y cereales (10%) Bosques (31%) 215 Biotecnología 2. EL HOMBRE Y LAS PLANTAS Las plantas alimenticias La dependencia de un limitado número de especies Las plantas ocupan un lugar preponderante en la dieta del hombre. Aunque la alimentación incluya productos animales (carne, leche, huevo) y acuáticos (algas, pescados, mariscos), la mayor parte de las proteínas ingeridas por buena parte de la humanidad son de origen vegetal (Tabla 2). Si bien los cereales responden por el 75% de las necesidades calóricas, el 20% está cubierto por tubérculos, raíces, plantas oleaginosas y azucareras. Las hortalizas y frutas aportan solo una pequeña cantidad de calorías, aunque son importantes por otros valores nutritivos. De hecho, la mayor parte de la humanidad vive con una dieta monótona, en la que el 90% de los alimentos pertenece a un pequeño grupo de 20-25 especies, que incluye a la banana, la mandioca, el maíz, el maní, algunas leguminosas, el mijo, la papa, el arroz, el sorgo, la batata, la soja y el trigo (Figura 3). TABLA 2. Los principales tipos de vegetales que componen la dieta humana Vegetales Cereales Plantas ricas en proteínas Raíces y tubérculos Plantas oleaginosas Plantas productoras de azúcar Frutas y hortalizas Ejemplos Trigo, arroz, maíz, centeno, avena, cebada, sorgo, etcétera Diversos tipos de poroto, lenteja, garbanzo, maní, arveja, etcétera Papa, batata, mandioca, zanahoria, remolacha, etcétera Soja, algodón, girasol, colza, canola, maní, etcétera Caña de azúcar, remolacha azucarera Banana, dátil, coco, aceituna, palta, mango, uva, fruta del pan, col, coliflor, tomate, pimienta, ocra, berenjena, pepino, zapallo, etcétera 216 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad FIGURA 3. Los vegetales y la alimentación humana A pesar de existir una gran diversidad de plantas comestibles, la mayor parte de los alimentos (90%) consumidos por la humanidad se restringe a un pequeño grupo de especies Especies comestibles Especies que ya fueron consumidas como alimento Especies cultivadas Especies cultivadas comercialmente Especies esenciales en la dieta humana 2.300 10.000 – 80.000 5.000 150 20-25 La producción de alimentos En el año 2011, la población humana llegó a 7 mil millones de personas, y se calcula que en 2050 será de 9,3 mil millones. Frente a estos números, cabe preguntarnos si la producción de alimentos será suficiente para las necesidades de toda la población. En los últimos treinta años, la producción de alimentos aumentó más del 35%, gracias a la selección de variedades más productivas y al mejor manejo de los cultivos. Dentro del marco de la llamada Revolución Verde, se destaca la duplicación de la producción de los cereales, aumento que fue acompañado por una reducción significativa de los precios. Aunque la población creció en casi dos mil millones de personas entre 1980 y 2000, el desarrollo tecnológico alcanzado permitió alimentar a la humanidad. Eso no impide que más de 4 mil millones de personas vivan en la pobreza. De estas, aproximadamente 24.000 mueren por día de hambre mientras que 800.000, principalmente niños y mujeres, sufren de desnutrición. La carencia de vitamina A afecta a 14 millones de niños y la falta de hierro, a mil millones de personas. A pesar de haber alimentos suficientes, estos no llegan a 1,2 mil millones de personas que viven con menos de un dólar por día, ni a otros dos mil millones que viven con menos de dos dólares por día. La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) estima que en los próximos treinta años la producción 217 Biotecnología de alimentos tendrá que aumentar en 60%, para responder a las necesidades de 2 mil millones más de personas. El 90% de estas personas vivirá entre los trópicos, que es donde se encuentra la mayoría de los países en desarrollo. La falta de alimentos podrá agravarse porque, salvo algunas excepciones (té, café, cacao, banana, etc.), los alimentos se consumen en el lugar donde se producen. Pero además, porque en función de la tendencia migratoria hacia las grandes ciudades, aumentará el número de personas que comprarán alimentos en lugar de producirlos. Aunque ya hayan aparecido señales de erosión y agotamiento del suelo en varios lugares, no hay muchas posibilidades de expandir la frontera agrícola. Una buena parte de la tierra inutilizada se encuentra en regiones poco fértiles, distantes, sin infraestructura o cubiertas de bosques. Su ocupación aceleraría la degradación de ecosistemas, con pérdida de la biodiversidad y el riesgo de aparición de enfermedades. En este sentido, la humanidad tiene hoy dos grandes desafíos: aumentar la productividad de los sistemas agrícolas y reducir la desigualdad en el acceso a los alimentos. Si por un lado el desarrollo tecnológico es indispensable, la historia de los últimos años demuestra que no habrá solución para el problema del hambre sin cambios sociales y políticos. Las plantas comerciales La producción de insumos Hay varias plantas que se cultivan y comercializan, a veces internacionalmente, como materia prima para diversas industrias. Del mismo modo que el oro, la carne, el petróleo y el gas natural, los granos son considerados una commodity, término que designa productos equivalentes, independientemente de quien sea el productor. Sus precios se establecen en mercados futuros, que fijan la cantidad y la calidad de la commodity que será comercializada. De todas las plantas que figuran en la Tabla 2, la soja merece una atención especial. En los últimos años, su cultivo alcanzó un enorme éxito comercial que puede atribuirse a la extraordinaria versatilidad de sus productos. El grano y los brotes pueden consumirse directamente. La harina de soja es usada en la manufactura de galletas, golosinas, panes, pastas, bebidas, etc. Los granos fermentados se utilizan en la cocina oriental (sopa miso, tempeh). 218 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad La fracción proteica del grano puede reemplazar como “carne de soja” a la proteína de origen animal. También se incluye en la elaboración de productos dietéticos, cremas, pastas, copos de cereales, comida para bebés, bebidas, etc. Y como “torta” de soja en las raciones animales. Por otro lado, la fracción proteica se usa en la composición de adhesivos, reactivos analíticos, pegamentos para madera, emulsión asfáltica, productos de limpieza, cosméticos y sustitutos del cuero y de plásticos. El aceite extraído del grano se usa para cocinar y condimentar ensaladas, formando parte también de salsas, aderezos, mayonesas, coberturas de repostería, bebidas, patés y margarinas. También se lo utiliza como aceite industrial, anticorrosivo y antiestático, en la composición de agentes dispersantes y antiespumantes, sellantes, cosméticos, aislantes, colorantes y tintas. Actualmente, el 80-90% del aceite de soja producido proviene de cultivos transgénicos. Así como la soja, el maíz presenta un espectro de aplicaciones enorme, tanto en la alimentación como en la industria. No resulta sorprendente que los primeros cultivos transgénicos comercializados correspondan a cuatro especies industriales: la soja, el maíz, el algodón y la canola (Tabla 3). La explotación de los bosques Los bosques naturales tienen un valor intrínseco importantísimo para la conservación de la biodiversidad. Sin embargo, aún se sigue usando la leña como combustible, y la explotación de maderas representa un mercado global de aproximadamente US$ 500 mil millones. Los bosques también representan una fuente de materia prima para la industria de papel y celulosa, por eso no sorprende que las investigaciones se lleven a cabo principalmente en Estados Unidos, Francia y Canadá, y se centren fundamentalmente en los géneros Pinus, Eucalyptus, Picea, Populus, Quercus y Acacia. Las biotecnologías facilitan la reforestación a través de la micropropagación y de la siembra clonal de árboles más productivos y de crecimiento rápido. La secuenciación de genomas (Pinus, Eucalyptus) y el uso de marcadores moleculares permiten seleccionar alelos en genes que controlan la variación fenotípica. Las técnicas de ingeniería genética pueden reducir la lignina en 45-50%, disminuyendo la necesidad de tratamientos altamente contaminantes. La tecnología también se aplica a la obtención de árboles que crezcan en suelos áridos (salinidad, acidez). Varios países ya realizaron experiencias de transformación genética en árboles. La tecnología será fundamental para alcanzar el objetivo de refores219 Biotecnología TABLA 3. Productos industriales de origen vegetal Producto Biocombustibles Fibras textiles Aceites y grasas Esencias y fragancias Látex Ceras Resinas Condimentos Taninos Tinturas Plantas industriales Soja, algodón, colza, canola, maní, girasol, dendé, babasú, ricino, sésamo, olivo, lino Algodón, sisal, lino, cáñamo, yute, coco, ramio, piasaba Caña de azúcar, remolacha azucarera, cereales, soja, ricino, etcétera Azafrán, menta, citronela, geraniol, eugenol, cedrón pasto Caucho, zapote Carnaúba, jojoba Bálsamos y gomas Pimienta, nuez moscada, canela, jengibre, clavo de olor Acacia, quebracho, eucalipto Pau-brasil, palo campeche, achiote tar el 23% del área de China hasta 2020. Mientras tanto, se han plantado 300-500 hectáreas con álamos (Populus) resistentes a insectos. El álamo lleva un gen que codifica para la toxina de Bacillus thuringiensis. La floricultura Otro sector interesante, desde el punto de vista comercial, es el cultivo de plantas ornamentales y flores, donde se utilizan comúnmente técnicas de cultivo de tejidos (micropropagación y embriogénesis somática), así como la haploidización y la fusión de protoplastos. La producción comercial de orquídeas depende actualmente de las técnicas de cultivo in vitro. Buena parte del desarrollo de las plantas ocurre en condiciones de laboratorio muy controladas, que permiten la obtención de plantines sanos y variedades nuevas. Colombia es el segundo país exportador de flores, después de Holanda. El valor de las exportaciones llega a US$ 580 millones y sus principales destinos son los Estados Unidos y la Unión Europea. Cortes como el clavel y la rosa representan el 60% del total exportado. El resto está diversificado entre 220 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad 50 especies, destacándose la alstroemeria, el crisantemo pompón y la gerbera. La industria emplea a cerca de 60.000 mujeres y se concentra en las sabanas cercanas al aeropuerto de Bogotá. Después de la cafeicultura, la floricultura es la actividad agrícola que más empleos genera en el país. En un mercado en expansión, donde la producción de material de propagación (plantines, semillas y bulbos) tiende a concentrarse en grandes empresas internacionales, Brasil exporta flores y plantas tradicionales (crisantemos, rosas, gladiolos, claveles, gerberas, etc.) y plantas tropicales (heliconias, bromelias, orquídeas, anturios, etc.) en diferentes modalidades (flores de corte, flores en floreros, plantas verdes y plantas para paisajismo). Argentina exporta rosas, claveles y palmeras a Miami y Milán, ciudades desde donde se distribuyen internacionalmente. También exporta bulbos de tulipán y una variedad de rosa oscura (“rosa negra”) sin espinas. El Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) y la Japan International Cooperation Agency (JICA) participan de un programa de cooperación para el desarrollo de la floricultura y la producción frutihortícola. Aproximadamente el 75% del mercado mundial de flores corresponde a claveles, rosas, crisantemos y gerberas, especies en las que faltan los pigmentos responsables de la coloración azul (antocianinas). Una empresa australiana (Florigene) y una japonesa (Suntori) transfirieron un gen de petunia al clavel y al crisantemo, ofreciendo al mercado flores “innovadoras”, como los claveles (Dianthus caryophyllus L.) de color malva (Moondust) o violeta (Moonshadow) y los crisantemos azules. Estas plantas se comercializan en diversos países, incluidos los de la Unión Europea. En Colombia, los claveles azules son cultivados desde 2000, para exportación, por Flores Colombianas SA, una filial de la empresa holandesa Floriyin. En 2009 fue autorizada la comercialización interna del cultivo de rosas y crisantemos azules. Las principales líneas de investigación actuales son el desarrollo de fragancias y la transferencia a varias especies ornamentales de genes que prolonguen la conservación de las flores. Las plantas medicinales Hasta el momento se han identificado unas 20.000 especies de plantas medicinales. Para el 80% de la población rural, que no tiene acceso a los medicamentos comerciales, esas plantas son el único recurso posible para tratar sus enfermedades. 221 Biotecnología La mitad de las drogas medicamentosas que se usan actualmente se extrae de las plantas silvestres (no cultivadas). En otros casos, el principio activo ha sido identificado y sintetizado como, por ejemplo, el ácido acetilsalicílico de la fórmula de la aspirina y de otros productos análogos. Este tiene un efecto comparable al del ácido salicílico extraído de la corteza del sauce, que se administra desde la Antigüedad como analgésico y antitérmico, en té y pociones. Nuestros medicamentos derivan de 250 especies de plantas, que representan el 0,1% de las 250.000 plantas vasculares. La búsqueda de nuevos medicamentos comienza por la colecta de las plantas y la extracción de sustancias químicas que se someten a ensayos de actividad biológica. Encontrar un principio activo puede traer ganancias enormes, a pesar de solo llegar al mercado uno de cada 10.000 productos ensayados. Entre los fitoquímicos exitosos están: la diosinina (para la producción de anticonceptivos), la vincristina y vinblastina (antitumorales), la morfina (anestésico) y el curare (anestesia en cirugía). 3. LA BIODIVERSIDAD AMENAZADA La erosión genética La pérdida de biodiversidad acarrea también la erosión genética, esto es, la pérdida de variación genética. Los datos son aterradores: 11 millones de hectáreas/año de bosques destruidos, avance de la desertificación en 27 millones de hectáreas/año, desaparición de 30 a 300 especies por día. La destrucción de los ecosistemas, la disminución del número de especies existentes y la pérdida de la variabilidad genética son daños irreparables. Para tener idea de su gravedad, basta considerar que el mejoramiento genético de una línea cultivada depende de los genes de las variedades silvestres. La amenaza de la erosión genética aparece claramente en relación a las plantas alimenticias, que corresponden a un número restricto de cultivos, uniformizadas por las prácticas agrícolas modernas. En el inicio del siglo XX existían en India más de 30.000 variedades nativas de arroz, de las cuales probablemente hoy no queden más que cincuenta. También resulta preocupante el futuro de las plantas medicinales. Las “mejores” plantas son recolectadas, mientras que las menos interesantes quedan en el terreno, produciendo las semillas que darán origen a las próximas generaciones. Poco a poco, gracias a un tipo de selección negativa, la erosión genética aumenta. 222 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad La expansión del agronegocio Por ahora las plantas genéticamente modificadas se limitan a un número reducido de especies y características introducidas, principalmente tolerancia a herbicida y resistencia a insectos. Con la globalización de los cultivos genéticamente modificados, surgen varios cuestionamientos relativos a su posible impacto sobre la biodiversidad. Podemos imaginar varios escenarios, con diferentes consecuencias para los ecosistemas y su biodiversidad. En el primero, la expansión del agronegocio afecta los espacios dedicados a otros cultivos, pasturas y bosques. En el segundo, al aumentar la productividad agrícola, las variedades transgénicas disminuirían la presión sobre las áreas no cultivadas, especialmente los bosques. La materialización de uno u otro, así como la de cualquier escenario intermedio, dependerá de las presiones socioeconómicas y de las políticas públicas relativas a la producción de alimentos, exportaciones y protección del medioambiente. Pero no depende de la transgénesis en sí misma, porque los escenarios serían los mismos si en vez de cultivos genéticamente modificados se emplearan cultivos mejorados por métodos tradicionales. La expansión de un pequeño número de especies en monocultivos representa sin duda una pérdida de la biodiversidad existente en el ambiente natural. Sin embargo, la comercialización de un único tipo de semilla no significa necesariamente la total homogenización del material genético. El mercado de semillas difiere de otros mercados globalizados, como el de bebidas gaseosas, el de la electrónica o el de la informática, que generan productos estándar. Ninguna semilla está presente o se comercializa en todo el mundo, creándose siempre variedades adaptadas a contextos específicos. Estas variedades o cultivos se distinguen entre sí por sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas o moleculares, heredadas genéticamente. Por ejemplo, entre 1998 y 2003 se registraron en el Servicio de Protección de Cultivares de Brasil cerca de 400 cultivos de soja (Glycine max (L.) Merrill). La estrategia es hoy la misma para las plantas transgénicas, ya que hay actualmente en ese país una oferta de más de 40 variedades de soja tolerante al herbicida. La transgénesis La relación entre la transgénesis y la estructura de las especies resulta perturbadora para algunas personas, como algunos activistas de movimientos que se oponen a esta tecnología. Existe el temor de que la transferencia de genes 223 Biotecnología modifique el patrón de las especies, quebrando el orden establecido en la Creación e instalando algo así como un caos genético. En la mitología, este miedo se representa en la quimera, mezcla de león, cabra y dragón, que vomitaba fuego y que simbolizó el Mal en el Medioevo. Figuras con partes de hombre, animal y planta se encuentran representadas magistralmente por el pintor flamenco Hieronymus Bosch, en su cuadro El jardín de las delicias (1510). Por ser de cuño religioso y esencialmente subjetivo, esta visión no corresponde al conocimiento actual que tenemos sobre las especies, que son unidades morfológicas y reproductivas esencialmente dinámicas. Sin fundamentos científicos, el creacionismo ignora los innúmeros estudios sobre la evolución de los seres vivos y los descubrimientos sobre los genomas, que muestran que las especies comparten un gran número de genes. Por otro lado, cabe recordar que muchas plantas son un invento reciente del hombre. Un ejemplo es la frutilla, resultado de un cruzamiento accidental, ocurrido en el siglo XIX en un Jardín Botánico de Francia, entre dos variedades que no coexisten en la naturaleza: la norteamericana Fragaria virginiana y la sudamericana Fragaria chiloense. Otro ejemplo es el triticale, un híbrido de trigo y centeno obtenido en el laboratorio a fines del mismo siglo. Considerado al principio como una curiosidad científica, sus propiedades agronómicas se desarrollaron y mejoraron más recientemente, y hoy es usado en la composición de panes y galletas y de raciones animales. También es vendido en algunos almacenes de productos naturales. 4. LA PROTECCIÓN DE LA BIODIVERSIDAD Los centros de diversidad A comienzos del sigo XX, el geógrafo y genetista ruso Nikolai I. Vavilov recorrió 64 países, en más de 100 expediciones, recolectando semillas, granos, tubérculos, etc. En esos viajes, Vavilov observó que en algunos lugares la variabilidad de una planta era mucho mayor que en otros. Para Vavilov, una diversidad mayor indicaba que la planta había sido cultivada desde hacía mucho tiempo en ese lugar. En la Cordillera de los Andes, por ejemplo, la población local identifica con un nombre particular a cada una de las 1.000 o más variedades de papa que existen. Esto nos sugiere que el centro de origen se encuentra en esa región. A partir de observaciones similares, Vavilov localizó seis a ocho centros geográficos donde, presumiblemente, se habría originado la agricultura. 224 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad Vavilov no llegó a completar su obra, falleció en 1943 en la prisión de Saratov, donde fue encarcelado por oponerse a una interpretación ideológica de la heredabilidad y defender el concepto mendeliano de la herencia. Cabe recordar que en la URSS (Unión de Repúblicas Socialistas Soviéticas), durante el período 1929-1964, la genética fue considerada una teoría reaccionaria y burguesa. Hoy se admite que la diversidad de las plantas cultivadas y silvestres es bastante mayor en algunos puntos geográficos, y que algunos biomas son más propicios para la agricultura que otros. No siempre los centros de diversidad coinciden con los centros de origen, porque las migraciones humanas permitieron la aparición de centros de diversidad secundaria. En estos, las especies se seleccionaron en función de las prácticas agrícolas y por la presión ambiental, volviéndose tolerantes a las condiciones ambientales y resistentes a las enfermedades locales. La teoría de Vavilov fue extremamente importante para los estudios evolutivos de las plantas cultivadas y, especialmente, para la conservación de la biodiversidad. Hoy se sabe que la biodiversidad debe buscarse en los centros de origen y diversidad, la mayoría de los cuales se encuentra dentro de la franja limitada por los trópicos, que coincide con la ubicación geográfica de la mayoría de los países en desarrollo (Tabla 4). La conservación de la biodiversidad Una de las consecuencias del proceso evolutivo es la extinción de especies. El número de especies vivas no llega al 1% de las que alguna vez poblaron la Tierra. El aspecto más preocupante no es tanto la aparición y desaparición de especies como la velocidad a la que está ocurriendo, porque caracteriza una extinción en masa causada por el hombre. Consideremos el caso de la Mata Atlántica (Brasil), cuya biodiversidad es mayor que la de Amazonia. Se encuentra tan devastada que solo quedan algunos pedazos de la floresta original y su conservación depende de los corredores que puedan establecerse entre los fragmentos. Con el auspicio del Programa de las Naciones Unidas para el Medioambiente (UNEP), la Convención sobre la Diversidad Biológica entró en vigor en 1993. Promueve la cooperación internacional para la conservación de la diversidad biológica, el uso sustentable de los recursos biológicos y la distribución justa y equitativa de los beneficios que resultan del uso de los recursos genéticos. La conservación de la biodiversidad y de los recursos genéticos significa 225 Biotecnología TABLA 4. Centros de diversidad y cultivos originarios Región América Central y del Norte América del Sur Cultivos Maíz, amaranto, poroto, batata, mandioca, algodón, sisal, papaya, palta, guayaba, pimienta, zapallo, tomate, vainilla, cacao, girasol, frutilla, nuez pecan, tabaco, etcétera. Amaranto, maní, poroto, lupino, papa, mandioca, maní, algodón, cayú, chirimoya, ananá, papaya, palta, frutilla, pimiento, zapallo, coca, mate, caucho, etcétera. Limón, pepino, arroz, melón, mango, caña de azúcar, algodón, cáñamo, coco, arroz, árbol del pan, naranja, mandarina, banana, plátano, nuez moscada, berenjena, etcétera. Soja, colza, litchis, pera, durazno, repollo, té, jengibre, ginseng, alcanforero, etcétera. Café, melón, sandía, ñame, sorgo, etcétera. Alfalfa, trigo, avena, centeno, cebada, rabanito, zanahoria, arveja, garbanzo, lenteja, aceituna, higo, almendra, vid, manzana, remolacha, ajo, cebolla, azafrán, amapola, regaliz, etcétera. India y Sudeste Asiático China África (Etiopía) Asia Menor mucho más que salvarlos de la extinción. El objetivo es conservar suficiente diversidad dentro de cada especie como para garantizar que su potencial genético pueda emplearse en el futuro. De un modo general, en todos los cultivos actuales se han incorporado genes provenientes de bancos genéticos o de variedades salvajes conservadas por pueblos que practican una agricultura tradicional. La producción comercial del tomate, por ejemplo, sería imposible sin la contribución de genes silvestres de América Latina. Gracias a los trigos salvajes disponemos de variedades resistentes a los hongos, a la sequía, al calor y al frío. La resistencia a cuatro enfermedades que tiene el arroz cultivado se debe a una variedad encontrada en India central. La conservación in situ La biodiversidad puede conservarse in situ mediante la protección ambiental de una región determinada (unidades de conservación ambiental). Pero además de mantener la dinámica evolutiva de las especies, se deben contemplar las necesidades de la población, creando reservas de desarrollo sustentable 226 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad (Mamirauá, Brasil; Sian Ka’an, México). En Costa Rica, una ley de 1996 compensa a quienes conserven o aumenten el área de floresta dentro de sus propiedades. Una nueva tendencia es el retorno a la vida salvaje, mediante la reintroducción de animales como el oso, en los Pirineos, o el lobo, en las florestas europeas. Otros proyectos contemplan la creación de comunidades de grandes mamíferos. En Oorstvaarderplassen (Países Bajos), los animales extinguidos son reemplazados por otros próximos desde un punto de vista sistemático. El auroch (Bos primigenius), extinguido en 1627, ha sido sustituido por el auroch de Heck, creado en 1920 por cruzamiento de las más antiguas razas de bovinos europeos. El poni konik, de Polonia, ocupa el lugar del tarpán, un caballo salvaje extinto. Hay un proyecto análogo para recrear las estepas de tundra anteriores a la última era glacial (parque pleistocénico, Rusia). La conservación ex situ y los bancos de germoplasma La conservación ex situ comprende una colecta de muestras representativas de una población y su mantenimiento en bancos de germoplasma y jardines botánicos, en la forma de semillas, estacas, plantas enteras, etc. El método se aplica especialmente a las plantas cultivadas que se reproducen por semillas, dependiendo del período de conservación de la especie y de la técnica utilizada. La criopreservación permite conservar las semillas durante largos períodos de tiempo: 10 a 30 años a una temperatura de 5 0C; un siglo a una temperatura entre -18 0C a -20 0C. Como la viabilidad de las semillas decae con el tiempo, estas son colocadas para germinar periódicamente y obtener nuevas plantas y semillas frescas. Además de facilitar el acceso a la información de los mejoradores, la criopreservación tiene la ventaja de conservar el material en un espacio reducido y con cuidados intensivos. Sin embargo, debido a las limitaciones del tamaño de las muestras, la conservación de los recursos fitogenéticos puede ser insuficiente. El costo es altísimo e inclusive la colección de la Estación Experimental Vavilov (San Petersburgo, Rusia), que sobrevivió a la Segunda Guerra Mundial, enfrenta hoy grandes dificultades económicas. Las técnicas de cultivo de tejidos posibilitan la conservación de plantas de multiplicación vegetativa (raíces como la mandioca, tubérculos como la papa, banana, caña de azúcar) y de plantas cuyas semillas no resisten a la desecación (coco, cacao, cítricos, café, dendé, caucho y el 70% de los árboles de los bosques tropicales, etc.). Con la criopreservación de tejidos, el material se mantiene por tiempo indeterminado. Por otro lado, se han incorporado 227 Biotecnología las técnicas de análisis de ADN tanto a los estudios de diversidad genética como al control de la duplicación de muestras. Con el mapeo del genoma de las plantas en las que se basa la producción agrícola, y la disponibilidad de los datos en el dominio público, se abren nuevas perspectivas para la conservación de los recursos genéticos. Hoy existen más de 1.400 bancos de genes y de germoplasma con más de 6.000.000 muestras. Los principales se encuentran en Estados Unidos, China, Alemania y Brasil. En un lugar de Noruega –considerado a salvo de mudanzas climáticas, desastres naturales y guerras–, a mil kilómetros del Polo Norte, fue creado recientemente el banco de semillas de Svalbard, con capacidad para almacenar 4,5 millones de muestras de 500 semillas. La biodiversidad debe ser investigada en los centros de origen y diversificación. Debido a su localización geográfica, resulta preocupante la reciente multiplicación de los conflictos bélicos (Afganistán, Irak) que afectan no solo a la población local, sino que también comprometen su futuro. Asia Menor es una región de gran biodiversidad y riqueza genética. Los bancos de germoplasma pueden ayudar también a restaurar a las agriculturas arrasadas por conflictos bélicos. En Ruanda, un país en que el 90% de las personas dependían de la agricultura y donde se conocían más de 600 variedades de poroto, el conflicto bélico entre grupos étnicos rivales causó en 1994 la muerte de 800.000 personas y la migración forzada dos millones de personas. Las organizaciones internacionales conservaron, en bancos de germoplasma, semillas que pueden ser esenciales para la reconstrucción del país. El CGIAR y el Centro Internacional de la Papa Una de las organizaciones dedicadas a la conservación de la biodiversidad y al desarrollo agrícola de los países en desarrollo es Future Harvest, una iniciativa con 16 centros localizados en diversos lugares, cuya estructura descentralizada favorece la difusión de la información. Los centros son mantenidos por los gobiernos de 165 países, fundaciones privadas y organizaciones internacionales y regionales que integran el CGIAR (Consultative Group on International Agricultural Research), auspiciado por la FAO (Food and Agriculture Organization). Los centros del CGIAR en América Latina son: el Centro Internacional para el Mejoramiento del Maíz y el Trigo (CIMMYT) en México, el Centro Internacional de la Papa (CIP) en Perú y el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en Colombia. 228 Capítulo XII. Biotecnología y biodiversidad La papa es originaria de la región andina, y se la consume desde hace más de 8.000 años. Llegó a Europa en el siglo XVI y tres siglos después era uno de los pocos alimentos consumidos por la población más pobre. En Irlanda, cuando el cultivo fue atacado por una plaga, murieron un millón de personas y una buena parte de la población tuvo que emigrar. En muchos países, sus habitantes dependen de la papa y de otros tubérculos (batata) para su alimentación, por ser relativamente ricos en energía y nutrientes. Actualmente, la papa es el cuarto cultivo más importante del mundo, con una producción anual de 300 millones de toneladas. El Centro Internacional de la Papa (CIP) preserva a este cultivo (Solanun tuberosum), a la batata (Ipomoea batatas) y a nueve tubérculos y raíces andinas (oca, ulluco, mashua, arracacha, yacon, achira, ahipa, maca, mauka). El banco de germoplasma de papa incluye muestras de una centena de especies silvestres colectadas en ocho países de América Latina, además de las variedades cultivadas tradicionalmente por la población andina. Entre los objetivos del CIP se encuentra el mejoramiento de la calidad nutricional y de la resistencia a enfermedades y a condiciones climáticas adversas como la sequía y la helada. El centro utiliza la biotecnología para crear formas adaptadas a las condiciones locales y para acelerar la producción, distribuyendo las variedades tradicionales y mejoradas en la forma de semillas, tubérculos o vitroplantas. Actualmente, también promueve el uso comercial de las variedades autóctonas: distribución en paquetes (T’ikapapa), elaboración de “chips” u “hojuelas” a partir de rodajas de diversas formas. El Protocolo de Cartagena de Bioseguridad El Protocolo de Cartagena de Bioseguridad, que entró en vigor en septiembre de 2003, suplementa la Convención sobre la Diversidad Biológica. El acuerdo contempla el riesgo potencial derivado del transporte y manejo de todos los seres vivos modificados, que puedan tener un efecto adverso en la conservación y en el uso sustentable de la diversidad, tomando en cuenta también los riesgos potenciales para la salud humana. Frente a la aprensión suscitada por el tránsito y movimiento de los organismos transgénicos a través de las fronteras, los países miembros determinaron que la expresión “puede contener OGM” identifique toda carga proveniente de cultivos transgénicos destinada a la alimentación, forraje o procesamiento. Sin embargo, aún falta consenso sobre este rótulo y algunos países exigen que sea reemplazado por “contiene OGM”, agregando información sobre el transgén. El Protocolo no cubre los productos derivados de 229 los transgénicos (por ejemplo, papel producido a partir de árboles transgénicos), ni los transgénicos productores de fármacos, que son regulados por otras organizaciones. Mediante el Protocolo de Cartagena se establece la cooperación internacional a fin de ayudar a los países en desarrollo a utilizar la biotecnología con seguridad y a regularla eficientemente. Los gobiernos miembros se proponen promover la transferencia de tecnología, conocimientos y recursos, mediante el entrenamiento científico y técnico correspondiente. Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura 1. LA EVOLUCIÓN DE LAS PRÁCTICAS AGRÍCOLAS Antes de 1960 La agricultura es la ciencia y el arte de manejar el crecimiento de plantas y animales para uso humano. Aunque las prácticas agrícolas y las plantas cultivadas se hayan desarrollado en un período corto de la historia evolutiva de los vegetales, las plantas actuales se parecen muy poco a sus ancestros silvestres (Figura 1). Hasta la Edad Media se utilizaron herramientas rudimentarias. Las prácticas agrícolas se tornaron más eficientes gracias a algunas innovaciones, como el aprovechamiento de la fuerza de tracción animal, la invención de los molinos, la práctica de descanso de los suelos y la construcción de sistemas de irrigación, algunos de los cuales persisten hasta el presente. Más tarde, en el siglo XVIII, las actividades agrícolas y la cría de animales se integraron en una “nueva agricultura” que, además de incluir el uso del estiércol como abono, promovió la rotación entre los cultivos de gramíneas, leguminosas y plantas forrajeras. El progreso científico y tecnológico tuvo una enorme incidencia sobre la agricultura del siglo XIX. Los cruzamientos selectivos originaron nuevas variedades y razas que se comercializaron internacionalmente (1850). La sociedad comenzó a preocuparse por las enfermedades de los cultivos y del ganado (ántrax de las ovejas, cólera de las aves, enfermedades del gusano de seda, etc.), y a interesarse por los requerimientos nutricionales de las plantas. Con la llegada de la máquina a vapor y las primeras aplicaciones de la electricidad se inició la mecanización de la agricultura. En el siglo XX la maquinaria agrícola reemplazó a la tracción animal. Al disminuir la necesidad de forraje, otros cultivos sustituyeron al heno y a la avena. El tractor se difundió rápidamente. Con el redescubrimiento de las leyes de Mendel y la teoría cromosómica de la herencia, el mejoramiento vegetal entró en una nueva etapa. Por cruzamiento entre dos líneas puras de maíz se obtiene un híbrido semejante a las líneas parentales, pero de mejor calidad (heterosis o vigor híbrido). Plantas más productivas y suficientemente homogéneas facilitan la cosecha mecánica. 231 Biotecnología FIGURA 1. Origen del maíz Los primeros maíces, que datan de 5.000 a 7.000 años atrás, eran bastante más pequeños que los actuales. El cruzamiento accidental con el teosinte, una hierba que aún existe en la naturaleza, habría dado origen al maíz moderno, aproximadamente hace unos 3.500 años (<http://www.learner.org/courses/essential/life/session5/closer1.html>) Los maíces híbridos comenzaron a ser desarrollados en Estados Unidos a partir de 1920. Aparecieron nuevas empresas comerciales que, además de seleccionar las líneas parentales y realizar los cruzamientos correspondientes, venden las semillas al agricultor. La primera de este tipo fue Hi-Bred Corn Company, transformada más tarde en Pioneer Hi-Bred. El agricultor tiene que comprar anualmente las semillas porque, al perderse el efecto de la heterosis, la descendencia de las plantas híbridas es menos productiva. El mejoramiento de las plantas ya no depende directamente de los que las cultivan, sino de quienes producen las semillas. En 1960, el maíz híbrido era cultivado, con raras excepciones, en todas las plantaciones de Estados Unidos y Canadá. Después de 1960 En 1970, el ingeniero agrónomo Norman Borlaug recibió el premio Nobel de la Paz por el desarrollo de una variedad de trigo de alto rendimiento, resistente a enfermedades causadas por hongos. El trabajo de Borlaug permitió aumentar la cantidad de alimentos disponibles, por lo que se consideró una contribución fundamental para la paz mundial. La Revolución Verde de la década de 1960 salvó del hambre a más de mil millones de personas. El cultivo de las variedades mejoradas genéticamente duplicó la productividad de los cereales, a pesar de exigir prácticas agronómicas complejas (irrigación, mecanización, aplicación de fertilizantes y pesticidas). 232 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura FIGURA 2. Producción del maíz híbrido La hibridización permite obtener híbridos simples a partir de dos líneas (son los más comunes actualmente), e híbridos dobles a partir de cuatro líneas. Existen híbridos múltiples construidos a partir de por lo menos cinco líneas Línea A Línea B Línea C Línea D Polen Polen Polen Planta híbrida (A x B) Planta híbrida (C x D) Maíz híbrido (A x B) x (C x D) 233 Biotecnología La Revolución Verde trajo también problemas sociales, ambientales y de salud. Debido a la necesidad de grandes inversiones de capital para la mecanización y aplicación de agroquímicos, en muchos países los pequeños agricultores no llegaron a beneficiarse. Como consecuencia de la crisis del petróleo, las grandes empresas multinacionales productoras de herbicidas y fertilizantes entraron, a partir de 1980, en el área de producción de semillas. La inversión masiva de recursos del sector privado en investigación y desarrollo permitió introducir las técnicas recientes de ingeniería genética en la agricultura. Traspasando las barreras interespecíficas se obtienen plantas más productivas o con propiedades nuevas. La tecnología es incorporada a la semilla. Comercializadas a partir de 1996, las principales plantas transgénicas que se cultivan actualmente son la soja, el maíz, la canola y el algodón. Los rasgos más frecuentes son la tolerancia a herbicidas y la resistencia a plagas. El área sembrada se extiende por 25 países, de los cuales cinco responden por el 43% de la superficie cultivada mundialmente (Brasil, Argentina, India, China y Sudáfrica). 2. LA OBTENCIÓN DE NUEVAS VARIEDADES Mutación y selección El mejoramiento convencional se basa en la reproducción selectiva entre individuos de una misma especie. El individuo con características interesantes es cruzado por varias generaciones con uno de los genotipos parentales (retrocruzas), hasta conseguir incorporar las características deseadas (introgresión). El proceso demora entre 5 y 15 años, y el inconveniente es que el gen seleccionado está siempre acompañado por otros genes, deseados o no. Dos variedades comerciales de papa (Lenape, 1960; Magnum bonum, 1990) obtenidas por mejoramiento convencional, tuvieron que ser retiradas del mercado debido al alto contenido de alcaloides, característico de las variedades salvajes, que fue transmitido en el proceso selectivo, concomitantemente al carácter deseado. Por otro lado, como la variación en las plantas cultivadas es limitada, en ocasiones se debe recurrir a la inducción de mutaciones, por acción de agentes físicos o químicos, que hoy son mucho más precisos (TILLING, del inglés targeting induced local lesions in genomes; ZNF, del inglés zinc finger nuclease). 234 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura La selección asistida por marcadores moleculares también ha facilitado la obtención de variedades nuevas, como la papa Amflora. La genómica permitió identificar, en el tomate, 40 genes de resistencia a patógenos que fueron ensamblados en un genotipo único. Sin duda, las nuevas tecnologías abren nuevos caminos. Alteración del número de cromosomas La multiplicación del número de cromosomas (poliploidia) es un fenómeno que ocurre espontáneamente en los vegetales, por no disyunción de los cromosomas o por una falla en la citocinesis. A lo largo del proceso evolutivo, se produjeron duplicaciones de los lotes cromosómicos originales (autopoliploidia) en varias de las especies cultivadas actualmente, como la papa o la caña de azúcar. En híbridos interespecíficos, la multiplicación de los lotes cromosómicos puede restablecer la fertilidad y crear una nueva especie, diferente de las líneas parentales (alopoliploidia). Este mecanismo originó plantas como el trigo, la colza, la avena, el tabaco, el algodón, etcétera. El descubrimiento de la colchicina (1935), una sustancia que impide la formación de los husos mitóticos, permitió crear nuevas especies por poliploidia. La hibridización del trigo y del centeno, seguida de una duplicación cromosómica, originó una planta que reúne la calidad del grano y la rusticidad de las líneas parentales (triticale). Otra forma de alterar el número de cromosomas es mediante la cultura de anteras. Una vez identificados los mutantes recesivos en las plantas haploides, es posible obtener variedades diferentes, sea por hibridización o duplicación cromosómica. Ingeniería genética A medida que aumenta la distancia entre las especies, los cruzamientos se vuelven cada vez más difíciles, y la transferencia de genes requiere el uso de técnicas más complejas como la fusión de protoplastos (hibridización somática) y el cultivo de embriones. Cuando los recursos genéticos se encuentran en organismos distantes en la escala evolutiva (plantas, microorganismos o animales), la transferencia solo es posible mediante la tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética). Vimos en el capítulo IX que la construcción de una planta transgénica comienza con el aislamiento y caracterización del gen de interés. Este gen 235 Biotecnología deberá estar acompañado por una construcción genética compleja que incluya un promotor y un gen marcador. En el transgén, el promotor permite la transcripción de la secuencia codificadora, determinando si la expresión ocurrirá en toda la planta, o en algunas células o tejidos en particular. El marcador sirve para seleccionar las células transformadas. La construcción genética es transferida a las células receptoras por alguno de los métodos disponibles (generalmente electroporación, biolística o usando vectores, como el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens). Luego se seleccionan y recuperan las células transformadas y, por técnicas de cultivo in vitro, se regeneran las plantas correspondientes (Figura 3). Cabe considerar que el trabajo de laboratorio se realiza en plantas cuyo genotipo favorezca la transformación y la regeneración de la planta transformada, pero que generalmente son poco interesantes desde el punto de vista agronómico. Usando técnicas bioquímicas o moleculares (polimorfismos en la molécula de ADN, repetición de secuencias) se verifica la incorporación del gen, así como el número de copias y el lugar del genoma donde se integraron (aspectos que pueden influir en la expresión génica). Se considera que la transformación fue exitosa cuando el transgén presenta buenos niveles de expresión, en el tejido correspondiente. Concluida la etapa de laboratorio, comienza una serie de ensayos controlados en el invernadero, con el fin de seleccionar las plantas madres que se usarán en las sucesivas retrocruzas selectivas con alguna de las líneas de élite. El objetivo es obtener una línea transgénica de alto rendimiento, adaptada a un contexto específico. El cultivo resultante tendrá el potencial de rendimiento similar al de la línea de élite, además de expresar las nuevas características codificadas por el transgén. Conceptualmente, estos procedimientos son los mismos que se hacen para el mejoramiento convencional. La caracterización de la progenie con marcadores moleculares y las técnicas de cultivo in vitro permiten que se realicen mucho más rápido. Comienza a seguir el plan de liberación del cultivo al medioambiente con ensayos confinados, primero en invernadero y después en el campo, en diferentes escalas, hasta que la nueva variedad transgénica esté lista para su cultivo comercial. La liberación del cultivo dependerá del marco regulatorio local, generalmente muy estricto. ¿Cuál es la diferencia entre una planta obtenida por cruzamiento selectivo y por ingeniería genética? En la primera, se introducen en forma aleatoria varios genes de la misma especie o de una especie muy relacionada. En la 236 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura FIGURA 3. Etapas de la construcción de una planta transgénica Transformación Regeneración de las plantas transformadas Caracterización bioquímica y molecular Evaluación del valor agronómico (Invernadero, campo) Introgresión en una línea comercial de élite Línea madre Línea comercial de élite Retrocruzas Obtención de la variedad genéticamente transformada Experimentos confinados y ensayos de campo a pequeña y gran escala Evaluación y autorización por el sistema regulatorio local Liberación del cultivo para su explotación comercial y consumo segunda, se incorpora directamente el gen de interés, que puede provenir de cualquier especie, relacionada o no. Sin duda, se trata de una tecnología demasiado poderosa para ser ignorada. 3. EL PRINCIPIO PRECAUTORIO Pocas tecnologías levantaron tanta polémica como la introducción de organismos genéticamente modificados (OGM) en la agricultura. Los cultivos biotecnológicos demandan años de trabajo, durante los cuales pasan por análisis rigurosos. Para ser comercializada, una planta transgénica necesita la autorización de la autoridad competente. Sin embargo, parte de la opinión pública considera que las plantas transgénicas no deberían introducirse en el ambiente (o utilizarse para el consumo humano, como se discute en el capítulo XIV), mientras exista la mínima 237 Biotecnología posibilidad de haber alguna consecuencia negativa. Es decir, mientras no se demuestre que no presentan riesgos. Para enfatizar el argumento se invoca el principio precautorio, un principio que no se refiere a los riesgos conocidos sino a los potenciales. Podemos decir de una manera simplista que “si existe la posibilidad de que me pase algo malo en la calle, mejor me quedo en casa”, o que “habiendo la posibilidad de que me pase algo malo en la calle, al salir de casa es mejor tener cuidado y prestar especial atención a los semáforos, a los autos, a las bicicletas que pueden venir en contramano, y también a los ladrones”. Nótese que la decisión de “no salir de casa” también implica riesgos, como resbalarse y golpearse en la bañadera, quemarse al encender el horno o recibir un virus vía internet. En otras palabras, el riesgo cero no existe. Siempre hay algún riesgo, y este tendrá que ser evaluado y mitigado. El Principio 15 de la Declaración de Río de Janeiro sobre Medioambiente y Desarrollo Sustentable (1992) establece la necesidad de acciones concretas, en caso de riesgos potenciales para el medioambiente. Afirma el derecho a la información y pide la participación de todos los interesados. La responsabilidad tendrá que ser democráticamente asumida, por un grupo heterogéneo que contemple los intereses de la sociedad. Considerado por algunos grupos de opinión como uno de los pilares del desarrollo sustentable y una protección contra el control de la tecnología por las grandes empresas, el principio de precaución es visto por otros como un obstáculo al progreso y una tentativa de proteccionismo. 4. LAS PLANTAS BIOTECNOLÓGICAS ACTUALES La mayoría de los cultivos transgénicos disponibles, o a punto de llegar al mercado, fueron mejorados en sus propiedades agronómicas o en su calidad nutricional o industrial. Pese a que todos los ensayos de campo, cuidadosamente controlados, indican que las plantas transgénicas se comportan del mismo modo que sus pares convencionales, algunos aspectos suelen ser cuestionados. Tal es el caso del comportamiento de las plantas transgénicas en la naturaleza. ¿Podría una planta transgénica escapar de los limites del cultivo y desplazar a las plantas silvestres, transformándose en una maleza invasora, como los trífidos de una novela de ciencia ficción? Existe el precedente de algunas plantas ornamentales que se transformaron en malezas, al ser introducidas inadvertidamente en un nuevo ambiente. Algunos casos son bien conocidos. 238 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura La lantana prolifera descontroladamente en Australia; el kudzu, traído de Japón para una exposición de plantas ornamentales, se propaga en el sur de Estados Unidos; el rododendro, originario de la península ibérica, se multiplica como plaga en Inglaterra. Además de la degradación ambiental debida al desmonte, la jardinería o la agricultura, para que esos hechos pudieran repetirse con las plantas transgénicas, serían necesarias varias de las características hereditarias que son sistemáticamente eliminadas, por indeseables, en las plantas cultivadas (dormancia de la semilla, plasticidad fenotípica, crecimiento indeterminado, floración y producción continua de semillas, etcétera). De todos modos y con el objetivo de reducir el riesgo futuro de introducir un gen que pueda transformar una planta normal en plaga, la FAO (Food and Agriculture Organization) estableció una serie de directrices que se cumplen en 130 países y se aplican también a insectos, bacterias y hongos. Ninguno de los cultivos biotecnológicos disponibles actualmente se mostró persistente o invasor en los ensayos de campo previos a su comercialización o en el monitoreo posterior. Plantas con propiedades agronómicas modificadas Los cultivos comercializados actualmente son la soja, la canola, el maíz, el algodón, y en menor escala, el arroz, la papaya y el zapallo. Se les han incorporado importantes propiedades agronómicas que benefician al agricultor, como la tolerancia a herbicida, la resistencia a insectos o la resistencia a virus. En algunos casos se ha asociado más de una característica en la misma planta (rasgos apilados). El aumento de la productividad de los cultivos se justifica porque el maíz, el algodón y la soja son cultivos de uso industrial que pueden ser exportados y generan divisas. En la Argentina, el desarrollo de plantas más productivas, además de tolerantes al estrés hídrico y ambiental, es una realización de gran importancia en la que participan científicos (Universidad Nacional del Litoral) y empresas nacionales (Bioceres). Plantas tolerantes a herbicidas El crecimiento de malezas perjudica a los cultivos, porque además de competir por la luz y por los mismos nutrientes, pueden acabar contaminado la cosecha. Para eliminarlas antes de la siembra, los agricultores asocian el 239 Biotecnología tratamiento con herbicidas a la labranza del suelo, acelerando la erosión. Pero si una planta es tolerante a un herbicida de amplio espectro, basta con sembrarla y aplicar el herbicida después de la germinación. La tecnología se integra con el sistema de siembra directa, que requiere no remover el suelo antes del sembrado. Varios países cultivan comercialmente soja, maíz, algodón y canola tolerantes a herbicida. El herbicida más utilizado es el glifosato, que está presente en varios productos comerciales (Roundup, Bucaneer, Rodeo, Accord, entre otros). El glifosato permite eliminar las malezas anuales y perennes porque inhibe los sistemas enzimáticos vegetales. Considerado poco tóxico en caso de exposición oral o de inhalación, no afecta al hombre o a los animales porque es degradado rápidamente en el ambiente. Además de tener un espectro amplio, resulta mucho más barato que los herbicidas usados para los cultivos convencionales. Monsanto comercializa las semillas tolerantes al glifosato con el nombre Roundup Ready. Como la patente del Roundup expiró en el año 2000, hay nuevas versiones del herbicida original, más accesibles para el agricultor. Desde entonces, las semillas y el herbicida pueden ser comprados a diferentes proveedores. Por su parte, la Bayer CropScience usa el nombre Liberty Link para las variedades tolerantes al glufosinato, otro herbicida presente en un segundo grupo de productos (como por ejemplo, Basta, Liberty e Ignite). El glifosato y el glufosinato no son los únicos herbicidas del mercado. Existen otras sustancias, del grupo de las imidazolinonas, cuya tolerancia ha sido transferida recientemente a la soja Cultivance, un emprendimiento conjunto de la Embrapa (Brasil) y BASF, que ya recibió la autorización correspondiente para su comercialización. La ventaja de las plantas genéticamente modificadas sobre las plantas silvestres depende de la presencia de un agente de selección como, por ejemplo, el herbicida al que son resistentes. Sin el herbicida, las plantas genéticamente modificadas no tendrían ninguna ventaja sobre las plantas silvestres. Además, al ser más frágiles, no podrían competir con ellas en un ambiente natural. Sin embargo, el flujo génico es preocupante, porque plantas silvestres tolerantes a herbicida podrían tornarse malezas y competir con las plantas cultivadas. Hay plantas, como la trapoeraba (Commelina benghalensis), que son naturalmente resistentes al glifosato. La aparición de resistencia en por lo menos 15 especies distribuidas mundialmente, podría haber sido causada por transferencia del gen correspondiente de las plantas cultivadas a las 240 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura plantas silvestres. En Brasil, ya hay relatos sobre resistencia al glifosato en el raigrás (Lolium multiflorum) y en la rama negra (Conyza bonariensis y C. canadiensis). La aparición de plantas resistentes al glifosato, que es el herbicida más utilizado en el mundo, debe ser acompañada atentamente. Se estima que después de 10 a 20 años de uso continuo, la aparición de plantas silvestres tolerantes sea inevitable, pero puede ser retardada si se adoptan algunas medidas preventivas, entre ellas: rotar los cultivos, evitar el uso repetido del mismo herbicida, aplicar las dosis adecuadas en condiciones meteorológicas propicias, agregar otros modos de control de malezas. La posibilidad de haber flujo génico no depende del origen de los genes (transgénica o convencional). Los productores de semillas comerciales consideran prácticamente imposible evitar la diseminación del polen, admitiendo como aceptable un nivel de contaminación de 1% entre las variedades convencionales. Plantas resistentes a insectos Los insectos destruyen entre el 20 y el 40% de las cosechas. Por otro lado, el uso indiscriminado de agroquímicos ha causado problemas en el ambiente y en la salud humana, razón por la cual son necesarios métodos alternativos de control. Durante años, muchos agricultores (inclusive los orgánicos) protegieron sus cultivos usando como insecticida a la toxina producida por un microorganismo del suelo, la bacteria Bacillus thuringiensis. La toxina es inocua para el ser humano y letal para los insectos, debido a su acción sobre el sistema digestivo de las larvas. El producto comercial es vendido, en forma líquida o granular, como Dipel, Thuricida o Vectobac. Al transferir el gen que codifica para la toxina (gen Cry) a una planta, esta pasa a producirla directamente en sus tejidos. Hay varias versiones del gen Cry que codifican toxinas muy específicas, de modo que cada una es efectiva para un orden determinado de insectos. Actualmente, Monsanto, Syngenta, Dow Agrosciences y Pioneer, entre otras empresas, comercializan tanto algodón como maíz resistente a insectos. Los nombres comerciales varían al haber diferencias en la posición del transgén o sus características. Una de las ventajas de las plantas que producen la toxina del Bacillus thuringiensis (plantas Bt) sobre las variedades convencionales es que tienen menos lesiones causadas por insectos, reduciéndose la contaminación por hongos y la presencia de micotoxinas, que son peligrosas para la salud humana. 241 Biotecnología La aparición de insectos resistentes a la toxina Bt es un problema inevitable porque, sea de origen químico o biológico, todo insecticida actúa como un agente de selección. Sin embargo, hay estrategias que evitan o retrasan la aparición de larvas resistentes a la toxina Bt. Una de ellas es que el maíz transgénico produzca niveles de toxina más altos que los utilizados cuando se emplea directamente la toxina como insecticida. La otra es sembrar maíz “no Bt” en espacios predeterminados, con el fin de establecer refugios de insectos susceptibles. Si aparece un insecto resistente, cruzará con otro que no lo es, originando una descendencia susceptible. La práctica de refugios ha sido incorporada en todos los países que adoptaron cultivos Bt. El gerenciamiento de riesgos envuelve también medidas para mitigar el impacto eventual del flujo génico a otros cultivos. Un gen de tolerancia a herbicida no es ventajoso en ausencia del mismo, pero ¿qué ocurriría con un gen que presentara algún valor adaptativo, como el de producción de insecticida? El riesgo de polinización cruzada depende de la especie, siendo más probable que ocurra en el maíz, donde el polen se dispersa con el viento, que en la soja o en el trigo, en que hay autofecundación. El control de los riesgos comprende algunas medidas para disminuir el impacto potencial del flujo génico como, por ejemplo, mantener alrededor del lote de plantas transgénicas un espacio no cultivado o cultivado con otras especies. El tamaño de los espacios o corredores de aislamiento depende de las características reproductivas de la especie en cuestión y de factores ambientales, como el viento. En el caso del maíz, se estima que el riesgo de polinización entre un cultivo transgénico y la variedades silvestres pasa de 1% a 0% cuando la distancia entre ambos aumenta de 30 a 300 metros. Esas distancias evitan la diseminación del polen transgénico tanto hacia las variedades silvestres, como hacia las convencionales. Este último aspecto del problema es importante para el productor agrícola, para quien la contaminación significa un perjuicio importante. Recientemente, en Canadá, los productores de canola orgánica perdieron sus mercados debido a la contaminación con la variedad transgénica. Por eso, hay que analizar caso por caso el riesgo de flujo génico. Por otro lado, se sabe que la probabilidad de que haya flujo génico aumenta cuando hay especies silvestres emparentadas. Por eso se aconseja extremar los cuidados en relación al cultivo de plantas genéticamente modificadas en los lugares donde existen variedades silvestres emparentadas, como la papa en el Perú, el maíz en México, el arroz en India o la soja en Corea y China. 242 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura En Brasil, donde hay variedades silvestres de algodón, se delimitaron zonas de exclusión para el cultivo de algodón biotecnológico. En México, después de 11 años de moratoria, se iniciaron los primeros ensayos de campo con maíz transgénico, para obtener la información necesaria sobre las medidas de seguridad biológica que posibiliten su coexistencia con los cultivos convencionales. Con respecto a la vida silvestre, a pesar del alboroto provocado por un estudio anunciando que las mariposas monarca se verían afectadas por el contacto con el polen de plantas de maíz transgénicas, sus propios autores admitieron que tal resultado correspondía a una experiencia de laboratorio realizada en condiciones diferentes a las de un ambiente natural. Plantas resistentes a virus De manera análoga a la vacunación, la resistencia a virus se basa en la inhibición de la reproducción viral debido al fenómeno de interferencia resultante de la transferencia de su genoma al hospedero. Esta tecnología fue utilizada para erradicar virosis de la papa, de la remolacha, del pepino, del tomate, de la coliflor y del melón. Los productos hortícolas han recibido menos atención que los cereales y las leguminosas porque, independientemente de la resistencia eventual del consumidor, se trata de una tecnología que aún es costosa para los cultivos en que la producción es pequeña. Sin embargo, las variedades de papaya resistente a virus comercializadas en los Estados Unidos, salvaron al estado de Hawai de un desastre económico (papayas UH Rainbow y UH SunUp). En Brasil, después de varios años, se autorizó la liberación comercial del poroto resistente al virus del mosaico dorado, que es el primer transgénico totalmente desarrollado en el país y que beneficia a la agricultura de subsistencia (Embrapa, Brasil). Transmitido por la mosca blanca Bemisia tabaco, el virus del mosaico dorado causa la pérdida de 45% a 80% de la zafra del poroto, uno de los alimentos básicos de la población. Eventos combinados La inserción de un rasgo nuevo en una planta es considerado un evento que exige la aprobación de las autoridades correspondientes. Actualmente, hay semillas con rasgos apilados que combinan eventos como, por ejemplo, la tolerancia a dos herbicidas o la tolerancia a herbicida y resistencia a dos tipos de insectos, uno que ataque la raíz y otro la parte supe243 Biotecnología rior de la planta. El maíz Genuity SmartStax (Monsanto, DowAgroSciences), por ejemplo, reúne ocho genes para el control de plagas que ataquen en el suelo y en la parte superior de la planta, además de la tolerancia a herbicidas para el control de malezas. Plantas con calidad nutricional mejorada En una segunda ola de plantas transgénicas se trata de modificar la calidad de la planta como alimento, es decir, introducir propiedades que interesen directamente al consumidor como, por ejemplo: mejoramiento de la calidad nutricional, reducción de alérgenos, modificación del tiempo de conservación y de las características organolépticas, simplificación del procesamiento industrial de aceites y almidón. En 1974 la variedad Tower de Brassica napus recibió el nombre de canola (del inglés canadian oil). Se trata de la planta oleaginosa conocida como colza, que se tornó comestible al ser mejorada genéticamente, disminuyendo el tenor de ácidos grasos saturados y la cantidad de glucosinato. Modificaciones posteriores originaron numerosas variedades que difieren en la composición de los ácidos grasos; algunas de ellas también son tolerantes a herbicidas. Está previsto el desarrollo de papa y batata con mayor contenido de proteínas, de arroz conteniendo hierro y de un maíz para la alimentación animal con un mayor contenido de los aminoácidos lisina y metionina. En 2005, Monsanto anunció haber obtenido a través de un método convencional (mejoramiento asistido por marcadores moleculares) una variedad de soja RoundupReady con menor cantidad de ácido linolénico (soja Vistive). Además de mejorar el sabor del aceite, esta modificación evita parcial o totalmente la hidrogenación, una reacción química que genera las grasas trans. Vistive es utilizado como ingrediente de bizcochos (Cargill, Kellog’s). China desarrolló y autorizó recientemente el maíz con fitasa, para ración animal. Este maíz permite la asimilación de fosfatos por los porcinos, mejorando la productividad del rebaño y disminuyendo la contaminación ambiental. Un caso emblemático en el desarrollo de plantas transgénicas con calidad nutricional mejorada es el arroz con vitamina A (“arroz dorado”). El grano de arroz normalmente no contiene -caroteno ni otros precursores de la vitamina A. En Asia, la carencia de esta vitamina afecta a millones de niños, causándoles la muerte o una ceguera irreversible. La transformación de una variedad de arroz indica, con dos genes, uno de narciso y otro bacteriano, permitió obtener un grano con -caroteno. 244 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura El arroz dorado es un emprendimiento humanitario, ya que varias empresas cedieron en los países en desarrollo sus derechos sobre las patentes involucradas en la producción de este grano. Sin embargo, la resistencia de varios sectores de opinión y las dificultades legales han postergado su lanzamiento durante años. Plantas con propiedades nuevas Esta es la tercera ola de plantas transgénicas, desarrolladas especialmente para funcionar como fábricas biológicas, produciendo fármacos, vacunas y plásticos. Varias han llegado a la fase correspondiente a pruebas de campo: incluye alfalfa, maíz, arroz, tabaco, banana y papa. Para evitar la contaminación accidental de los alimentos, estas plantas tendrán que ser cultivadas en confinamiento y procesadas separadamente de las plantas comunes. Las proteínas extraídas y purificadas serán utilizadas exclusivamente por la industria farmacéutica, y tendría que haber un control estricto del cultivo, transporte y distribución de estas plantas. Una forma alternativa de evitar que el transgén se disemine con el polen es su inserción en el ADN de los cloroplastos. Otra forma sería que la planta transgénica fuera estéril. Sin embargo, los sistemas de protección tecnológica o TPS (del inglés technology protection systems) y las tecnologías de uso genético restricto o GURT (del inglés, genetic use restriction technologies) han despertado mucha resistencia debido a su impacto económico en los agricultores, que se verían forzados a comprar anualmente la totalidad de las semillas. Pero es posible que esto se vuelva a discutir en relación a las plantas genéticamente modificadas para ser fábricas biológicas. 5. EL AGRONEGOCIO La extensión de los cultivos transgénicos El cultivo comercial de plantas transgénicas data de 1995 (resistencia a insectos) y 1996 (tolerancia a herbicidas). Aunque su adopción suscite grandes polémicas, lo cierto es que el área sembrada con cultivos transgénicos aumentó año a año, hasta llegar a 148 millones de hectáreas en 2010. Se calcula que en 2010, el mercado de semillas biotecnológicas alcanzó el valor global de 11.200 millones de dólares, mientras que el valor de la cosecha de los principales cultivos (soja, maíz y algodón) habría llegado aproximadamente a 150 245 Biotecnología millones de dólares. En relación al área sembrada en ese mismo año, los países que plantaron más de un millón de hectáreas fueron: Estados Unidos, Brasil, Argentina, India, Canadá, China, Paraguay, Pakistán, Sudáfrica y Uruguay. Los cultivos biotecnológicos permitieron aumentar la producción agrícola y mejorar las condiciones económicas de los agricultores. De los 15,4 millones de productores agrícolas que tomaron la decisión de sembrar semillas biotecnológicas, más del 90% son pequeños agricultores. En los países en que la mano de obra agrícola está constituida principalmente por mujeres, los cultivos biotecnológicos mejoraron sus condiciones de vida, al permitir que dedicaran más tiempo al cuidado de los niños o a otras actividades. Los problemas de salud causados por la contaminación ambiental con agrotóxicos disminuyeron al reducirse la aplicación de insecticidas en 14%, inclusive en algunos casos esa disminución llegó al 50% (Argentina, China). Con la autorización de comercializar el arroz Bt en China y el poroto resistente a virus en Brasil, se ha iniciado una nueva etapa que contempla las principales fuentes de alimento locales. Se encuentran en diferente grado de desarrollo los estudios sobre el garbanzo en África, la berenjena en India, el maíz resistente a la sequía en Estados Unidos y África subsahariana. Las investigaciones sobre cómo lograr mayor eficiencia en el uso del nitrógeno y el trigo biotecnológico podrán tardar cinco o más años en tener resultados concretos. Se calcula que el número de países productores de cultivos biotecnológicos pase de 29 en 2010 a 40 en 2015, año de los “Objetivos del milenio”, que comprometen a la sociedad a reducir a la mitad el hambre y la pobreza. El mercado de semillas Los gigantes génicos En los países del continente africano y en parte de Asia, donde la agricultura es la principal fuente de alimentos, los pequeños agricultores dependen de las semillas. En la época de la cosecha separan una parte para la siembra del próximo año. En los países desarrollados, la proporción de la población dedicada a las tareas agrícolas disminuye como consecuencia de la mecanización del campo. La agricultura de subsistencia da lugar a un enorme complejo agroindustrial que integra otras actividades, como la venta de insumos (maquinarias, agroquímicos, semillas, etc.) y la transformación y distribución de productos. Aunque la transformación de la producción de semillas en una actividad 246 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura lucrativa se remonte al siglo XIX, la dependencia del agricultor hacia las empresas productoras de semillas comienza con el maíz híbrido. Las combinaciones genéticas que confieren vigor (heterosis) a la planta, cargan factores de esterilidad que obligan al agricultor, año tras año, a comprar nuevas semillas. Se suman, además, otras herramientas para el mejoramiento genético, que requieren de fuertes inversiones para alcanzar productos (semillas) que respondan a las necesidades de los agricultores. Una de estas herramientas es la transgénesis, que no impide la utilización de semillas para el año siguiente pero debe pagarse, mediante sistemas de regalías a las empresas que las desarrollaron y detentan las patentes o los derechos de propiedad intelectual correspondientes. ¿Quién debe pagarlas? ¿Cuándo, cuánto y cómo deben pagarse? La respuesta ha provocado varios conflictos entre los países agrícolas y las grandes corporaciones. Después de la crisis del petróleo, ya en la década de 1980, las grandes multinacionales productoras de agroquímicos y fertilizantes químicos ingresaron al área de semillas. En parte porque el mercado de semillas tiene un margen de lucro mayor que el de los agroquímicos y también porque la nueva tecnología abre un abanico de posibilidades, tornando más interesante la generación de nuevas semillas que la de nuevos agroquímicos. En un proceso de centralización, determinado por varios ciclos de fusiones, cientos de pequeñas empresas fueron absorbidas por los enormes conglomerados productores de agroquímicos y de semillas, con ramificaciones en la industria farmacéutica. Estas corporaciones concentran un enorme poder y despiertan mucha resistencia en la opinión pública. Denominadas “gigantes génicos” (del inglés, gene giants), las principales empresas productoras de semillas son Monsanto, Syngenta, Dow Agro Sciences, DuPont y Groupe Limagrain. Las semillas biotecnológicas representan 30% del mercado mundial de semillas, un valor estimado de US$ 47 mil millones, en 2015. La cadena productiva de la semilla Cada país desarrolla variedades adaptadas a sus suelos y condiciones climáticas. Una vez aprobados y registrados, esos cultivos son puestos a disposición de los agricultores. El proceso de amplificación del número de semillas, estrictamente reglamentado, contempla varias etapas de las que participan diferentes entidades del sector público o privado. En el caso de un rasgo transgénico, este debe ser aprobado por las instancias legales competentes antes de ser transferido para los cultivares locales 247 Biotecnología e iniciarse el proceso de multiplicación, certificación y registro, que es indispensable para que la semilla llegue al agricultor. La cadena productiva de la semilla incluye inventores, obtentores, multiplicadores, productores, comerciantes de semillas y agricultores. Su calidad es establecida por la legislación y por las agencias de certificación, que garantizan al comprador semillas dentro del patrón deseado. La Unión Europea y la moratoria En los Estados Unidos, tres agencias controlan y reglamentan el uso de las nuevas tecnologías genéticas: USDA (United States Department of Agriculture), EPA (Environmental Protection Agency) y FDA (Food and Drug Administration). Los cultivos transgénicos han sido adoptados desde 1996 y la resistencia de la población es muy baja. En la Unión Europea, una moratoria (1999) suspendió la siembra e importación para el consumo de cultivos transgénicos nuevos, sin afectar a los que fueron autorizados anteriormente para cultivo, importación o uso en la producción de alimentos o raciones. El primer paso para el levantamiento de la moratoria se dio en 2003, con el establecimiento de normas de etiquetado y trazabilidad, y con la implementación de normativas de coexistencia, para evitar la contaminación de los cultivos transgénicos a los orgánicos y convencionales. El segundo paso fue en 2004, cuando se aprobó la importación de un maíz transgénico enlatado para el consumo humano (maíz dulce Bt11 resistente a insectos de la empresa anglo-suiza Syngenta). En realidad este maíz ya había sido autorizado para entrar como grano, aceite u otros derivados, pero se abrió una brecha para nuevos pedidos de autorización, tanto de productos alimenticios como de otros cultivos, como el maíz y la canola resistentes a herbicidas. En 2010, seis países de la Unión Europea (España, Portugal, República Checa, Polonia, Eslovaquia y Rumania) produjeron maíz biotecnológico y tres (Alemania, Suecia y República Checa) cultivaron la batata transgénica Amflora. Los países de América Latina En América Latina (Brasil, Argentina, Paraguay, Uruguay, Bolivia, México, Colombia, Chile, Honduras y Costa Rica) se siembran y comercializan cultivos transgénicos (soja, maíz, algodón) a partir de las semillas desarro248 Capítulo XIII. Biotecnología y agricultura lladas por empresas del sector privado. También se observa en varios países (Argentina, Brasil y México) la tendencia a generar variedades transgénicas propias, que respondan a ciertas demandas locales. Tanto Argentina como Brasil cuentan con una comunidad académica con un alto nivel científico y tecnológico activo en las universidades y en los centros de investigación, con empresas de tradición histórica en la difusión de la tecnología agropecuaria (INTA, Embrapa) y con condiciones económicas limitadas por las sucesivas crisis políticas. Existen convenios y programas de intercambio científico entre ambos países que tienden a elevar el nivel de las actividades científicas y tecnológicas. En ambos países, hay numerosas empresas privadas que ocupan un lugar destacado en diferentes sectores del mercado biotecnológico. A lo largo de los primeros 15 años de implantación de las nuevas tecnologías agrícolas, cada país trazó su propia trayectoria hasta establecer las normas legales que garantizan el progreso en condiciones seguras. 6. ¿LA COEXISTENCIA ES POSIBLE? Todos los sistemas agrícolas ejercen algún impacto sobre el medioambiente. Sin embargo, una agricultura sustentable puede minimizar los efectos negativos de la producción agrícola, restaurando la fertilidad y limitando la erosión de la tierra. En este sentido, ya hay algunas prácticas que son compartidas por las diversas modalidades agrícolas (orgánica, industrial o de precisión), como la rotación de cultivos, el abono verde, el manejo de plagas y de nutrientes, la siembra directa con una cobertura en la superficie del suelo, etcétera. Cultivos convencionales y biotecnológicos ocupan diferentes fajas de mercado y crecen en función de las oportunidades económicas. La contaminación de un cultivo convencional por un cultivo biotecnológico trae pérdidas considerables para el agricultor. Siendo así, se establecen medidas de protección para reducir la presencia de semillas adventicias a un límite comercialmente aceptable. Las medidas de protección tomadas abarcan la distancia entre los cultivos y la manutención de fajas de exclusión de diferente tamaño, que dependen de las características de la fecundación (autopolinización o fecundación cruzada). Pruebas genéticas e inmunológicas permiten identificar la presencia de organismos genéticamente modificados en un cargamento de cultivos convencionales. 249 Biotecnología Los modelos de regulación de los cultivos tradicionales, orgánicos o biotecnológicos dan al agricultor la posibilidad de elegir la modalidad que mejor le convenga económicamente. No se refieren a la bioseguridad, porque esta es analizada y confirmada en el momento en que se autoriza una determinada variedad biotecnológica. España, que es el mayor productor de maíz transgénico europeo, estableció en 2005 un modelo de regulación de los cultivos tradicionales, orgánicos y transgénicos basado en normas de coexistencia. 250 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria 1. LA NUTRICIÓN DE LOS ANIMALES La producción agropecuaria no depende exclusivamente de las características geográficas. Sigue los patrones de consumo de la sociedad, que cambian a medida que mejora la calidad de vida de la población. Los animales criados como fuente de alimentos por el hombre son fundamentalmente mamíferos rumiantes (bovinos, ovinos, caprinos) y monogástricos (porcinos, conejos y aves). Fuera de estos dos grupos, la cría de animales domésticos se limita básicamente a un pequeño número de especies de peces, crustáceos y mariscos. También se crían animales para la práctica de deportes (caballos) y como mascotas (gatos, perros, pájaros y peces). La cría extensiva de ganado (bovino, ovino, caprino) prevalece en praderas y pasturas, mientras que los establecimientos agrícolas más pequeños tienden a la cría intensiva de alto rendimiento, especialmente ganado lechero, aves, porcinos y peces. Entre 1993 y 2020, el consumo de carne podrá duplicarse en los países en desarrollo. La pequeña empresa familiar será reemplazada por una producción intensiva orientada a satisfacer el mercado urbano, disminuyendo la cría de rumiantes en comparación con la de aves y porcinos. Estos cambios exigirán mayor eficiencia en la selección, en la administración y en los cuidados con la alimentación y la salud de los animales. En los países desarrollados, el objetivo primordial es aumentar o equilibrar la producción a un costo menor, lo que se consigue reduciendo el número de animales e incrementando la producción de leche, huevos, carne y lana. Con respecto a los métodos productivos, la tendencia general es disminuir el impacto causado por las enfermedades y reducir la necesidad de trabajo. Las biotecnologías se aplican a la alimentación y conservación de la salud de los animales, posibilitando también el control de la reproducción y la aceleración de la selección genética. También se abren nuevas perspectivas con el uso de animales como biorreactores para la producción de fármacos. 251 Biotecnología La necesidad de raciones La cría y engorde del ganado de corte en las pasturas es una opción posible en países con grandes extensiones territoriales, como Argentina, Australia, Brasil o Nueva Zelanda. El alimento básico del ganado son las plantas forrajeras (como la alfalfa en Argentina y el capin en Brasil), en cantidades que varían de acuerdo con las estaciones del año. El número de cabezas depende de la disponibilidad de alimento. Durante el período en que faltan las forrajeras se suplementa la dieta con heno (forraje seco), silaje (forraje y granos fermentados), granos, o concentrados y residuos agroindustriales. Pero en los países desarrollados, donde parte de las áreas de pasturas se destina a la agricultura, la cría de animales se realiza en regímenes de semiconfinamiento o confinamiento. El objetivo primordial es el aumento de la productividad, especialmente en el caso del ganado lechero, aves y porcinos. Dependiendo de la región, parte de los cultivos de cereales (maíz) y leguminosas (tortas de soja, algodón, canola y girasol) se utiliza como ración, para suplir las necesidades proteicas y energéticas, que son de 3 a 10 kg de granos para obtener 1 kg de carne. Como el valor nutricional de los granos es variable, deben agregarse suplementos nutricionales, presentes en diversos productos industrializados, que brinden a los animales la cantidad de nutrientes necesaria en función de su especie, edad, etcétera. De Liebig a la vaca loca Los suplementos nutricionales proteicos se introdujeron a fines del siglo XIX. En 1865 Liebig inventó un procedimiento industrial que convierte los restos de los animales en extracto de carne para la alimentación humana, y en harina de carne para fortificar las raciones animales. Antes de la Segunda Guerra Mundial, las raciones de los rumiantes de los países industrializados ya incluían entre 2 y 5% de harina de carne. Más tarde, Europa comenzó a importar granos para la alimentación animal. En 1973, debido a condiciones climáticas adversas, Estados Unidos enfrentó la escasez de soja embargando todos los granos disponibles, para cubrir así la demanda interna. Al faltar los granos y por consiguiente la fuente proteica que representan, la única opción posible para los europeos fue, nuevamente, el incremento de las raciones con harina de carne. Para abaratarlas, se dejaron de extraer las grasas con solvente y se modificaron las condiciones de esterilización. 252 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria Es muy probable que la inclusión de restos de animales enfermos, inicialmente ovejas con scrapie, una enfermedad esporádica conocida en el Reino Unido desde 1732, haya contaminado a las vacas provocando el brote de una variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, que afecta al hombre causándole daños neurológicos graves (enfermedad de la vaca loca). Esta variante demora menos tiempo en manifestarse y ataca a las personas jóvenes. En 1988 se prohibió la harina de carne en la alimentación del ganado bovino y ovino. La epidemia provocó el sacrificio de buena parte de los rebaños del Reino Unido y de otros países de Europa, poniendo en discusión la composición de las raciones animales y la cantidad y calidad de los suplementos de granos y forrajeras. La composición de las raciones Además de la harina de carne, otros productos han sido usados como suplemento proteico, entre ellos la leche descremada en polvo y la harina de pescado, esta última abandonada debido al aumento de precio causado por la pesca excesiva. La biomasa microbiana seca ha dado buenos resultados como fuente alternativa de proteínas. Denominada SCP (del inglés, single cell protein), la proteína unicelular puede obtenerse de diversas fuentes: la levadura Saccharomyces cerevisiae es un subproducto en las destilerías de alcohol; Candida utilis y Torula se multiplican sobre los efluentes de la industria de papel o de las queserías; Methylophilus methylotropus crece sobre el metanol obtenido del gas del Mar del Norte, y la SCP resultante se comercializó durante un tiempo en el Reino Unido bajo el nombre de Pruteen. La adición de antibióticos pretende proteger las raciones de la acción bacteriana. La adición de probióticos busca modificar el ambiente gastrointestinal, estimulando la multiplicación de ciertos tipos bacterianos en detrimento de otros. El agregado de enzimas (proteasas, celulasas, amilasas, etc.) tiende a aumentar la digestibilidad de las raciones. El uso de granos para la nutrición animal ha traído como inconveniente la introducción de ácido fítico en la dieta de los animales monogástricos, porque al estar unido al fósforo y a otros nutrientes minerales, no es asimilado. El ácido fítico es eliminado agregando la enzima fitasa en el alimento. De este modo se mejora la nutrición de los animales y se disminuye la cantidad de fósforo excretado al ambiente, una de las causas de la eutrofización de los cursos de agua. Obsérvese que la inserción de un gen bacteriano que codifica 253 Biotecnología para la fitasa originó en su momento el cerdo Enviropig, que producía esta enzima en la saliva, disminuyendo en el 60% la concentración de fósforo en el estiércol con respecto a los cerdos convencionales. Las raciones transgénicas El escándalo de la “vaca loca”, seguido por el caso de los pollos contaminados con dioxina, mostró el descuido de los productores europeos al respecto de las raciones animales. Por eso no resultó sorprendente el escándalo causado en 1998 por A. Pusztai, un renombrado científico del Reino Unido, al declarar en televisión haber encontrado alteraciones en el sistema inmune de ratas alimentadas con papas crudas, modificadas genéticamente con el gen de una lectina insecticida de campanilla. Una auditoría realizada por científicos independientes determinó que las conclusiones eran erróneas, lo que fue confirmado más tarde por la Royal Society del Reino Unido. Las raciones representan hasta el 70% de los costos de la cría de animales, y son uno de los problemas de la producción agropecuaria. Toda tentativa de abaratar las raciones sería bienvenida pero, debido a los precedentes desastrosos y la desconfianza de algunos sectores, las raciones de origen transgénico tuvieron que ser analizadas exhaustivamente en diversos tipos de animales. No se evidenciaron señales de toxicidad con soja, maíz, algodón, papa, canola y otros cultivos en ratones, conejos y otros animales de experimentación. Tampoco se observaron cambios morfológicos o reproductivos o alteraciones en las características de los cueros, tejidos, carnes, huevos, leche, etc., de los animales alimentados con derivados de plantas transgénicas. Numerosos estudios, realizados en instituciones de investigación y en universidades, muestran que las plantas transgénicas disponibles son sustancialmente equivalentes a las no transgénicas, cuando se comparan la composición química, la digestibilidad y el valor nutritivo. Organizaciones internacionales como la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) y la OMS (Organización Mundial de la Salud) consideran desde 1991 que el ADN es seguro, independientemente de que su origen sea transgénico o no. Las organizaciones norteamericanas FDA (Food and Drug Agency) en 1992 y EPA (Environmental Protection Agency) en 2000, se manifestaron en el mismo sentido. La Unión Europea no considera necesario etiquetar a los productos derivados de animales alimentados con raciones provenientes de organismos genéticamente modificados. 254 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria Según la Federación de Sociedades de Ciencias Animales (FASS), los alimentos son digeridos normalmente por los animales estudiados, sin que se haya detectado la presencia de ácidos nucleicos o proteínas de origen transgénico en la carne, leche o huevos. Era un resultado esperado, porque en función de los conocimientos sobre digestión y absorción, tanto las proteínas como el ADN son degradados durante el proceso digestivo. En algunos casos en que las plantas tienen capacidad para resistir el ataque de insectos, como el maíz Bt, se verifica además una reducción sustancial en el nivel de micotoxinas. Esto se explica porque al disminuir el ataque de insectos, hay menos lesiones que permitan la infección y el crecimiento de hongos. Las micotoxinas son muy peligrosas para los animales que ingieren los granos contaminados, causándoles hemorragias, daños hepáticos y renales, diarreas y cáncer. El maíz transgénico mejora la calidad del alimento y la salud animal, especialmente en los monogástricos, que son más sensibles a las micotoxinas que los rumiantes. Con respecto a la posibilidad de desarrollar por transgénesis mejores alimentos para los animales, se ha incorporado el gen de la fitasa de Aspergillus nigri a la canola, la alfalfa y el arroz, produciendo niveles altos de la enzima en la semilla. Los granos de estas plantas transformadas genéticamente podrán usarse directamente en la ración, ya que no presentan efectos adversos y no requieren del agregado de fitasa. Están siendo estudiadas plantas con mayor digestibilidad, como una alfalfa transgénica con menos lignina. También se observó aumento de peso y buen crecimiento de la lana en ovejas alimentadas con lupino, transformado genéticamente para sintetizar una proteína de girasol, con alto contenido de metionina. 2. EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL GANADO Existen hoy más de 5.000 razas de ganado, resultantes de muchos años de adaptación a diferentes condiciones ambientales. El mejoramiento genético tiene tres objetivos fundamentales. El primero es aumentar la eficiencia de la conversión alimentaria, incrementando la tasa de crecimiento corporal. El segundo es aumentar la productividad (leche, huevos) y el último, más reciente, modificar la composición de la res, incrementando la cantidad de proteína (carne y leche) en detrimento de la grasa. A pesar de los resultados espectaculares alcanzados, el mejoramiento tradicional exige tiempo. En bovinos, por ejemplo, existe un período de cuatro 255 Biotecnología años entre una generación y otra. También es necesaria una metodología especial, porque muchas de las características seleccionadas no responden a un único gen, sino que resultan de la contribución de varios genes (herencia poligénica o cuantitativa). Si estos se encuentran en cromosomas diferentes, su selección implica la incorporación de genes vecinos, que pueden ser indeseados. Los pollos de tipo parrillero (broiler), por ejemplo, se han transformado en un alimento común y barato. Estos pollos han sido seleccionados a lo largo de 50 generaciones, y crecen cuatro o cinco veces más rápido que sus antepasados. Sin embargo, han aparecido algunos efectos indeseados, como el aumento del tenor graso, la fertilidad baja y la presencia de anormalidades esqueléticas. Por otro lado, las gallinas seleccionadas como ponedoras desarrollaron osteoporosis, al desviar el calcio del esqueleto para la construcción de la cáscara de los huevos. En el caso de los pavos, estos alcanzaron un tamaño tal que dificulta su apareamiento, siendo necesario recurrir a la inseminación artificial. Vimos anteriormente que los emprendimientos exitosos en el área de mejoramiento vegetal se relacionan con caracteres debidos a un único gen, como la tolerancia a herbicida o la resistencia a insectos. Además, la recuperación rápida de la inversión, que se obtiene con la venta anual de semillas, resulta atractiva para las grandes empresas. Por el contrario, en el caso de los animales domésticos el mejorador lidia con caracteres multigénicos y enfrenta dificultades técnicas mayores. La larga duración de los ciclos de vida hace más lenta la recuperación de las inversiones, lo que torna al sector menos atractivo para las grandes empresas privadas, con la excepción de la producción de pollos. Así, el mejoramiento genético se encuentra en las manos de los ganaderos y pequeños emprendimientos privados. Estos últimos son responsables por más del 80% de la investigación y desarrollo en el área pecuaria de los países desarrollados. Las tecnologías reproductivas El control de la reproducción de los animales permite la expansión rápida de los stocks. El proceso comienza con la selección de las hembras y machos reproductores, elegidos por sus características genéticas relacionadas con la productividad y la salud (Figura 1). La inseminación artificial se practica desde mediados del siglo XX en el ganado bovino, ovino, caprino, porcino y en aves (pavos y pollos). Debido al costo que representa para el productor, la técnica es más utilizada con el 256 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria FIGURA 1. Control de la reproducción en bovinos El control de la reproducción de los animales domésticos depende de diversas técnicas (superovulación, inseminación artificial, colecta de ovocitos o de embriones, criopreservación, trasplante de embriones) Vaca donante Toro reproductor Vaca donante Ovarios de matadero Tratamiento superovulatorio Semen Tratamiento superovulatorio Congelamiento Colecta de los ovocitos Inseminación artificial Colecta de los ovocitos Fecundación in vitro Colecta de los embriones Pruebas genéticas Desarrollo in vitro de los embriones Trasplante Congelamiento Trasplante ganado lechero, que tiene un precio más alto por cabeza que el ganado de corte. En este caso, se complementa la inseminación artificial con el sexado previo del semen, para elegir los espermatozoides que originarán hembras. El semen de un reproductor se introduce en el útero de las receptoras. Como una única eyaculación de un toro produce aproximadamente 100 dosis de semen, considerando que un animal llega a producir 4.000 dosis por año y que la eficiencia de la inseminación es del 50%, el método permite obtener aproximadamente 2.000 crías por reproductor por año. Con el desarrollo de las técnicas de criopreservación se puede usar tanto el semen 257 Biotecnología fresco como el conservado, lo que posibilita también la conservación de la biodiversidad de razas en peligro de extinción. Normalmente, las vacas producen una cría por año, pero si se las trata con hormonas que inducen la superovulación, y se las insemina artificialmente, se consiguen hasta cinco embriones por vez que pueden recolectarse por lavaje uterino y transferirse a vacas receptoras o ser criopreservados. Entre el 25 y el 50% de los embriones congelados podrán originar animales vivos. Como el proceso completo (superovulación + inseminación + transferencia de los embriones) puede repetirse cuatro veces por año, a pesar de las limitaciones técnicas, una vaca podrá producir 10 crías por año. Otra variante consiste en extraer los ovocitos de las vacas superovuladas o de los ovarios de los animales sacrificados, y proceder a una fecundación artificial antes de reimplantar los embriones en las receptoras. El número de embriones puede aumentarse mediante la bipartición de estos en el estado de blastocisto (64 a 128 células) por micromanipulación. Las pruebas genéticas se pueden aplicar tanto en los padres como en los embriones, antes de la reimplantación, permitiendo una selección más precisa de la descendencia. Las nuevas tecnologías El mapeo del genoma de los animales domésticos El estudio del genoma de los animales domésticos ofrece herramientas precisas y eficientes para la selección de algunos caracteres. El objetivo básico es correlacionar los genes con secuencias no funcionales que, distribuidas a lo largo del genoma, cumplirán el papel de marcadores moleculares. Se han identificado centenas de estas secuencias en vacas, cerdos, pollos, cabras, ovejas, salmones, camarones, etc. Se trata de micro y minisatélites, es decir, secuencias cortas de ADN repetidas un número variable de veces, que se transmiten de una generación a otra y pueden ser identificadas por electroforesis. Cuando el gen responsable por un carácter de interés está asociado a un determinado marcador, ambos serán seleccionados juntos. Con caracteres monogénicos, los resultados se obtienen rápidamente; con caracteres poligénicos hay que elegir los genes que contribuyen sustancialmente en la variación. El análisis de marcadores también se utiliza en la determinación del parentesco (pedigrí) y en la identificación de los animales, tanto en el campo como en los productos derivados. 258 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria Ya han sido secuenciados los genomas de algunos animales domésticos. A medida que se completen otros y se conozcan mejor las secuencias que se expresan en las moléculas de ARNm, las técnicas electroforéticas podrán reemplazarse por chips de ADN (microarrays). La clonación A partir de la década de 1980, la partición embrionaria posibilitó la clonación de animales domésticos. En los últimos años, se abrieron otras perspectivas interesantes con la técnica de transferencia nuclear, que consiste en la transferencia del núcleo de una célula donante a un ovocito receptor, previamente anucleado, de otro animal. El primer animal obtenido por esta técnica fue Dolly (1997-2003), después de 277 intentos fallidos (Figura 2). Dolly tuvo que ser sacrificada después de tener artritis en una pata, mostrar señales de envejecimiento prematuro y desarrollar un tumor en el pulmón. Las dificultades técnicas de la transferencia nuclear se centran, principalmente, en la estimulación del citoplasma receptor y la coordinación entre la actividad citoplasmática y nuclear. Como el número de fracasos aún es alto, se requieren muchos intentos para conseguir un animal viable. Los problemas de salud son también más frecuentes en los clones, que pueden presentar tiempos de gestación más largos y mayores tamaños al nacer, además de tasas de mortalidad y número de malformaciones congénitas más altas. La clonación se aplica a los animales fundadores, porque los beneficios justifican el costo del procedimiento. Algunos ejemplos son: Bull 86 Squared, clon de un toro resistente a la brucelosis, salmonelosis y tuberculosis; Full Flush, toro clonado para atender a la demanda del mercado de semen; Annabell Zeta, vaca Holstein especial para la producción de manteca y clonada con éxito por presentar problemas de fertilidad; Second Chance, nacido después de 189 intentos de clonado de Chance, un toro que participó en rodeos y películas. La tecnología también se desarrolla en Argentina y Brasil. Ciruelito es un clon de Ciruelo, gran campeón de la raza Brangus. Lenda y Gloria, de Embrapa, descienden de Vitória, una vaca de raza Simental, nacida por transferencia nuclear; Porã y Potira descienden por biopartición embrionaria de una vaca de raza Junqueira en riesgo de extinción. En ambos países existen empresas privadas especializadas en la clonación comercial de bovinos, en emprendimientos ligados a universidades o institutos de investigaciones agronómicas (BioSidus, ARG Natural Beef; Vitrogen, Geneal). 259 Biotecnología FIGURA 2. Dolly El procedimiento comprendió la transferencia del núcleo de una célula mamaria a un ovocitoanucleado, y su reimplantación en el útero de otra oveja Oveja Finn Dorset Oveja Scottish Blackface Cultivo de células de glándula mamaria Ovocitos (metafase II de la meiosis) Transferencia del núcleo Remoción del cuerpo polar y del núcleo del ovocito Activación eléctrica y fusión Embrión (una célula) Implantación en el útero de una oveja Scottish Blackface Dolly 260 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria La clonación también se utiliza para animales de élite enfermos o accidentados. Se estima en unos US$ 20.000 el precio de un ternero clonado en los Estados Unidos, y se cree que de aquí a algunos años el precio podrá ser suficientemente interesante como para poder aplicar el mejoramiento directo en la pecuaria. También fueron clonados equinos. En 2003, la mula Joy of Idaho fue el primer clon de un híbrido entre una yegua y un jumento. En Italia, ese mismo año y después de 847 tentativas, nació Prometea, que originada a partir de una célula somática materna es al mismo tiempo hija y hermana gemela de su madre. En 2005 se obtuvieron los primeros clones de un caballo de corrida (Pieraz Cryozootech) y de un caballo de salto (Paris-Texas). En Brasil, las potras Branca y Neve fueron obtenidas por bipartición embrionaria. Sin embargo, el futuro de la clonación de equinos parece limitado, porque la inseminación artificial y los tratamientos de fertilidad están prohibidos en los caballos de carrera. Más allá del aumento de la tasa de fertilidad de animales de élite y la conservación de animales que, a pesar de su baja fertilidad, tengan características interesantes, hay otras aplicaciones posibles de la clonación. Puede usarse para la conservación de especies raras en riesgo de extinción, para la cría de rebaños homogéneos que faciliten los trabajos de investigación, y para la propagación rápida de algunos organismos transgénicos. Esta última aplicación justifica la importancia que tuvo Dolly, porque dado el costo de un animal transgénico, resulta más económico hacer un clon que construir otro. La transgénesis El primer ratón transgénico nació en 1981. A partir de 1988 comenzaron a generarse vacas, cabras, conejos, ovejas, pollos, cerdos y peces transgénicos. Pocos meses después del nacimiento de Dolly, el mismo grupo del Instituto Roslin y PPL Therapeutics anunció el nacimiento de Polly, una oveja transgénica para el gen codificador del factor IX, una proteína fundamental para la coagulación sanguínea y que falta en los hemofílicos. Una de las preocupaciones existentes se relaciona con el riesgo de escape de un animal transgénico y la posibilidad de que el transgén se propague en las poblaciones naturales. Este riesgo depende de algunas características del animal, especialmente su movilidad y su capacidad de escapar del cautiverio y de volver al estado salvaje (Tabla 1). Otros factores adicionales que deben considerarse en una evaluación del riesgo son: la viabilidad juvenil, la edad 261 Biotecnología TABLA 1. El riesgo de escape de un animal transgénico Especie Ratones Peces Insectos Cerdos Aves Vacas Movilidad Alta Alta Alta Baja Baja Baja Capacidad de volver al estado salvaje Alta Alta Alta Alta Baja Baja Capacidad de escapar del cautiverio Alta Alta Alta Moderada Baja Baja de madurez sexual, la fertilidad del macho, la fecundidad de la hembra, la viabilidad del adulto, etcétera. La comercialización de animales transgénicos o de sus productos avanza muy lentamente, no solo por el alto costo demandado como por el tiempo necesario para responder al proceso regulatorio y a la resistencia eventual de los consumidores. 3. EL MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN Carne, leche, huevos y lana La producción de alimentos es uno de los objetivos fundamentales de la actividad agropecuaria. El empleo de modificadores metabólicos permite no solo incrementar la producción, sino también modificar la relación carne/ grasa, para disminuir el desperdicio. Entre los modificadores metabólicos más utilizados están las hormonas bST (somatropina bovina) y pST (somatropina porcina), producidas a partir de microorganismos transformados por ingeniería genética. Las hormonas estimulan el crecimiento en terneros y cerdos y su uso generó polémicas, prohibiéndose en algunos países de Europa. Sin embargo, la bST es usada comercialmente en 19 países, entre los cuales están Argentina y Brasil. Hay experimentos de transgénesis que pretenden mejorar la calidad de la leche de vaca modificando las proteínas (leche humanizada para lactantes) o 262 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria reduciendo la lactosa (para las personas con intolerancia). En Nueva Zelanda y Estados Unidos se obtuvieron vacas que producen leche con más caseína, una característica interesante para la industria de quesos. También se hicieron algunos intentos de transgénesis con ovejas para mejorar la producción de fibras sin que sea necesario agregar suplementos de aminoácidos en la dieta. El objetivo es modificar la estructura de las fibras de lana y de cashmere de manera de facilitar el teñido y disminuir el encogimiento del tejido. Las propiedades de la seda se podrán alterar por transgénesis del gusano de seda. A partir de una proteína de araña, sintetizada por una cabra transgénica, se desarrolló y patentó el Biosteel, una fibra muy resistente que puede tener diversos usos, inclusive militares. En la década de 1980 se obtuvo un ratón dos veces más grande que lo normal por inserción del gen de la hormona de crecimiento humana. Cuando se repitió la experiencia con cerdos, se obtuvo el Beltsville pig, un animal que presentó problemas de diversa índole: dificultades respiratorias, artritis, letargia, etc. El fracaso suscitó varios cuestionamientos éticos en relación al tratamiento infringido a los animales. De un modo general la transgénesis de la hormona de crecimiento (GH, del inglés growth hormone, y GHFR, del inglés growth hormone factor releasing) en los animales domésticos ha sido problemática, salvo en peces. La acuicultura Los principales productores de peces, mariscos y crustáceos por acuicultura son Noruega, Chile, Canadá, Estados Unidos, Reino Unido, Nueva Zelanda y los países asiáticos. El desarrollo de la acuicultura parece una alternativa razonable para la producción de alimentos porque, debido a la pesca desmedida, las reservas de peces en los mares y océanos han disminuido de forma alarmante. Sin embargo, desde el punto de vista ecológico, quedan algunas dudas relativas a las ventajas de la acuicultura. Algunos peces, como carpas y tilapias, no exigen ninguna complementación de la ración. Pero el camarón y el salmón son criados con alimentos balanceados, cuya composición incluye harina de pescado. ¿Cuáles serían las ventajas de la acuicultura si hubiera que extraer peces para la preparación de las raciones? La cría de peces y mariscos es una actividad empresarial que crea empleos, demanda pocos insumos y genera un producto de alto valor agregado. Sin embargo, tiene algunos problemas, como la distancia a los mercados 263 Biotecnología de destino y la contaminación de las aguas costeras, dificultando la cría de mariscos filtradores de plancton y favoreciendo el florecimiento de algas. Esta actividad da un retorno económico importante para Noruega, Chile, Canadá y Estados Unidos. Las aguas y los inviernos canadienses son mucho más fríos que los chilenos, donde el salmón puede criarse el año entero, de modo que los productores canadienses y norteamericanos se interesaron en salmones resistentes al frío y de crecimiento rápido. La empresa AquaBounty transfirió al salmón del Atlántico un “casete” de expresión, denominado AquAdvantage, con dos genes para una proteína anticongelante y una hormona de crecimiento del salmón del Pacífico. El pez resultante consume 250% más de comida, pero crece rápidamente en condiciones comerciales, alcanzando el tamaño equivalente a un salmón convencional en menos tiempo (18 meses en lugar de 24 o 30). Según el Protocolo de Cartagena, los peces transgénicos deben criarse exclusivamente en confinamiento. Por eso, la explotación comercial de salmones transgénicos no podrá hacerse como hasta ahora, en jaulas marinas. Deberá hacerse en criaderos dentro del territorio, de manera de disminuir los riesgos de escape. AquaBounty planea instalar los criaderos en Panamá, en regiones de altitud con temperatura adecuada y ríos desfavorables para la sobrevivencia del salmón. Se aguarda la autorización del FDA para iniciar la explotación comercial. Se calcula que actualmente habría unas 30 variedades de peces transgénicos, en laboratorios de todo el mundo. Tilapias y carpas transgénicas están en trámite de aprobación en Cuba y China, respectivamente. Se está tratando de desarrollar otros productos, como una trucha con más ácidos grasos Omega 3 y camarones desprovistos de la proteína responsable del 80% de las alergias. 4. LA SALUD DE LOS ANIMALES Resistencia a las enfermedades La selección genética de animales resistentes es una forma de reducir el perjuicio debido a las enfermedades, estimado entre el 10 y el 20% de la producción. En el Reino Unido, la resistencia al scrapie, por ejemplo, se transformó en una condición indispensable para la entrada de cualquier ovino en un programa de mejoramiento. 264 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria El mapeo del genoma de los animales domésticos facilitará la tarea de seleccionar animales resistentes a enfermedades, como pollos resistentes a la enfermedad de Marek y a la salmonelosis. En Francia, la transgénesis se está usando para la obtención de truchas resistentes al VSH (virus de la septicemia hemorrágica), responsable de la pérdida de un cuarto de la producción. En otros países, se investiga la introducción de genes que confieran resistencia a enfermedades que afectan al ganado, como la tripanosomiasis africana o la aftosa. Prevención y tratamiento Las prácticas intensivas o semi intensivas favorecen la transmisión de enfermedades entre los animales. Los principales productos desarrollados para la salud animal son las vacunas, los kits de diagnóstico, los tratamientos (antibióticos, antiparasitarios) y los suplementos (hormonas). Existen numerosas vacunas contra las enfermedades de los animales. Muchos trabajos apuntan actualmente a la producción de vacunas formadas por unos pocos antígenos, en plantas modificadas genéticamente que puedan ser administradas en el alimento. También se está desarrollando una vacuna que permitiría inmunizar a los animales contra una hormona reproductiva (GnRH o gonadotrophin-release hormone), como una alternativa para la castración de toros y cerdos. Algunos animales domésticos constituyen un reservorio de enfermedades que pueden ser transmitidas al hombre. Al preservar la salud de los animales se disminuye el riesgo de contagio. Es el caso de una vacuna contra la leishmaniasis canina, desarrollada recientemente en Brasil, que limita la transmisión de la enfermedad del perro al hombre. Los análisis de ADN permiten la tipificación de los agentes patogénicos y los estudios epidemiológicos. Los ensayos inmunoenzimáticos se usan para el diagnóstico de varias patologías y también para el reconocimiento de diversos tipos de contaminación en los productos (Salmonella, Escherichia coli, Listeria). Actualmente se producen medicamentos para unas 200 enfermedades animales diferentes. Las compañías veterinarias invierten aproximadamente US$ 400 millones por año en investigación y desarrollo, pero de un modo general, la salud animal mueve mucho menos dinero que la salud humana. Salvo en relación a las mascotas, el mercado tiene un crecimiento lento. En América Latina hay numerosas empresas del sector privado que elaboran medicamentos, vacunas y pruebas de diagnóstico para la salud 265 Biotecnología animal. Entre las principales: Biogénesis y Bagó (Argentina), Vallée (Brasil), BiosChile (Chile), Laverlam (Colombia), IASA (México), Laboratorios Santa Elena (Uruguay). Cuba se destaca por la vacuna contra la garrapata, que se vende en varios países de América Latina. La fiebre aftosa es una endemia que afecta la producción de carne y leche. Es fundamental el desarrollo de nuevas vacunas, más eficientes y fáciles de aplicar, en las regiones donde la enfermedad no fue totalmente erradicada y donde cada tanto aparecen brotes: Argentina, Brasil, Colombia, México, Paraguay y Uruguay. Las vacunas DIVA (del inglés, differentiating infected from vaccinated animals) son especialmente interesantes, porque permiten distinguir animales infectados de animales vacunados. Se estudia también la sustitución da la vacuna actual de virus desactivado por alfalfa transgénica que exprese algunas proteínas del virus de la aftosa (plant pharming). En la producción de vacunas veterinarias se aplican habitualmente las tecnologías más avanzadas. Hasta 2011, fueron autorizadas en Brasil 12 vacunas genéticamente modificadas para uso animal. Por otro lado, la acuicultura abre un espacio para las empresas productoras de pruebas de diagnóstico y vacunas para los patógenos que afectan a los criaderos. Empresas argentinas y chilenas (Tecnovax, Recalcine, AquaGestión) desarrollaron una vacuna contra el virus de la anemia infecciosa del salmón. 5. LOS NUEVOS USOS DE LOS ANIMALES DOMÉSTICOS Modelos de estudio para enfermedades humanas La transgénesis de ratas, ratones, conejos y monos les confiere características que permiten su empleo como modelos de enfermedades humanas. El primero se obtuvo en 1988, cuando se trasplantaron tejidos del sistema inmune de un feto humano a ratones genéticamente inmunodeficientes, obteniéndose animales con un sistema inmune humano. En el mismo año se obtuvo el oncomouse, un ratón con un gen para el cáncer de mama que permite evaluar tanto el efecto cancerígeno de algunas sustancias como la acción terapéutica de otras. Con este ratón, la Universidad de Harvard recibió la primera patente para un animal transgénico. A partir de ese momento, se rediseñaron varios animales para servir como modelos: conejos con diferentes genes para lipoproteínas humanas que resultan sensibles o resistentes a regímenes ricos en colesterol; ratones modificados genéticamente para estudiar la epilepsia, la obesidad, etcétera. 266 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria Xenotrasplantes El cerdo es considerado el donante ideal para los trasplantes, porque el tamaño y función de sus órganos son equivalentes a los humanos. Las válvulas cardíacas humanas pueden ser sustituidas por las de cerdo, después de destruir las células porcinas. Para evitar el rechazo de un órgano de cerdo trasplantado, habrá que modificar algunas moléculas de las células del donante, aunque persiste uno de los mayores riesgos de los xenotrasplantes, que es la transmisión de virus de una especie a otra. Los animales como biorreactores Debido a la necesidad de modificaciones postraduccionales, algunas proteínas recombinantes solo pueden ser sintetizadas en células animales. Estas pueden cultivarse en biorreactores, pero la cantidad de proteína producida es muy pequeña y los costos de producción son muy elevados. Una solución es transformar genéticamente a un animal y convertirlo en un biorreactor que produzca la proteína de interés en la leche, la sangre, la orina o los huevos. De hecho, se necesita de dos a tres veces menos de capital inicial y el costo de la proteína recombinante cae de cinco a diez veces. La autorización comercial de ATryn, una antitrombina con propiedades antiinflamatorias y anticoagulantes, en Europa (2006) y en Estados Unidos (2009), modificará rápidamente el mercado de factores de coagulación recombinantes. La empresa responsable, GTC Biotherapeutics, tiene en el pipeline más de 60 proteínas recombinantes de uso terapéutico, producidas en cabras y vacas. Otras empresas también tienen productos en la fase de estudios clínicos. En Escocia, PPL Therapeutics cría 200 ovejas que producen AAT (-1antitripsina), una proteína que se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de enfisema hereditario y fibrosis quística. En Holanda, Pharming BV obtuvo vacas productoras de lactoferrina humana, una proteína con propiedades antimicrobianas. En Argentina Biosidus desarrolló un tambo farmacéutico, con dos dinastías de vacas: Pampa, productora de hormona de crecimiento, y Patagonia, productora de insulina. En Brasil, la Universidad de Ceará mantiene un rebaño de cabras transgénicas de la raza Canindé que produce en la leche el factor estimulante de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF). En Estados Unidos, Hematech mantiene un rebaño en el que los genes bovinos fueron removidos (knock out) y sustituidos (knock in) por genes humanos. Una vez inmunizados, los animales producen anticuerpos policlo267 Biotecnología nales humanos que pueden ser utilizados para combatir infecciones o para tratar personas que tengan el sistema inmune comprometido o con enfermedades autoinmunes (artritis rematoide). Anticuerpos humanos (Origen Therapeutics) e interferón (AviGenics) también son producidos en huevos de aves transgénicas. Hay otras experiencias en marcha: la producción de anticuerpos monoclonales para la artritis reumatoide en la leche de rumiantes, y la generación de vacas lecheras resistentes a la mastitis, porque expresan una proteína antibiótica que mata a Staphylococcus aureus. También se están generando productos para hacer frente a un eventual brote de bioterrorismo, como por ejemplo, anticuerpos humanos contra el ántrax, la viruela y el botulismo, en vacas transgénicas (TransOva); o antídotos contra armas químicas como el gas sarín, en cabras (Nexia). Todas estas aplicaciones exigen que se cumplan normas de seguridad muy estrictas. Es fundamental extremar los cuidados en la eliminación de los cadáveres y evitar el escape de animales transgénicos que fabrican productos medicinales, así como la entrada accidental de estos productos en la cadena alimentaria. El marco conceptual de “las tres R” El uso de animales en experimentos ha suscitado numerosos debates relativos al sufrimiento que se les infringe y a la dificultad de extrapolar al hombre la información obtenida en esas investigaciones. En 1959, Russell y Burch establecieron un marco conceptual conocido hoy como “las tres R”: reemplazar, reducir y refinar (Tabla 2). Las tres R dieron lugar a una reflexión ética sobre la experimentación con animales. A TABLA 2. Significado y alcance de las tres R R 1 2 Significado Reemplazar Reducir Ejemplos Reemplazo de animales vertebrados conscientes por seres inconscientes o por métodos in vitro. Reducción del número de animales necesario para la investigación mediante diseños experimentales estadísticamente más precisos. Minimizar al máximo la falta de confort o el sufrimiento de los animales. 3 Refinamiento 268 Capítulo XIV. Biotecnología y pecuaria pesar de discutirse hasta qué punto debe ser restringida la experimentación en animales, se admite que hay límites que deben ser respetados. Cabe a los comités de Ética de las instituciones de investigación analizar estos aspectos en cada proyecto que involucre a seres vivos, evitando el conflicto entre el bienestar de los seres humanos y el de los animales. 6. LAS MASCOTAS El bienestar de los animales domésticos es una responsabilidad humana, que debe brindarles calidad de vida y minimizar el sufrimiento y el dolor. Entre estos animales, las mascotas constituyen un grupo aparte. Sometidos a procesos de selección diversos, sufren algunas consecuencias negativas como la sordera, que afecta a casi el 10% de los dálmatas. Los perros son portadores de 300 condiciones genéticas recesivas, de las cuales 250 fueron descriptas también para el hombre. El mercado es propicio para la clonación de las mascotas y algunas empresas ya están probando esta tecnología, que hasta ahora parece ser más fácil para los gatos (Copy Cat) que para los perros. En 2010 se gastaron US$ 11 mil millones en productos de salud para los pets norteamericanos. Se trata de vacunas (rabia, hepatitis, leucemia felina, etc.) y medicamentos (artritis, parásitos, alergias, problemas dentarios, enfermedades cardíacas, fallas renales, ansiedad de separación, síndrome de disfunción cognitiva, etcétera). El desarrollo de Night Pearls, un pez transgénico que brilla en la oscuridad, costó US$ 2,9 millones. Inicialmente diseñado para monitorear la calidad del agua, se transformó luego en mascota. Existen variedades con fluorescencia verde (TK-1), roja (TK-2) y con una combinación de ambos colores (TK-3) a un precio de lanzamiento en Taiwán, en 2003, de US$ 17,40. 269 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos 1. LOS ALIMENTOS FERMENTADOS La preparación de alimentos fermentados remonta aproximadamente a 6.000 a.C. Constituye un descubrimiento espontáneo, repetido más tarde en forma independiente por varios pueblos. Las principales ventajas de la fermentación son la eliminación de las sustancias tóxicas de algunos granos y la preservación de los alimentos. A lo largo del siglo XIX, los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos y las enzimas abrieron el camino para la producción industrial de alimentos que hoy se basa en varias disciplinas (microbiología, bioquímica, ingeniería, etcétera). Los alimentos fermentados representan la tercera parte de la dieta humana. Sea porque los nutrientes se asimilan más fácilmente, o porque tienen menos componentes tóxicos, muchos de esos alimentos son considerados “funcionales”, es decir, que brindan beneficios extras además de los correspondientes a su propia composición. Además de los productos de panificación, las bebidas alcohólicas y los lácteos, existen otros alimentos fermentados por acción microbiana o enzimática. Aunque algunos son de origen animal (pescado, jamones y embutidos), la mayoría es de origen vegetal (chucrut, pickles, aceitunas, café, cacao, té), especialmente los productos orientales (salsa de soja, miso, tempeh, kimchi, etc.) y africanos (gari, kokonte o lafun, agbelima, togwa, kenkey, etcétera). El pan El arte de la panificación nació entre 7.000 y 5.000 a.C. Los primeros panes eran unas galletas chatas de cereales molidos y agua, cocidas sobre piedras calientes. Más tarde debe haberse observado que la textura y digestibilidad de las galletas mejoraba cuando la masa era dejada un tiempo en reposo. El paso siguiente fue la conservación de una pequeña parte de la masa cruda, para agregarla a la preparación siguiente. Este procedimiento ya era conocido por egipcios y hebreos, hace unos 5.000 años. 271 Biotecnología Hoy se sabe que en la masa del pan, las enzimas del cereal digieren el almidón y liberan azúcares. Estos son transformados en ácido láctico y en etanol por los microorganismos presentes (bacterias y levaduras). El CO2 desprendido forma burbujas que confieren a la masa su textura característica. Además de acelerar el levado, la preparación artesanal de la masa tuvo como consecuencia la selección y el enriquecimiento de los microorganismos de los cereales. Durante muchos siglos, cada panadero preparaba su fermento y elaboraba su pan por “fermentación natural”. El gran paso hacia la panificación industrial tuvo lugar en 1876, en los Estados Unidos, cuando los emigrantes austro-húngaros Charles y Max Fleischmann patentaron un procedimiento para producir cubos de levadura prensada. El lanzamiento comercial tuvo un éxito notorio. Actualmente, se comercializan tres tipos de levaduras de panificación (fermento biológico). El fermento prensado activo (68-72% de humedad) requiere refrigeración durante el almacenamiento y dura entre tres y cinco semanas. El fermento seco no activo se conserva más tiempo y no exige refrigeración, pero debe hidratarse antes de usar. El fermento activo instantáneo no requiere hidratación, pudiendo agregarse directamente a los ingredientes secos. En la década de 1990, en el Reino Unido, se usaron cepas rápidas obtenidas por ingeniería genética, pero su uso fue discontinuado en seguida debido a la poca aceptación de los consumidores. Aunque algunos panaderos conservan todavía el proceso de fermentación natural, poco a poco este va siendo reemplazado por la panificación industrial. La masa es preparada mezclando harinas de uno o más tipos, agua, levaduras y diversos aditivos: emulsificantes, agentes oxidantes y reductores, enzimas ( y -amilasas, hemicelulasas, lipasas, etc.) y aceleradores de la fermentación. El proceso comprende tres fermentaciones, durante las cuales el CO2 liberado forma burbujas dentro de la masa, aumentando su volumen y esponjosidad. Entre las fermentaciones, la división de la masa y el boleado permiten la redistribución de los ingredientes. Poco a poco, cambian las propiedades organolépticas de la masa. El moldeo permite alinear las fibras proteicas. Durante la cocción, la mezcla etanol-agua evapora y la corteza toma un color dorado. Luego, el pan es cortado y envasado (Figura 1). 272 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos FIGURA 1. Etapas de la panificación La masa también puede llevar otros ingredientes, como grasa, azúcar, leche en polvo, huevos, miel, jarabes, frutas, especies, etcétera Harinas Agua Levaduras Enzimas Otros aditivos Mezcla de los ingredientes FERMENTACIÓN PRINCIPAL División de la masa Boleado FERMENTACIÓN SECUNDARIA Moldeo FERMENTACIÓN FINAL Cocción Enfriamiento Corte en rodajas y embalaje Distribución El vino La vinificación El vino, una bebida obtenida por la fermentación alcohólica de la uva, se originó en el norte de África y en Europa alrededor de 3.000 años a.C. Durante la maduración de la uva, diversas poblaciones microbianas se suceden naturalmente, realizando primero la fermentación alcohólica y después 273 Biotecnología la acética, que transforma el alcohol en ácido acético. Considerando que el destino final de la uva es el vinagre, el arte de la vinificación representa un considerable logro tecnológico. La uva está compuesta por agua (86%), azúcares (12%) y otras moléculas (2%). Se retira el jugo exprimiendo o prensando la pulpa; frecuentemente se agregan enzimas de maceración (pectinasa, celulasas y hemicelulasas) para mejorar el rendimiento. Desde el punto de vista microbiológico, la vinificación comprende dos fermentaciones. La primera es una fermentación alcohólica, un proceso que dura de cuatro a diez días y en el que la levadura Saccharomyces cerevisiae transforma los azúcares en alcohol. La segunda, o fermentación maloláctica, es llevada a cabo por bacterias que transforman el ácido málico (diácido) en ácido láctico (monoácido), disminuyendo la acidez del vino y promoviendo las modificaciones aromáticas que constituyen la base del bouquet. Este se afinará más tarde con el envejecimiento del vino (Figura 2). El cultivo de la vid El cultivo de la vid es una tarea compleja que exige tratamientos, injertos y podas. La multiplicación vegetativa de las vides garantiza la calidad constante, pero aumenta la fragilidad de la plantación frente a los patógenos. Hay diferentes especies de vides; la Vitis vinifera brinda los vinos más finos, mientras que la Vitis labrusca, Vitis ripari, y otras variedades más rústicas de la propia Vitis vinifera, se destinan a la elaboración de vinos comunes. Para cada cultivo existe un suelo y clima ideal (terroir) fuera del cual pueden ser cultivadas, pero probablemente con resultados inferiores. La variedad o cultivar utilizado permite clasificar los vinos en: Pinot noir, Chardonnay, Pinot blanc en los Borgoña, Cabernet-Sauvignon en los Bordeaux, Sangiovese en los Chianti y Zinfendel en los vinos californianos (vinos varietales). Según el proceso utilizado en la elaboración del vino, una misma variedad, como Pinot Noir, podrá originar bebidas tan diferentes como un Borgoña o un Champagne. También existen vinos que resultan de la mezcla de diversos cultivares (vinos de corte). En 2007, un grupo franco-italiano completó el mapa del genoma de Vitis vinífera, variedade Pinot Noir. La información abarca más de 30.000 genes, algunos de los cuales son responsables por los aromas y sabores del vino, mientras que otros regulan la cantidad de resveratrol, una molécula que disminuye los niveles de colesterol. Los estudios genómicos abren nuevas perspectivas para los viticultores, como el monitoreo de la maduración de 274 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos FIGURA 2. Etapas de la vinificación Vinificación en tinto. La uva negra se estruja y macera formando el mosto; después de las correcciones de acidez y azúcar el mosto pasa a la cuba de fermentación, donde se agrega SO2 para eliminar contaminaciones bacterianas. El mosto fermentado es separado de la borra trasvasándolo, y pasa por una segunda fermentación (fermentación maloláctica). Después de la clarificación, el vino límpido se estabiliza por dos años antes de ser embotellado. Vinificación en blanco. Generalmente se usa uva blanca, aunque se puede usar la negra si se remueven los pellejos del mosto, que son los que liberan los pigmentos que le confieren color al vino. Se evita la fermentación maloláctica, salvo en los vinos blancos de Borgoña. En el caso de los vinos espumantes, ocurre una segunda fermentación en la botella. Los vinos rosados o “rosé” pasan por un proceso similar al de la vinificación en tinto, pero el mosto se macera con los pellejos por menos tiempo. A veces resultan de mezclas entre blancos y tintos. UVA NEGRA UVA BLANCA Estrujado Estrujado Maceración Inoculación Inoculación FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Clarificación Clarificación Envejecimiento Embotellamiento Embotellamiento VINO TINTO VINO BLANCO 275 Biotecnología la fruta con arrays de marcadores moleculares, porque permite determinar el momento adecuado para la vendimia. La genómica también permitió identificar y seleccionar genes de resistencia a algunas enfermedades, pero la transferencia de esos genes de una variedad a otra es vista con mucha desconfianza por la mayoría de los productores, porque el rótulo de varietal es parte de la estrategia de ventas de los vinos de buena calidad. Con la entrada en el mercado internacional de otros países menos apegados a las tradiciones (Estados Unidos, Chile, Argentina, Brasil, Sudáfrica, Australia, etc.), es posible que las nuevas tecnologías genómicas se apliquen a la producción de plantas resistentes a enfermedades y plagas. Algunos productores también aceptarían la transferencia de genes de vides rústicas a plantas de élite, con el objetivo de mejorar la producción. La obtención de un vino tinto o blanco depende de la uva y del procedimiento explicado en la figura 2. El rol de la levadura en la vinificación Aunque las propiedades organolépticas de los vinos están relacionadas directamente con el cultivo, las enzimas de la uva y las actividades metabólicas de levaduras y bacterias cumplen también un papel importante durante la vinificación. La transformación del mosto en vino comprende numerosas reacciones químicas, llevadas a cabo por levaduras y bacterias lácticas. Con el mapeo del genoma de estos microorganismos y la construcción de microarrays adecuados, esas reacciones podrán conocerse y controlarse mejor. La industria cuenta con una gama amplia de cepas de levaduras, que fueron seleccionadas por sus características favorables al proceso de vinificación: crecimiento rápido, eficiencia en la conversión del azúcar en etanol, producción de sustancias aromáticas agradables (ésteres y terpenos, entre otras), tolerancia al SO2, agregado como inhibidor del crecimiento de microorganismos indeseables, etc. Sin embargo, algunos productores consideran que esas cepas masifican la calidad del vino y prefieren utilizar las levaduras naturales, para obtener un producto original cualitativamente diferente de los otros. Bancos de levaduras naturales facilitan la conservación de la biodiversidad. Recientemente, dos cepas de levaduras genéticamente modificadas entraron en la industria de vinos de Estados Unidos y Canadá. Una de ellas es la levadura ML01, que realiza ambas fermentaciones (alcohólica y maloláctica), evitando la producción de histaminas. La otra es la levadura 276 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos ECMo01 que degrada la urea, evitando la formación de uretano, una sustancia cancerígena. La cerveza Las bebidas fermentadas representan una opción saludable cuando el agua falta o es de mala calidad. En algún momento todos los pueblos descubrieron la fermentación y la utilizaron para elaborar alguna bebida alcohólica a partir de los elementos disponibles en su región: granos, frutas, raíces, tallos u hojas. La cerveza se originó después del pan, pero se sabe que ya en 4.000 a.C., en las márgenes de los ríos Tigris y Eufrates (Mesopotamia), eran preparadas alrededor de 20 variedades. La técnica básica consistía en deshacer el pan de cebada en un recipiente con agua azucarada y, una vez concluida la fermentación, filtrar y trasvasar la bebida. Los métodos mejoraron a partir del siglo VII, cuando los frailes introdujeron algunas innovaciones y experimentaron el agregado de diversas hierbas, pero recién en el siglo XI comenzó a añadírsele lúpulo. El siguiente descubrimiento fue la técnica de la fermentación baja, en la que la sedimentación de las levaduras confiere mayor estabilidad a la bebida (siglo XV). Los trabajos de Pasteur y el progreso de la microbiología (siglo XIX) permitieron el desarrollo de una poderosa industria, cuya producción mundial es en la actualidad de mil millones de hectolitros por año. La fabricación industrial de la cerveza inicia con el malteado de la cebada. Primero se macera el grano, y al comenzar la germinación se la interrumpe para el secado y la molienda (Figura 3). Aunque el grano es rico en almidón, este proceso es indispensable porque las levaduras no tienen las enzimas necesarias para transformar el almidón en azúcares fermentables. Estos se producen durante el malteado. La maceración comienza al mezclarse la malta con el agua y finaliza cuando el mosto es filtrado y hervido. Luego se agregan las flores de lúpulo (Humulus lupulus, de la familia Cannabinaceae), que dan a la bebida un sabor amargo característico y tienen una acción antiséptica. El malteado y el macerado preceden a la fermentación alcohólica, que estará a cargo de las levaduras (Saccharomyces cerevisiae). Los procesos más tradicionales usan levaduras que se acumulan en la superficie de la cuba (cervezas del tipo ale, con menos del 4% de alcohol), pero hay otras que sedimentan en el fondo (cervezas de tipo lager, con más del 6% de alcohol). Una vez concluida la fermentación, se pasa a los tratamientos finales (maduración, clarificación, carbonatación, pasteurización y embotellamiento). 277 Biotecnología FIGURA 3. Etapas de la preparación de cerveza La malta se obtiene interrumpiendo la geminación del grano para el secado y la molienda Cebada Malteado (maceración, germinación, secado y molienda de la malta) Malta Maceración (mezcla, filtración y cocción del mosto) Mosto Levaduras FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA Agua Lúpulo Cerveza Terminación (maduración, pasteurización y embotellamiento) Comercialización Por el momento, la tecnología del ADN recombinante se limita a las transformaciones que utilizan genes de la misma especie (Saccharomyces cerevisiae). El objetivo es mejorar las condiciones del proceso fermentativo y adaptarlo a la cebada y al lúpulo de diferentes regiones del mundo. Las cepas así obtenidas aún no son empleadas comercialmente. Los quesos y yogures Los procesos productivos Las raíces de la industria láctea se remontan al Medio Oriente de 3.000 a.C., cuando el hombre comprobó que al cuajar, la leche cambiaba de consistencia 278 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos y de sabor. El suero debía ser consumido fresco, pero podía conservarse más tiempo añadiéndole sal. Alrededor de 2.000 a.C., el uso de estómagos de cabras y ovejas como recipientes para la leche permitió obtener quesos más sólidos y robustos. Más tarde, los romanos utilizaron extractos de higo y otras plantas para cuajar la leche. La explicación de estos fenómenos es sencilla. Las bacterias, presentes en la ubre de los animales, contaminan la leche y proliferan formando ácido láctico. Al acidificarse el medio, las proteínas precipitan separándose del suero. Tanto las enzimas de la mucosa estomacal (renina y pepsina) como la ficina (higo) pueden sustituir a las bacterias. Actualmente la producción mundial de leche fermentada (yogur, cuajada, kefir, etc.) es de 3 millones de toneladas por año, mientras que la de quesos llega a 15 millones de toneladas por año (Figura 4, A). Hay varias especies bacterianas que pueden fermentar la leche: Streptococcus thermofilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, etc. La mayoría de los productos vendidos como “leche fermentada” contiene un número alto de microorganismos vivos que se consumen como probióticos, para prevenir el desarrollo de otros microorganismos indeseables o patógenos en el tubo digestivo. Todos los quesos pasan por tres etapas: la coagulación, el desuerado y la maduración (Figura 4, B). Sin embargo, las variaciones posibles se traducen en más de 400 tipos de quesos diferentes. Mudan el origen de la leche (vaca, cabra, oveja, búfalo), el agente usado para la coagulación (calor, enzimas, bacterias lácticas o ambas), la humedad y consistencia (blando, semiduro, duro y muy duro) y la maduración. Muchos países aceptan 35 variedades definidas por reglas internacionales. El rol de microorganismos y enzimas La producción de quesos comprende la acidificación del medio por las bacterias lácticas, generalmente Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus. El cuajo, una sustancia extraída del estómago de terneros, se usó como agente de coagulación enzimática durante siglos, pero el número de animales sacrificados es insuficiente para garantizar la producción. Para estabilizar la producción y satisfacer la gran demanda de productos lácteos, se transfirió el gen de la renina a una bacteria (Escherichia coli) y, más tarde, a una levadura (Kluyveromyces) y a un moho (Aspergillus). La enzima recombinante producida (quimosina) es más pura que la renina del estóma279 Biotecnología FIGURA 4. Etapas de la producción de lácteos A. Yogur tradicional y yogur batido. Las diferencias dependen de los agregados (azúcar, frutas, etc.) y de la consistencia (cremoso, firme, batido) Leche + leche en polvo (+ azúcar) Pasteurización Inoculacióncon lactobacilos Envasado FERMENTACIÓN LÁCTICA Enfriamiento FERMENTACIÓN LÁCTICA Agitación y agregado de frutas Envasado Comercialización Yogur tradicional Comercialización Yogur batido B. Queso. Los agentes biológicos intervienen en las etapas de coagulación y maduración Leche Pasteurización Inoculación con lactobacilo, cuajo o enzimas y adición de CaCl2 FERMENTACIÓN LÁCTICA Coagulación Desuerado Moldeado, prensado, salado Inoculación con hongos y/o bacterias Maduración Embalaje y comercialización 280 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos go de terneros, y su producción es constante, dos ventajas que mejoran la producción y disminuyen los costos. En relación a las bacterias lácticas, se trata de obtener cepas más estables, resistentes a bacteriófagos y productoras de bacteriocinas, que son sustancias con actividad antimicrobiana. Cepas que liberen más rápidamente sus enzimas podrían acelerar el proceso de formación de aromas. El mapeo de su genoma intensificará las investigaciones. Durante la maduración, se desarrollan bacterias y hongos que confieren características típicas a algunos quesos: la presencia de agujeros producidos por Propionabacterium en el gruyere; el crecimiento de una capa blanca de Penicillium en el camembert y el brie; las estrías azules de Penicillium en el gorgonzola y el roquefort. 2. LA PROTEÍNA UNICELULAR (MICOPROTEÍNA) En un sentido amplio, el término SCP (del inglés single cell protein) se refiere a la proteína bruta o refinada que se origina por crecimiento masivo de bacterias, algas u hongos. De hecho, la productividad de los microorganismos es mucho mayor que la de los animales domésticos. Mientras una vaca produce 200 g de proteína por día, los microorganismos podrían llegar a producir 25 toneladas en el mismo tiempo. En las décadas de 1960 y 1970 se especulaba con el empleo de derivados del petróleo como materia prima para el crecimiento microbiano. Sin embargo, la idea de un “bife de petróleo” fue abandonada con la llegada de la crisis de 1980. Actualmente, la materia prima son los excedentes y residuos agrícolas o industriales, y la finalidad es el enriquecimiento de raciones animales. La proteína de origen microbiana tiene un tenor alto de ácido úrico, que dificulta su uso en la alimentación humana y demanda un proceso extra de purificación. Sin embargo, usando el hongo Fusarium graminearum, la empresa Ranks Hovis McDougall consiguió un producto, denominado Quorn, apto para la nutrición humana. Este producto está compuesto por 45% de proteínas y aminoácidos semejantes a los presentes en la carne bovina. Tiene un alto contenido de fibras y una proporción de ácidos nucleicos considerada aceptable (1%). Por no presentar olor ni sabor, el producto puede usarse como sustituto del pescado, pollo o carne; el secreto estaría en el largo de las fibras. 281 Biotecnología 3. LOS ADITIVOS Los diversos tipos A veces, ciertas sustancias deben ser agregadas como aditivos a los alimentos para conservarlos por más tiempo (antibióticos, ácido acético, ácido láctico, etanol), complementar su valor nutritivo (vitaminas, aminoácidos) o mudar su consistencia (gomas y enzimas). También permiten mejorar el color y el flavor, un término que incluye el aroma, el sabor y la textura. Los principales aditivos son los ácidos cítrico y láctico, los colorantes naturales (-caroteno, riboflavina), los “flavorizantes” (monoglutamato de sodio, extracto de levadura, aromas), las gomas espesantes (xantano, gelano, dextrano), los antioxidantes (-caroteno), las vitaminas (B2, B12, biotina), las enzimas y los antibióticos. La mayoría se obtiene a partir de fuentes microbianas, o por cultivo de células vegetales. A pesar de la mala fama que acompaña a los aditivos, solo una de cada 6.000 personas presenta alergia o intolerancia a algún aditivo, un número muy bajo si consideramos que una persona de cada 50 es alérgica o intolerante a algún alimento. Vimos anteriormente la importancia de algunas enzimas en la producción de alimentos y bebidas por fermentación, pero hay otras aplicaciones industriales. La lactasa se utiliza para elaborar la leche deslactosada, un producto dirigido a las personas con intolerancia a la lactosa. La pectinasa aumenta en 50% la extracción del jugo de frutas retenido en la pectina, y es usada también en la clarificación del jugo. Finalmente, entre los antibióticos utilizados en la conservación de los alimentos, citaremos la nisina (INS234), que inhibe el crecimiento de bacterias Gram-positivas en quesos, salchichas y productos cocidos de origen avícola. También se usa la natamicina o pimaricina (INS235), como conservante en la superficie de productos cárnicos embutidos. Los edulcorantes Otro caso interesante es el de los edulcorantes. El uso de aspartamo (ácido aspártico y fenilalanina) disminuye el número de calorías ingeridas, mientras que el del xilitol reduce la incidencia de caries dentarias. El jarabe de glucosa o fructosa reemplaza al azúcar común (sacarosa) en la industria de alimentos. La hidrólisis ácida o enzimática (-amilasa y glucoamilasa) del almidón de maíz produce jarabes de maltosa y glucosa, mientras que la acción enzi282 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos mática de la lactasa sobre el suero de las industrias lácteas produce un jarabe de dextrosa (glucosa, galactosa). Una vez refinados y concentrados, estos jarabes pueden usarse como ingredientes en la elaboración de productos alimenticios (galletitas, helados, golosinas, etcétera). Como la glucosa tiene un poder edulcorante menor que el de la fructosa, es posible convertir la glucosa en fructosa a través de un tratamiento enzimático (glucosa-isomerasa). El jarabe obtenido, con 42% de fructosa y 52% de glucosa, es concentrado por métodos cromatográficos hasta obtener un producto con 90% de fructosa. En la industria de bebidas gaseosas se utilizan mezclas de jarabes de dextrosa y fructosa. La fabricación de estos jarabes comenzó a ser estudiada en la década de 1960, pero tenía como factor limitante el costo de la glucosa-isomerasa. El desarrollo de las técnicas de inmovilización enzimática permitió viabilizar el proceso, utilizando como materia-prima el almidón proveniente del excedente de cereales (maíz). Pero, por otro lado, perjudicó a los países productores de azúcar que vieron disminuir la demanda de este producto. Hay descubrimientos recientes que sugieren la llegada de nuevos edulcorantes al mercado como, por ejemplo, el producto de un gen microbiano que convierte 90% del azúcar de la remolacha azucarera en fructanos, que son cadenas de fructosa con el mismo sabor, pero sin calorías. 4. LOS ALIMENTOS BIOFORTIFICADOS El hombre es el único animal que no se alimenta exclusivamente por necesidad fisiológica. Dentro de sus tradiciones socioculturales, el hombre espera que los alimentos le proporcionen placer sensorial, emocional y afectivo. La elección del alimento que será ingerido responde a su visión de lo que es saludable y al miedo de ingerir algo tóxico o nocivo. Obviamente, las consideraciones económicas son decisivas en esa elección. No hay duda que el hambre se combate dándole a la población la posibilidad de acceso a los alimentos. Pero, en realidad, la falta total de alimentos es hoy un fenómeno menos frecuente que la desnutrición, causada por la carencia de determinados nutrientes en la dieta. Descrita magistralmente por Josué de Castro en la década de 1950, el “hambre parcial” o “hambre oculta” es la causa de numerosas enfermedades y afecta a más de la mitad de la población mundial, fundamentalmente mujeres y niños. Según la Organización Mundial de la Salud, el hierro, el zinc y la vitamina A son las principales deficiencias nutricionales de los países en vías de 283 Biotecnología FIGURA 5. Producción de jarabe de fructosa La hidrólisis y la sacarificación del almidón producen glucosa, que es transformada en fructosa por la enzima glucosa-isomerasa inmovilizada en un biorreactor Almidón de maíz, papa o trigo Amilasas y glucoamilasas Hidrólisis y sacarificación Glucosa Isomerización (invertasa inmovilizada) Fructosa desarrollo. Las estrategias de combate tradicionales consisten en fertilizar los suelos para enriquecer los cultivos básicos o en agregar nutrientes a los alimentos industrializados. El mejoramiento genético surge como una opción para aumentar las concentraciones de nutrientes en los cultivos básicos (arroz, maíz, trigo, poroto, mandioca y batata). Si bien la ingeniería genética parecería la vía más rápida para fortificar los alimentos, las dificultades legales encontradas por el arroz con vitamina A (Golden rice), que lleva más de 10 años sin conseguir ser comercializado, resultan muy desestimulantes. Por eso no es sorprendente que hayan sido utilizadas otras tecnologías con base biológica para fortificar los cultivos. En los bancos de germoplasma del CGIAR fueron encontradas variedades de poroto con mayor contenido de hierro, arroz y trigo con niveles altos de zinc, mandioca, maíz y batata 284 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos ricos en vitamina A, etc. Las modernas técnicas de análisis genético de los caracteres cuantitativos y especialmente la selección asistida por marcadores moleculares han facilitado el mejoramiento genético de los cultivos básicos. El objetivo es conseguir variedades nuevas que cuenten con los nutrientes necesarios y sean altamente productivas. Para ser efectivas tendrán que obtener la aceptación de los consumidores. La biofortificación de alimentos es un programa internacional desarrollado por HarvestPlus (CGIAR), un consorcio de instituciones de investigación y agencias de desarrollo que actúa especialmente en América Latina y África. En Brasil, Embrapa ha desarrollado variedades biofortificadas de poroto y maíz y las primeras pruebas ya están siendo realizadas en el nordeste. 5. SEGURIDAD ALIMENTARIA La noción de seguridad alimentaria se asienta en la tradición, por eso es conveniente analizar algunos aspectos. La industria de alimentos moderna usa cepas microbianas seleccionadas para iniciar las fermentaciones (starters). Acabado el proceso fermentativo, estos microorganismos permanecen en el medio (lactobacilos en los yogures) o son eliminados, por calor (levaduras del pan) o por filtración (levaduras de la cerveza). A pesar de haber pasado por una serie de procesos selectivos que las tornan genéticamente muy diferentes de las cepas salvajes, las starters son líneas bien conocidas cuya presencia en los alimentos no representa ningún riesgo para la salud. Las agencias internacionales las clasifican como GRAS (del inglés, generally recognized as safe), y solo microorganismos GRAS pueden ser empleados en la producción de alimentos. No existen normas particulares para que un microorganismo transgénico pueda usarse en alimentos (OGM food-grade), pero hay que tener en cuenta algunos aspectos de bioseguridad. Uno de ellos es evitar o eliminar los genes de resistencia a antibióticos que hayan sido introducidos como marcadores de selección en la transformación genética. El otro se refiere a los organismos donantes de los genes, y en este sentido hay diferentes criterios. Según el criterio más estricto, un OGM food-grade debería contener exclusivamente ADN de la misma especie, aceptándose la presencia de pequeños fragmentos sintéticos de ADN (2 a 50 pb) que sean necesarios para la construcción génica, pero a condición de no codificar ni ARN, ni proteína. La tecnología del ADN recombinante podría aplicarse a diferentes cepas 285 Biotecnología de microorganismos de la misma especie. En esta categoría se incluirían los ejemplos dados anteriormente para el mejoramiento de las levaduras para panificación y cervecería. Sin embargo, está ganando aceptación un criterio más amplio que permitiría la introducción de ADN de otros microorganismos, siempre que estos pertenezcan al mismo grupo de microorganismos participantes en el proceso. Un ejemplo sería la transferencia de genes de las bacterias malolácticas a las levaduras de la vinificación. La aceptación de OGM en los alimentos depende de las normativas de cada país, siendo mucho menos flexibles en Europa que en Estados Unidos, donde recientemente ingresó al mercado una cepa de Lactococcus, genéticamente modificada y calificada como GRAS. Para la Comisión Europea, los aditivos (colorantes y flavorizantes) deben ser rotulados si el producto final tuviera ADN o proteína de origen recombinante. Otro aspecto de bioseguridad adicional se refiere al empleo de enzimas. Estas cumplen un papel importante en varias industrias de alimentos donde más de 30 enzimas participan en la producción de panes, galletitas, lácteos, jugos de frutas, bebidas alcohólicas, derivados del almidón y de proteínas. La primera enzima sintetizada por un organismo transgénico fue la quimosina, que se utiliza para sustituir el cuajo de ternero o renina, en la producción de quesos. En la actualidad, aproximadamente el 80% de los quesos son elaborados con quimosina, y aceptados por los consumidores lactovegetarianos. Los microorganismos utilizados para la síntesis de enzimas food-grade son organismos bien conocidos, pertenecientes a la categoría GRAS. En la producción industrial de enzimas se utiliza un número pequeño de microorganismos, altamente productivos, a los que se les transfieren genes de interés. Estos organismos no están presentes en el producto final, que contiene exclusivamente la enzima. De este modo, la industria de alimentos cuenta con enzimas seguras y de bajo costo, entre las cuales encontramos proteasas, amilasas, lipasas, lactasas, pectinasas, glucosa-oxidasa, glucosa-isomerasa, etcétera. Con respecto al etiquetado de las enzimas, parecería haber un consenso amplio. La legislación europea considera que, siendo “auxiliares de transformación”, no hay necesidad de rotular los alimentos y bebidas preparadas con enzimas de origen recombinante, si estas no están presentes en el producto final. Un ejemplo serían los quesos de pasta firme, elaborados con quimosina. Solo se rotula un aditivo de origen transgénico, cuando el producto final contiene ADN o proteína de origen recombinante. 286 Capítulo XV. Biotecnología y alimentos La más alta autoridad internacional sobre los alimentos es el Codex Alimentarius, una comisión de FAO/WHO, reconocida por 169 países. Su función es establecer una metodología que permita analizar la seguridad alimentaria, en relación a los productos derivados de microorganismos genéticamente modificados. 287 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos 1. LA ENTRADA DE LOS TRANSGÉNICOS EN LA CADENA ALIMENTARIA Pocos son los alimentos transgénicos que se consumen directamente, como el maíz dulce (choclo) o la papaya. Se aguarda la llegada al mercado del arroz con provitamina A y del salmón de crecimiento rápido. Sin embargo, los alimentos industrializados pueden tener algunos componentes de origen transgénico (soja, maíz) o sustancias producidas por microorganismos genéticamente modificados (enzimas, aditivos, etcétera). La primera ola de productos transgénicos comercializados globalmente estuvo limitada, hasta 2010, a unas pocas plantas: soja, maíz, algodón, canola, arroz, papaya, calabaza, tomate y pimiento dulce. Los genes incorporados les confieren resistencia a insectos y a infecciones virales, o tolerancia a herbicidas. Al aumentar la productividad y reducir los costos, los cultivos transgénicos benefician directamente al productor. También benefician indirectamente al consumidor, porque la calidad de la materia prima mejora cuando se disminuye la contaminación de los cultivos por hongos. No obstante, eso no significa mucho para el consumidor que compra el alimento ya procesado. La falta de ventajas directas explicaría la resistencia a los transgénicos por parte de los consumidores. Mejorando la conservación Para despertar el interés del consumidor se necesitan productos con cualidades que lo beneficien directamente como, por ejemplo, una mejora en la conservación de los alimentos. Todos sabemos que los frutos se ablandan con el tiempo. En el caso de los tomates, estos se recolectan cuando todavía están verdes, y solo al llegar al lugar de comercialización se induce la maduración con etileno. Si se inhibe el ARN de la enzima responsable por el ablandamiento del fruto, el tomate puede permanecer durante más tiempo en la planta, ganando sabor y color antes de la cosecha. Este razonamiento dio origen al tomate FlavSavr de la 289 Biotecnología empresa Calgene, que fue el primer alimento producido por la nueva biotecnología. Liberado en los Estados Unidos (1994), el tomate acabó siendo discontinuado poco tiempo después, por problemas comerciales. Más tarde se obtuvo, mediante técnicas clásicas de mejoramiento, otro tomate de “larga vida” que se difundió rápidamente en el mercado mundial. La tecnología antisense continúa siendo una herramienta poderosa, que es utilizada en el mejoramiento de otros vegetales (brócoli, apio, zanahoria, melón y frambuesa). Mejorando las propiedades industriales El consumidor también se beneficia con el mejoramiento de las propiedades industriales de los alimentos como, por ejemplo, aceite de canola y de girasol con una composición más apropiada para las frituras, trigo con características especiales para la panificación, y papa con más almidón, capaz de absorber menos aceite durante la cocción. Un caso interesante es el del tomate con mayor contenido de pectina, desarrollado por Zeneca Plant Science, utilizado para la preparación de pasta o puré. El procesamiento demandaba menos espesantes y consumía menos energía, de modo que el producto resultaba más económico, tanto para la industria como para el consumidor. Vendido con mucha aceptación, entre 1996 y 1999, por la cadena de supermercados Sainsbury (Reino Unido), tuvo que ser retirado del mercado debido a la campaña contra los transgénicos. Mejorando las características nutricionales La biotecnología también puede beneficiar al consumidor ofreciéndole alimentos con propiedades organolépticas mejoradas como, por ejemplo, pimentones y melones con más aroma o cebollas que no hagan llorar. Otra forma de llegar al consumidor es con productos que tengan mejores características nutricionales: carne y leche con menor tenor graso, soja y papa con más proteína, frutas más dulces, canola con vitamina A, maíz con metionina, mandioca y batata sin toxinas, camarón y maní sin sustancias alergénicas, etc. El consumidor también podría ser atraído por alimentos funcionales con componentes biológicamente activos, como los antioxidantes del té verde o las sustancias del ajo y de la cebolla que bajan los niveles de colesterol. ¿Cuáles son las tecnologías con mayores posibilidades de ser aceptadas por el público, la ingeniería genética o el mejoramiento convencional, asistido por técnicas de biología molecular? 290 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos Un primer caso para analizar es el del arroz dorado (Golden rice). La planta de arroz no produce vitamina A. En Asia, donde constituye la base de la alimentación, la deficiencia de vitamina A mata a 6.000 niños por día y deja ciegos a 500.000 por año. Un grupo suizo, liderado por el investigador Ingo Potrykus, transfirió al cereal un gen del narciso y otro de una bacteria obteniendo un arroz que sintetiza ß-caroteno, un precursor de la vitamina A. El proyecto contó con subsidios privados, y varias de las grandes corporaciones cedieron sus patentes para que pudiera llevarse a cabo. El arroz dorado está listo desde 1999. Si se hubiera obtenido por métodos convencionales, estaría en el mercado desde 2003. Pero por ser de origen transgénico, debe someterse a rigurosas pruebas y a reglamentaciones que ha impedido su distribución hasta ahora. Un segundo caso es el de la soja Vistive (Monsanto), que reúne una característica transferida por técnicas convencionales (bajo tenor de ácido linolénico) y otra de origen transgénico (tolerancia al herbicida RoundupReady). Lanzado al mercado en 2005, el aceite de soja Vistive disminuye el nivel de colesterol, representando un paso al frente en la prevención de enfermedades cardiovasculares. Empresas como Kellogg y Cargill lo utilizaron de inmediato en la preparación de alimentos de mejor calidad nutricional, un nicho que parece promisorio. Otras variedades con alteraciones en el tenor de ácidos grasos están a camino (Soymega con más Omega 3). 2. LA POLÉMICA GENERADA ¿A favor o en contra de los alimentos transgénicos? Responder a esta pregunta es simplificar una cuestión compleja porque, cualquiera que sea la respuesta, estará ligada a posiciones políticas, económicas, religiosas o sociales. Nuestra opinión dependerá en gran parte de la visión que tengamos de la naturaleza. Según la consideremos “fundamentalmente buena” o “fundamentalmente mala”, toda modificación que venga de la mano del hombre será considerada “peligrosa” o “ventajosa”. En función de la confianza que manifestemos en el conocimiento científico y en el progreso tecnológico, los nuevos alimentos resultarán interesantes y promisorios o una terrible amenaza. A pesar de la subjetividad de la cuestión, algunos datos pueden ayudarnos a entender el origen de la polémica relativa a los alimentos transgénicos. En 1996, culminó en Europa la crisis de la vaca loca. En 1997, fue lanzado el maíz resistente a insectos de Novartis, cuyo marcador era un gen de resis291 Biotecnología tencia a la ampicilina. En 1999 estalló en Bélgica el escándalo de los pollos contaminados con dioxinas. A fines del siglo XX, la percepción pública europea era de gran inseguridad alimentaria, una situación que posibilitó la formación de una oposición feroz hacia los alimentos transgénicos. De un lado se situaron las empresas de biotecnología que integran los conglomerados multinacionales, con intereses económicos muy bien definidos. Del otro se posicionaron las cadenas de distribución de alimentos (Carrefour, Mark & Spencer), asociadas a los ambientalistas (Greenpeace, Amigos de la Tierra) y a ciertos grupos de agricultores europeos (Confédération Paysanne). Con una exitosa campaña de marketing (“no queremos Frankenfood”), estas cadenas aprovecharon la oportunidad para lanzar sus propias marcas y vender sus productos. Sin que fueran utilizados argumentos científicos, la discusión se banalizó rápidamente, agudizando el enfrentamiento entre partidarios y opositores a los alimentos transgénicos. Los términos “progresista” y “reaccionario” fueron usados indiscriminadamente por ambos grupos. No hay duda de que el desacuerdo y la discusión son prerrogativas de una sociedad democrática pero, infelizmente, en esa campaña se incendiaron laboratorios de investigación y se destruyeron campos de cultivos experimentales. El problema es especialmente complicado porque, si bien en los países ricos (Estados Unidos y los de la Unión Europea) no faltan alimentos y la elección de una tecnología puede depender de consideraciones económicas o ideológicas, en los países más pobres la adopción o rechazo de esa misma tecnología es una decisión que puede tener gravísimas consecuencias para sus habitantes, condenándolos al hambre. Los gobiernos de Zambia (2002) y Angola (2004) rechazaron el maíz enviado como ayuda humanitaria para alimentar a la población, argumentando que era transgénico. Otros países africanos, como Malawi, Mozambique y Zimbawe, también prohibieron la importación de alimentos de origen transgénico. 3. LO QUE EL CONSUMIDOR NECESITA SABER Alimentos seguros Con respecto a los alimentos que consumimos, la noción de seguridad se basa en la experiencia cotidiana y la historia de la humanidad. Cuando se la introdujo en Europa, la papa fue considerada un alimento peligroso. Y 292 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos la pasteurización de la leche tuvo opositores acérrimos, porque se estaba alterando la calidad de un alimento saludable. Por otro lado, el maní puede no ser seguro si está contaminado con hongos o si es consumido por una persona alérgica. Muchas personas continúan ingiriendo grandes cantidades de grasas, aunque sepan que son peligrosas para la salud. Todos los alimentos de origen transgénico comercializados en la actualidad fueron debidamente analizados y aprobados en sus países de origen. Millones de consumidores los ingieren desde hace varios años, entre estadounidenses, canadienses, sudafricanos, argentinos, chinos y europeos. Muchos comités científicos, premios Nobel, academias de Ciencias y organizaciones internacionales concluyeron que los alimentos genéticamente modificados disponibles son tan seguros como sus pares no transgénicos. Sin embargo, bombardeado por una intensa propaganda y opiniones contradictorias, el consumidor se siente incómodo y comienza a preocuparse con la seguridad alimentaria de los transgénicos: ¿serán peligrosos? ¿Serán equivalentes? ¿Causarán alergias? ¿Y si simplemente “pasa algo” y ocurre algún imprevisto? La ingestión de ADN La ingestión de ADN, per se, no es peligrosa. Es un componente de nuestros alimentos: un tomate tiene 7 mg de ADN, una banana 50 mg y un sándwich 60 mg. Es digerido normalmente junto con los otros componentes del alimento. Una construcción genética típica tiene aproximadamente 4.000 pares de bases. Se calcula que una vaca de 600 kg, que consume una ración con 60% de maíz genéticamente modificado, ingiere 608 mg de ADN por día. De estos, solo 2,6 µg o el 0,0004% del ADN total ingerido serían de origen transgénico, lo que representa una proporción ínfima. Los marcadores de resistencia a antibióticos No hay evidencias de transferencia in vivo del ADN ingerido por el hombre a los microorganismos del intestino. Sin embargo, los estudios in vitro indican que podría ocurrir, aunque en una frecuencia extremamente baja. Aunque sepamos que una bacteria resistente solo podrá fijarse en el tubo digestivo bajo presión selectiva del antibiótico, no deja de ser una preocupación el uso de marcadores de resistencia a antibióticos en la construcción genética del transgén (Figura 1). 293 Biotecnología FIGURA 1. Estructura de un transgén Para garantizar la selección y expresión del transgén, se hace una construcción compleja que incluye, además de un promotor y una secuencia de terminación, a un gen marcador de selección Gen marcador Promotor Secuencia codificante Terminador Generalmente, los marcadores utilizados son genes de resistencia a antibióticos que no tienen uso clínico, para los cuales las bacterias intestinales ya son resistentes, de manera que la transferencia del marcador no cambiaría la situación. Sin embargo, el maíz resistente a insectos de Novartis, aprobado en la Unión Europea en 1997, usaba un marcador de resistencia a la ampicilina. Considerando la existencia de una tecnología apropiada, las agencias internacionales recomendaron entonces el reemplazo o la eliminación de este tipo de marcadores. En función de estudios posteriores, las autoridades europeas de seguridad alimentaria concluyeron, en 2007, que los genes de resistencia a antibióticos utilizados no representan riesgos relevantes para la salud animal y humana o para el medioambiente. La composición centesimal Los alimentos derivados de los transgénicos que están siendo comercializados tienen la misma composición centesimal e igual valor nutritivo que sus pares convencionales. Un alimento que contenga un componente nuevo como, por ejemplo, una vitamina, está en situación diferente porque ya no será equivalente a los convencionales. Serán necesarios estudios adicionales. La producción de toxinas Hay microorganismos y plantas que fabrican naturalmente toxinas, como una forma de defensa contra otros organismos. La toxina del Bacillus thuringiensis es letal para algunos insectos, e inocua para el hombre y otros mamíferos e invertebrados. Las toxinas de la papa y la mandioca deben ser desactivadas por cocción, porque pueden afectar seriamente nuestra salud. 294 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos Normalmente, la presencia de alguna toxina en un alimento es investigada mediante pruebas y ensayos biológicos que incluyen la introducción de dicho alimento en la dieta de diversas especies animales, y se complementan con estudios de anatomía patológica. Este tipo de evaluación se realizó en todos los alimentos transgénicos comercializados hasta ahora, sin que se haya detectado la presencia de toxinas o efectos adversos. A pesar de la repercusión pública alcanzada oportunamente, las afirmaciones de Pusztai (1999) sobre problemas de crecimiento en ratones alimentados con ciertas papas transgénicas fueron invalidadas por la comunidad científica, debido a limitaciones técnicas del trabajo y al uso incorrecto de la estadística. La producción de alérgenos La incidencia de alergias alimentarias llega a 1-2% en adultos y a 5% en niños, siendo provocadas principalmente por trigo, leche de vaca, huevos, pescado, mariscos, maní, frutas secas y soja. Las alergias se caracterizan por la hipersensibilidad a una o más proteínas, que desencadenan reacciones diversas (urticaria, vómitos o diarrea). La transgénesis puede ser utilizada para eliminar sustancias sabidamente alergénicas, generando alimentos más saludables, pero lo que teme el consumidor es que en el alimento transgénico haya alguna proteína capaz de desencadenar una crisis alérgica. Una misma proteína puede ser inocua para una persona y alergénica para otra, y es imposible prever el efecto que tendrá en una tercera. Sin embargo, sabiendo que hay alimentos más alergénicos que otros, debe tenerse un particular cuidado con el origen del transgén. Un ejemplo clásico en este sentido fue la transferencia de un gen de la castaña de Pará a la soja, para mejorar sus cualidades nutritivas. Como se sabía que la castaña de Pará es alergénica para muchas personas, su introducción en la soja suponía un riesgo considerable y por ese motivo el proyecto fue discontinuado. Esa soja nunca salió del laboratorio. Aunque el transgén no derive de un alimento reconocido como alergénico, debe analizarse el potencial alergénico de la proteína sintetizada a partir de ese transgén. Se sabe que la probabilidad de que una proteína sea alergénica aumenta si contiene determinadas secuencias de aminoácidos, si se degrada muy lentamente en el tubo digestivo o si permanece estable aún luego del procesamiento industrial. Existen criterios consensuados internacionalmente para la evaluación de la alergenicidad. El análisis se comple295 Biotecnología menta con ensayos de laboratorio utilizando sueros de personas alérgicas y pruebas en modelos experimentales animales, capaces de desarrollar respuestas alergénicas similares a los humanos. El riesgo de alergenicidad de los alimentos transgénicos comercializados hasta ahora no es mayor que el de sus pares convencionales. Vale la pena destacar que estos alimentos pasaron por pruebas que nunca se hicieron para los alimentos no transgénicos como, por ejemplo, el arroz, el maíz, la papa o el kiwi –una fruta introducida hace poco tiempo y probadamente alergénica. Con respecto al escándalo causado por el maíz Star Link, autorizado en Estados Unidos para el consumo animal y que luego contaminara “tortillas” y “tacos” destinados al consumo humano, ninguna de las denuncias de alergia a la proteína correspondiente fue confirmada. Sin embargo, el episodio de la contaminación dejó una enseñanza de bioseguridad alimentaria: no se puede liberar un cultivo para alimentación animal si no es seguro para el consumo humano. La utilización de un promotor viral En la construcción del transgén se colocan secuencias promotoras para determinar cuándo y cómo se expresará la proteína codificada. Algunos investigadores manifestaron su preocupación con el uso del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), temiendo que este sea transferido horizontalmente, de una planta transgénica al sistema digestivo del hombre, activando algún oncogén. Se trata de una preocupación que no parece tener mayores fundamentos, puesto que el promotor CaMV es detectado en 14 a 25% de la producción de canola, coliflor y repollo. Esto significa que ha sido ingerido por el hombre en cantidades considerables, durante décadas, sin que se haya observado algún efecto. Otros efectos La inserción de varias copias génicas en lugares diferentes del genoma podría eventualmente activar o desactivar a otros genes, generando algún tipo de alteración no intencional. Hasta ahora no se registró ninguno de estos efectos en los productos transgénicos comercializados. Las nuevas tecnologías, como los microarrays, podrán ayudar en este tipo de evaluación. 296 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos 4. CÓMO GARANTIZAR LA SEGURIDAD ALIMENTARIA El principio de equivalencia sustancial Antes de la aprobación comercial de un alimento genéticamente modificado se deben evaluar los riegos potenciales que presenta para los seres humanos, los animales y el ambiente. Así como no hay una ciudad segura, hay ciudades más seguras que otras. De la misma manera, el concepto de seguridad se establece siempre en relación con algún marco de referencia. Por ejemplo, cuando se trata de seguridad alimentaria, la referencia es el alimento ya conocido y consumido habitualmente. Por eso, antes de llegar al mercado, los aditivos, los conservantes y los colorantes convencionales nuevos son sometidos a una evaluación de riesgo, así como cualquier ingrediente nuevo de origen biotecnológico. Un alimento originado por biotecnología moderna es tan seguro para el consumo como su par no transgénico, si tiene la misma composición y las mismas características nutritivas. Este es el denominado principio de equivalencia sustancial, admitido por numerosas organizaciones internacionales como la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación), WHO (Organización Mundial de la Salud), OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico) e ILSI (Institutos Internacionales de las Ciencias de la Vida). El principio le da toda la importancia al producto final y no a la tecnología aplicada para su obtención. La evaluación de riesgos No se puede decir que “todos los alimentos transgénicos son seguros”, ni que “este alimento transgénico es seguro”. Solo podemos afirmar que “los alimentos transgénicos pueden ser seguros o no”, pero más precisamente, que “determinado alimento transgénico es tan seguro como su par no transgénico”. Y el análisis debe hacerse caso por caso. Por ejemplo, el almidón que se extrae de una papa resistente a virus es idéntico al almidón de cualquier otra papa, ya que es un hidrato de carbono purificado, sin ADN ni proteínas de la planta de papa. Se puede razonar de la misma manera para el aceite de canola o de soja. Pero en el caso de la torta de soja o de la espiga de maíz, los genes insertados sintetizan proteínas y ambos se encuentran en el producto final, por eso hay que analizar si estos pueden tener algún efecto en el organismo que los ingiere. 297 Biotecnología También deberán evaluarse: la construcción del transgén, los efectos debidos a la presencia del transgén (eventualmente, sustancias tóxicas o alergénicas y otros efectos no intencionales) y la composición centesimal y el valor nutritivo. Como el transgén puede insertarse en el genoma de un mismo organismo en sitios diferentes, cada evento de transformación debe analizarse por separado. Esta metodología de evaluación, denominada en general “análisis de riesgo de alimentos genéticamente modificados para la salud humana y animal”, garantiza que el cultivo transgénico, y cualquiera de sus subproductos, sea tan seguro para el consumo como su par convencional. El etiquetado de los alimentos transgénicos No hay hasta el momento un consenso sobre el etiquetado: en algunos países no hay ninguna reglamentación, en otros se adopta el etiquetado voluntario o se crean normas rígidas. En Estados Unidos, el sistema se basa en la responsabilidad de la industria y en la evaluación de varias agencias federales. La FDA (Food and Drug Administration) se ocupa de la seguridad alimentaria de las nuevas variedades (vegetales, lácteos, peces, frutos de mar, aditivos). La USDA (US Department of Agriculture) regula los productos cárnicos y avícolas, así como los ensayos de campo de todas las plantas genéticamente modificadas; mientras que la EPA (Environmental Protection Agency), responsable de la aprobación de agroquímicos, evalúa a las plantas genéticamente resistentes a plagas. De las variedades transgénicas cultivadas en los Estados Unidos, unas 20 están autorizadas para el consumo humano. No se etiquetan los productos derivados de estas, a menos que el valor nutricional del alimento haya sido alterado, o se hubiera incorporado alguna sustancia tóxica o alergénica. La experiencia de una década de consumo de alimentos transgénicos confirma que son comparables a los alimentos convencionales. Aunque algunos grupos activistas manifestaron su oposición a los alimentos transgénicos, esto no ha afectado la estabilidad del sistema. En Argentina y en México el etiquetado no es obligatorio. En la Unión Europea rige el principio precautorio. Como lo que importa es el proceso seguido en la producción del alimento, la legislación de 2004 manda rotular todos los productos de origen transgénico destinados a la alimentación humana o animal. La reglamentación se aplica también a bares y restaurantes. También es obligatorio el rótulo en los alimentos que 298 Capítulo XVI. Biotecnología y nuevos alimentos contengan más del 0,9% de material genéticamente modificado, incluyendo raciones, aceites vegetales, semillas, etcétera. Por otro lado, la legislación europea considera que no hay necesidad de etiquetar los alimentos y bebidas preparados con sustancias producidas por OGM, que son solo auxiliares de transformación, a condición que estos o sus residuos no se encuentren presentes en el producto final. Tampoco son rotulados los productos provenientes de animales alimentados con raciones transgénicas (carnes, leche y huevos), ni la miel de abejas alimentadas con néctar de flores de plantas transgénicas. El objetivo de esas medidas es garantizar al consumidor la trazabilidad de los transgenes a lo largo de la cadena alimentaria. La etiqueta debe decir: “este alimento contiene OGM” o “producido a partir de (nombre del organismo) genéticamente modificado”. En Brasil, el Decreto 4.680 (24/4/2003) determina que a partir de abril de 2004 todos los productos con más del 1% de ingredientes transgénicos deben ser etiquetados con un símbolo específico de tamaño mayor a 1 cm2 (un triángulo amarillo con una T en el medio). Etiquetado e información Cuando se trata de elegir entre un alimento y otro, basta recurrir a nuestra percepción sensorial o a nuestra experiencia personal. Ni una ni otra ayudan a identificar si un alimento contiene ingredientes transgénicos o no. Debido a la resistencia de algunos grupos de consumidores, el etiquetado parece a primera vista la salida más lógica para informar de manera honesta, exacta y completa sobre los productos de las góndolas. Vimos en el capítulo XIII que los productores de semillas admiten como aceptable una contaminación del 1% entre las variedades convencionales. Ese valor es igualmente válido en relación a las plantaciones transgénicas y convencionales. El límite del 1% redefine el nivel de pureza de un ingrediente de origen vegetal, considerándose que todo valor inferior puede ser el resultado de una contaminación accidental. El rótulo no garantiza la ausencia de transgénicos. El consumidor puede comprar un producto con más del 1% de ingredientes transgénicos, o un producto convencional en cuya composición más del 99% de sus ingredientes no es transgénico. Sin embargo, el costo del etiquetado, que depende de la tecnología necesaria para la detección, deberá sumarse a lo largo de la cadena de producción del alimento, hasta el precio final que deberá pagar el consumidor, preocu299 Biotecnología pado o no con los transgénicos. En un mundo globalizado, la variedad de reglamentaciones y modalidades de etiquetado evidentemente complicará las transacciones comerciales. Finalmente, cabe reflexionar sobre cuál es el verdadero significado de la etiqueta para la mayoría de los consumidores. ¿Hasta que punto la elección entre dos productos depende del precio y del marketing de las partes interesadas? Probablemente, la única forma de interpretar la información sea a través del proceso educativo, dando a la población los elementos básicos para formar una opinión con conocimiento y responsabilidad. El rastreo de un transgén En las transacciones comerciales, la calidad de un producto puede definirse en función de la presencia o ausencia de un transgén. Como la aceptación de los transgénicos varía de un país a otro y entre los grupos de consumidores, es importante contar con métodos que rastreen o detecten el transgén. Una forma de rastrear la presencia de un transgén en una muestra de alimento es mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los ensayos cualitativos reconocen directamente la presencia o ausencia del transgén, mientras que los ensayos semicuantitativos lo hacen en relación a un límite, que es generalmente del 1%. Los ensayos cuantitativos brindan información sobre la cantidad del transgén, por comparación con muestras de referencia de concentraciones conocidas. La técnica permite identificar 0,1% de ADN foráneo (1 gramo en 1 kilogramo), aunque hay variantes extremadamente sensibles que reconocen la presencia de un 0,001% del transgén. Para aplicar estos ensayos hay que conocer secuencias características del transgén. Una forma de simplificar el rastreo sería la inclusión de una secuencia conocida en todas las construcciones genéticas que funcionaría como una “etiqueta molecular”. No siempre la PCR es informativa. En muestras de granos o alimentos procesados, el ADN puede estar degradado. En este caso es necesario saber cuáles son las transformaciones que sufrió el producto para aplicar el método adecuado. También hay métodos inmunológicos (Western Blot, ELISA) que permiten detectar la proteína sintetizada por el transgén y eventualmente estimar la cantidad presente. El costo de todas estas pruebas es alto y será pagado por el consumidor. 300 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas 1. LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS El cultivo de plantas y la domesticación de animales aumentaron la disponibilidad de alimentos y la densidad de las poblaciones humanas. Como consecuencia de la sedentarización, muchos gérmenes pasaron de los animales domesticados al hombre, originando enfermedades como la viruela, el sarampión y la gripe. En el siglo XIX, las enfermedades mataban al 80% de los niños, antes de los 10 años de edad. Hoy, en la mayoría de los países, programas de vacunación sistemática los inmunizan contra la tuberculosis, la hepatitis B, la poliomielitis, la difteria, el tétano, la tos convulsa (coqueluche), la meningitis, el sarampión, la rubéola y las paperas. Una vacuna es un producto destinado a estimular el sistema inmunitario, para prevenir o controlar una infección. La vacunación está dirigida a los niños y grupos de mayor riesgo, como mujeres (sarampión, rubéola), mayores de 60 años (gripe, neumonía) o determinados grupos de profesionales, como el personal de salud (hepatitis B, ántrax). También sirve para proteger a los habitantes de ciertas áreas o a los viajantes (fiebre amarilla). Por otro lado, la vacunación de los animales es doblemente eficiente porque, además de protegerlos de la enfermedad, puede impedir su transmisión al hombre. Podemos decir que en los doscientos años que nos separan de Jenner, el descubridor de la primera vacuna antivariólica, hemos logrado el éxito en la prevención de un buen número de enfermedades infecciosas. Las mejoras en las condiciones económicas de una población repercuten en la salud de la misma. Inversamente, al disminuir la incidencia de enfermedades con sus secuelas de invalidez o muerte prematura, las personas tienen más posibilidades de mejorar sus condiciones de vida. El costo de la implementación de un sistema de vacunación es bajo en relación al beneficio logrado, puesto que la protección alcanza no solo a la persona vacunada, sino también a quienes tienen contacto con ella. La WHO (del inglés World Health Organization, Organización Mundial de la Salud) considera que el mayor impacto en el área de salud se 301 Biotecnología consigue con agua limpia y vacunas, una variante del viejo proverbio según el cual “prevenir es mejor que curar”. Lamentablemente, aún mueren dos millones de niños por año de enfermedades para las cuales tenemos vacunas, porque no les llegan, debido principalmente a conflictos armados y dificultades de acceso a los centros de salud. Hay también muchas enfermedades para las cuales aún no tenemos vacunas, como el dengue, la malaria y el sida. 2. LA ADQUISICIÓN DE INMUNIDAD Las respuestas primaria y secundaria Los microorganismos infecciosos, sus moléculas y sustancias químicas son antígenos, es decir, son reconocidos por nuestro sistema inmune como extraños. También se comportan como antígenos las células trasplantadas de un organismo a otro. En algunas personas sensibilizadas, hay materiales como el polen, la caspa de animales y algunos alimentos que se vuelven antígenos, desencadenando reacciones alérgicas. Durante el primer contacto del organismo con un patógeno pueden aparecer algunos síntomas de poca intensidad y corta duración, como fiebre, dolor de cabeza, erupción cutánea, etc. La respuesta primaria es acompañada por la adquisición de una memoria inmunológica que permitirá, en un segundo contacto con el mismo patógeno, eliminarlo rápidamente (Figura 1). La respuesta secundaria, que envuelve diversos tipos de células y moléculas, se caracteriza por ser rápida, intensa y duradera. Los mecanismos de defensa El sistema inmune detecta a cualquier patógeno o antígeno extraño que penetre en el organismo. La respuesta incluye una acción humoral y una acción celular, coordinadas por diversos componentes del sistema inmunitario. La respuesta depende del tipo de ataque del patógeno. Los anticuerpos producidos por los linfocitos B pueden reconocer e iniciar la destrucción de las bacterias y toxinas circulantes. Los virus y algunas bacterias consiguen escapar del reconocimiento de los anticuerpos porque invaden las células. Sin embargo, al colocar en la superficie celular sus propias proteínas y las del organismo invasor, la célula infectada es reconocida y destruida por los linfocitos T citotóxicos (Tc, del inglés T citotoxic). 302 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas FIGURA 1. La respuesta primaria y secundaria del organismo El organismo reacciona al primer contacto con un antígeno extraño con una respuesta inmune de baja intensidad y corta duración (respuesta primaria). El segundo contacto con el mismo antígeno induce una respuesta más rápida, más intensa, más duradera y que involucra a numerosas células y moléculas (respuesta secundaria) n I tensidad de la respuesta inmune 1 r P imer contacto con el patógeno antígeno) ( 2 3 4 5 6 7 8 Semanas Segundo contacto con el patógeno antígeno) ( FIGURA 2. La memoria inmunológica Antígeno Células presentadoras de antígeno Linfocitos T citotóxicos Linfocitos T auxiliadores Linfocitos B Síntesis de anticuerpos Células de memoria Eliminan las células infectadas Neutralizan o marcan al antígeno desencadenando su eliminación La acción humoral y la acción mediada por células dependen de la participación de los linfocitos auxiliadores Ta, también llamados Th (del inglés T helpers), que pueden reconocer al antígeno y producir moléculas que estimulen la proliferación de las células B y T (Figura 2). 303 Biotecnología Una vez finalizada la respuesta primaria, algunas células de memoria (B, T) permanecen en el sistema, desencadenando rápidamente los mecanismos de defensa en el segundo encuentro con el antígeno. La memoria inmunológica es la clave de la respuesta secundaria. 3. LOS DIFERENTES TIPOS DE VACUNAS El objetivo de una vacuna es estimular el sistema inmunitario para prevenir o controlar una infección. En la vacunación, el primer contacto se establece con un patógeno (o parte del mismo) que, a pesar de conservar su identidad molecular, no puede causar la enfermedad. La memoria inmunológica es la clave de la vacunación, porque activa los mecanismos de defensa previendo un segundo contacto, esta vez con el patógeno original. Según las características del mismo, una vacuna deberá estimular la inmunidad mediada por células, la producción de anticuerpos o ambas al mismo tiempo. Primera generación Estas vacunas incluyen patógenos vivos atenuados, patógenos muertos o antígenos acelulares (Figura 3). Vacunas de patógenos vivos atenuados Los microorganismos se atenúan por pasajes sucesivos en diversos medios de cultivo y por tratamientos físicos en diferentes condiciones de temperatura, presión y pH. El procedimiento permite seleccionar mutantes que conserven la capacidad de inducir una respuesta inmune, pese a haber perdido la patogenicidad. Las vacunas de microorganismos vivos atenuados inducen una respuesta inmune intensa y duradera que incluye a ambas vías, la humoral y la celular. Una única dosis es suficiente, salvo en caso de inmunización por vía oral. A pesar de ser más eficientes, estas vacunas generan más efectos colaterales que las otras, y no pueden aplicarse en las personas inmunodeprimidas, ya que los microorganismos podrían revertir recuperando su patogenicidad. Otra desventaja es la necesidad de mantener una cadena de frío, para conservarlas refrigeradas. 304 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas FIGURA 3. Tipos de vacunas La inmunidad puede ser adquirida artificialmente reemplazando al patógeno por una versión inactivada o atenuada, o por una fracción del mismo (subunidades de antígenos, ADN) Tipos de vacunas Virus patogénico Virus relacionado Virus atenuado Virus muerto Subunidades Recombinante Linfocitos ByT Enfermedad y recuperación Inmunidad adquirida (natural) Inmunidad adquirida (artificial) Estas vacunas se utilizan para la prevención de enfermedades de origen viral, como la fiebre amarilla, el sarampión, la rubéola, las paperas y la poliomielitis (Sabin u OPV, del inglés oral poliomyelitis vaccine). La vacuna contra la tuberculosis es la única preparada con una bacteria viva atenuada, el bacilo de Calmette-Guérin o BCG. Vacunas de patógenos muertos y toxoides Confieren una respuesta inmune de tipo humoral poco intensa y poco duradera, por eso se deben administrar varias dosis y, más tarde, mantener la inmunidad con dosis de refuerzo. Existen vacunas de microorganismos muertos contra el cólera, la gripe, la hepatitis A, la peste, la poliomielitis (vacuna Salk) y la rabia; y vacunas de toxoides contra la difteria y el tétano. 305 Biotecnología Vacunas de subunidades de antígenos En estas vacunas se usan, en vez del microorganismo entero, fracciones o componentes de la superficie celular capaces de inducir la respuesta inmune (Figura 3). Demandan un largo trabajo de investigación previa para determinar cuáles son los mejores antígenos (subunidades) que deberán incluirse en la vacuna. Como solo llevan fragmentos del microorganismo, estas vacunas no presentan los riesgos de las vacunas de microorganismos vivos y, por el mismo motivo, no dependen de la cadena de frío. Al igual que las vacunas inactivadas, solo inducen la respuesta inmune humoral. Existen vacunas de subunidades contra la influenza o gripe, la enfermedad de Lyme, la hepatitis B, la tos convulsa (coqueluche) y la neumonía. Segunda generación La llegada de la ingeniería genética revolucionó el campo de las vacunas porque trajo formas más seguras de inactivar un microorganismo. Muchas vacunas han sido sustituidas por otras en que la reversión a una forma activa es impedida por las modificaciones realizadas en el genoma del patógeno como, por ejemplo, la deleción de genes relacionados con los procesos metabólicos básicos. Las vacunas recombinantes La tecnología del ADN recombinante dio un gran impulso a la producción de vacunas de subunidades, al posibilitar la fabricación del antígeno deseado en un microorganismo transformado, que pueda ser cultivado sin riesgos en un fermentador (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Picchia pastoris). Esta metodología, que se limita a la producción de antígenos de tipo proteico, logró su primer éxito con la vacuna contra la hepatitis B (Figura 4). Varias vacunas recombinantes contra el sida y la malaria se encuentran ya en sus correspondientes fases experimentales. Las vacunas conjugadas Algunos microorganismos (neumococos, meningococos) se protegen con una cápsula de polisacáridos que dificulta su identificación por el sistema inmune aún inmaduro de un niño. Pero se puede estimular la respuesta 306 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas FIGURA 4. Elaboración de la vacuna recombinante contra la hepatitis B (tecnología del ADN recombinante) Las personas con hepatitis B presentan en la sangre una partícula viral inocua, la proteína HBsAg. Cuando se la inocula en personas sanas, induce una respuesta inmune contra el virus. Se pueden producir grandes cantidades de la proteína HBsAg introduciendo el gen correspondiente en una levadura Virus HBV Gen codificador del antígeno de superficie HBsAg Antígeno Vacuna Levadura Síntesis del antígeno inmune y el reconocimiento de los antígenos capsulares, conjugando un toxoide a las subunidades del polisacárido. Estas vacunas conjugadas se utilizan en la inmunización contra la bacteria Haemophilus influenzae B (meningitis) y el neumococo. Las vacunas contra este último son modificadas frecuentemente, adicionando otros antígenos capsulares de las más de 80 cepas que causan neumonía en seres humanos. Las vacunas vectorizadas Hay un tipo de vacuna basado en vectores recombinantes (bacterias o virus inocuos) en los que primero se inserta el gen que codifica para el antígeno. El vector recombinante infecta al hospedador, donde se multiplica, y al mismo tiempo produce el antígeno que induce una respuesta inmune contra el patógeno. Con una vacuna de este tipo se inmunizan los zorros, actualmente uno de los principales eslabones en la transmisión de la rabia en Europa. Otra modalidad de vacuna vectorial es aquella en que el vector no se multiplica en el hospedador, sino que actúa como una “jeringa molecular” para introducir en la célula el gen codificador del antígeno, que es sintetizado por las propias células del hospedador. Un vector de este tipo, por ejemplo, 307 Biotecnología es el canarypox, que se multiplica en aves exclusivamente. Las vacunas de este tipo se encuentran en fase experimental, y no hay ninguna aprobada para uso humano. Tercera generación La tecnología más promisoria parece ser la de las vacunas genéticas o vacunas de ADN desnudo (Figura 3). Consisten en un vector (plásmido) de expresión, con una construcción génica que incluye el gen codificador del antígeno. Este plásmido recombinante es inyectado directamente en el músculo, donde penetra en las células dendríticas presentadoras de antígeno (APC, del inglés antigen presenting cell). Estas migran a los órganos linfoides, donde sintetizarán el antígeno y estimularán la respuesta inmune celular que inmunizará al organismo hospedero. Quedan algunos problemas por resolver. ¿Cómo proteger el ADN para que no sea degradado cuando es fagocitado por la célula presentadora del antígeno? ¿Cómo aplicar la vacuna, por biolística o por electroporación? ¿Cómo limitar la expresión del gen transfectado a las células presentadoras de antígeno de los tejidos? Todavía resta una cierta preocupación sobre la posibilidad de que el ADN se integre al genoma de la célula transfectada, activando oncogenes o desactivando genes supresores de tumores. Una de las principales ventajas de estas vacunas es la inducción de una respuesta celular, necesaria para el combate a las infecciones virales. Además, son fáciles de preparar y modificar y no requieren de cuidados especiales durante el almacenamiento y el transporte. A mediano plazo, puede ser este el camino para desarrollar y producir nuevas vacunas. Estas se podrán elaborar reemplazando un gen por otro en el casete de expresión génica del plásmido, lo que diminuiría los costos y el tiempo necesario para responder a una emergencia sanitaria. También se podría conseguir una “supervacuna” con varios genes correspondientes a diferentes antígenos, para inmunizar al organismo contra varias enfermedades o cepas simultáneamente. En el área veterinaria, ya fueron aprobadas, en los Estados Unidos, dos vacunas de ADN desnudo: una contra el virus IHNV, causante de la necrosis hematopoiética en truchas y salmones, y la otra contra el virus del oeste del Nilo, que ataca equinos. En el área humana, todavía en fase experimental o ensayos clínicos, están siendo desarrolladas vacunas contra el sida, la malaria, el herpes, la tuberculosis, la hepatitis B, la influenza, los rotavirus, etcétera. 308 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas 4. LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS Investigación y desarrollo Por muy ingeniosa que sea la creación de una vacuna, habrá que cumplir varias etapas antes de poder comercializarla. La primera es la etapa preclínica, que se inicia en el laboratorio, con experimentos que utilizan cultivos de células o de tejidos. Los estudios permiten encontrar un “candidato” a vacuna. Ensayos en animales de laboratorio (ratones, cobayos o monos) permiten comprobar la capacidad de este candidato de inducir una respuesta inmune (inmunogenicidad). Si resultan exitosos, el candidato podrá pasar a la etapa clínica y ser probado en seres humanos. Los estudios clínicos se inician en un grupo de 10 a 100 personas voluntarias, monitoreadas de cerca para verificar la ausencia de toxicidad del candidato a vacuna y su inmunogenicidad. En la segunda fase, que incluye entre 100 y 3.000 personas, las pruebas se focalizan en determinar el número de dosis necesarias y, según la enfermedad, verificar la capacidad protectora de la vacuna. La tercera etapa es una prueba de campo e incluye de 3.000 a 40.000 personas. En ella se busca comprobar la eficacia real de la vacuna en prevenir la enfermedad e identificar los efectos adversos. Las investigaciones con seres humanos y, por consiguiente, todos los ensayos clínicos, deben desarrollarse dentro del marco ético elaborado por el Tribunal de Nuremberg. Este marco fue establecido después del juicio a 20 médicos condenados como criminales de guerra, por los brutales experimentos realizados con prisioneros durante la Segunda Guerra Mundial. Según el Código de Nuremberg (1946), los experimentos en seres humanos deben perseguir el bien de la sociedad y ser realizados por personas científicamente calificadas. Los participantes recibirán todas las explicaciones necesarias antes de dar libremente su consentimiento informado, y los experimentos serán la continuación de otros que, realizados en modelos animales, permitan prever un resultado tal que justifique la inclusión de ensayos en seres humanos. Se deberá evitar el sufrimiento físico o mental. Si hubiera algún efecto adverso, las personas participantes tendrán protección. En los ensayos clínicos de una nueva vacuna los voluntarios son personas informadas acerca de los riesgos y beneficios de su participación. Un grupo recibirá la vacuna, otro un placebo, y ambos serán evaluados clínicamente. Sin embargo, restan algunas dudas sobre la validez del consentimiento informado cuando los ensayos se realizan con niños, o con personas de escasos recursos y bajo nivel de instrucción. 309 Biotecnología La duración total de los estudios clínicos es de 6 a 8 años para las vacunas humanas. Cuando los resultados no son satisfactorios hay que hacer estudios adicionales y, eventualmente, interrumpir los estudios clínicos y elegir otro candidato a vacuna. Pero cuando se comprueba la seguridad y eficacia de una vacuna, la compañía farmacéutica podrá solicitar a los organismos competentes la autorización para comercializar el producto, un trámite cuya duración es de 12 a 18 meses. La liberación de la vacuna marca el inicio de la cuarta fase de los estudios clínicos, en la que se procede a un amplio monitoreo, para colectar más información sobre los efectos adversos y corroborar su verdadera eficacia. En 1999, por ejemplo, una vacuna contra el rotavirus tuvo que ser retirada del mercado en razón de algunos casos de intususcepción intestinal, relacionados con su aplicación e identificados en la cuarta etapa de los estudios clínicos. Cabe mencionar que, de un modo general, la mayor parte de las vacunas actuales protege entre el 80 y el 95% de los vacunados. Actualmente se están realizados ensayos clínicos en seres humanos con muchas vacunas contra diversas enfermedades: sida, malaria, hepatitis B, influenza, herpes, etcétera. Las vacunas veterinarias pasan por las mismas etapas, pero con exigencias menores. Es posible simplificar los ensayos con animales de laboratorio y, también, testear el candidato a vacuna en el animal al que se destina el producto. Aspectos tecnológicos La producción de vacunas es una tarea delicada en la que se deben extremar los cuidados. Cada lote de vacuna debe pasar por controles estrictos para garantizar la calidad y mantener la credibilidad no solo de la industria, sino también de la misma vacunación. Actualmente, varios países usan la vacuna Salk en la lucha contra la poliomielitis porque, al ser preparada con virus inactivados, es considerada una de las vacunas más seguras. Sin embargo, en 1954, dos semanas después de su liberación, esta vacuna provocó 260 casos de polio, incluyendo 10 muertes. El accidente se debió a un problema de fabricación en el Laboratorio Cutter, que resultó en la inactivación incompleta de algunas partículas virales. Una vacuna debe reunir varias cualidades: eficacia, pureza, seguridad y bajo costo. El proceso industrial varía según el microorganismo utilizado para la producción de la vacuna, y responde a criterios estrictos de calidad (BPL o buenas prácticas de laboratorio; BPF o buenas prácticas de fabricación). 310 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas Las bacterias se multiplican en biorreactores, cuyo volumen dependerá de la productividad del propio proceso fermentativo y de las concentraciones obtenidas (bacterias, antígenos o toxinas), así como del tratamiento posterior para la obtención de antígenos o toxoides. Los virus requieren células para multiplicarse porque son parásitos obligados. Tradicionalmente se cultivan en cuero de ternero y huevos de gallina, pero en un futuro muy próximo crecerán en cultivos de células. El progreso tecnológico facilitará el desarrollo de vacunas virales para uso humano (poliomielitis, sarampión, rubéola, influenza, paperas, rabia) y veterinario (fiebre aftosa, rabia, encefalitis equina, enfermedad de Mareck y de Newcastle, etcétera). Las vacunas antibacterianas pueden ser preparadas en gran cantidad, con un equipamiento relativamente simple, mientras que las virales necesitan un instrumental sofisticado y, en muchos casos, de un laboratorio y biorreactores para el cultivo de tejidos. Las proteínas recombinantes producidas en biorreactores pasan por un proceso de extracción seguido por varias operaciones de purificación (ultrafiltración, cromatografía en columna, etcétera). En la formulación de una vacuna se incluyen otras sustancias además del antígeno. Los adyuvantes estimulan la respuesta inmune, permitiendo la aplicación de dosis menores. Los estabilizantes impiden las alteraciones debidas al calor, a la luz o a la humedad. Los preservantes conservan el material en los frascos con dosis múltiples. Una de las tendencias actuales en la administración de vacunas es la reducción del número de dosis, mediante la inmunización simultánea para varias enfermedades en una misma inyección (vacunas dobles, triples, quíntuples). También se prefieren sistemas que disminuyan la necesidad de refrigeración, que representa el 15% de los costos de los programas de vacunación. Vendrán más novedades, con formas alternativas de aplicación para sustituir el uso de jeringas: pistolas, geles, adhesivos cutáneos, cápsulas, tabletas, inhaladores y sprays nasales (como la vacuna FluMist contra la gripe, comercializada recientemente). Las plantas y animales transgénicos productores de antígenos podrán revolucionar algunos aspectos de la fabricación de vacunas. La idea de las vacunas comestibles es muy seductora, porque nos imaginamos vacunando a los niños con una banana en vez de una inyección. Sin embargo, hay algunos problemas de seguridad, como el riesgo de mezclar bananas-vacuna y bananas-alimento, contaminando los alimentos o dificultando la identi311 Biotecnología ficación del medicamento. También habrá que garantizar el confinamiento de las plantas y animales genéticamente modificados para estos fines. Probablemente, se extraerán los antígenos y se los administrará en forma de tabletas o cápsulas. Aspectos económicos A lo largo de las últimas décadas, las empresas farmacéuticas consideraron que la producción de vacunas era una actividad poco rentable y se volcaron a otros sectores. Actualmente, cinco grandes empresas (SanofiPasteur, Merck, GlaxoSmithKline, Wyeth y Novartis) concentran de 80 a 90% del mercado global de vacunas humanas, que se estima llegará, en 2015, a 25.000 millones de dólares. El resto está fragmentado entre 200 a 250 empresas que desarrollan más de 600 productos. El desarrollo de una nueva vacuna lleva de 14 a 25 años, a un costo que puede variar entre 300 millones y mil millones de dólares. Para las empresas es significativo que algunos productos, como la vacuna antimeningocóccica Prevnar, alcancen un nivel de ventas cercano a los mil millones de dólares. Se estima que el mercado se duplicará en los próximos años, debido al crecimiento del sector adulto pero en detrimento del segmento de vacunas infantiles. Entre los productos nuevos más rentables, tendremos vacunas para influenza, para turistas o que disminuyan el abuso de drogas (nicotina). En el medio de sus numerosas crisis económicas, varios países latinoamericanos, como Argentina y Chile, descuidaron sus estructuras científicas y tecnológicas y pasaron a importar las vacunas necesarias para la población. Sin embargo, y por diferentes motivos, después de varias décadas de retracción en el área de producción de vacunas, esta comienza otra vez a ser considerada estratégica. Para los países en desarrollo, el estímulo a la producción nacional de vacunas es fundamental para cumplir con sus obligaciones frente a la población y, en términos de salud pública, para mantener su independencia en esta área. La amenaza de una pandemia como la de la gripe aviaria muestra que este sector no puede ser abandonado, observándose ya sólidos indicios de recomposición de las estructuras productivas. Algunos países, como Brasil, China e India, cuentan con instituciones de investigación y desarrollo de inmunobiológicos, y son frecuentes las asociaciones con las grandes empresas farmacéuticas. También hay fundaciones privadas, como la Bill & Melinda Gates Foundation, que otorgan fondos para la generación de nuevas y mejores vacunas que protejan a los niños 312 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas de enfermedades. Para las organizaciones internacionales como la WHO (World Health Organization), la vacunación es la medida preventiva más simple y eficaz en el área de salud. En los próximos años, habrá progresos en la preparación de vacunas preventivas y en el desarrollo de productos nuevos, como las vacunas terapéuticas para algunos tipos de cáncer o la enfermedad de Alzheimer. Pero fundamentalmente, se espera que en los próximos años tengamos vacunas nuevas o mejores contra enfermedades que afectan a un número altísimo de personas, como el sida, la malaria, el dengue, la tuberculosis, etcétera. Un sector estratégico para la sociedad En Brasil, donde hay una tradición de un siglo en la producción de inmunobiológicos (vacunas, sueros, hemoderivados y reactivos de diagnóstico), las ventas llegan a US$ 600 millones por año, lo que representa el 3% del mercado de la industria farmacéutica. Hasta la década de 1960, se fabricaban en ese país vacunas contra la tuberculosis, la viruela, la rabia, el sarampión, la triple bacteriana (difteria, tétanos, tos convulsa) y la fiebre amarilla, además de productos para el área animal. Esa autosuficiencia se perdió a comienzos de la década de 1980. Al retirarse del mercado una importante multinacional, se originó una crisis en la que la población corrió el riesgo de quedarse sin vacuna triple ni sueros antitóxicos y antiofídicos. En esa ocasión, quedó muy claro que la producción de vacunas es un sector estratégico, al cual la sociedad debe tener garantizado el acceso. El Programa de Autosuficiencia Nacional de Inmunobiológicos (PASNI), de 1985, revirtió esa situación, estimulando la modernización de las instalaciones y la incorporación de nuevas tecnologías. Actualmente, el Instituto Butantan (San Pablo) y BioManguinhos (Río de Janeiro) fabrican 11 tipos de vacunas y responden por el 70% de las vacunas distribuidas por el servicio público (Tabla 1). Varias vacunas están siendo desarrolladas en las instituciones ya citadas y en sistemas de sociedad con laboratorios extranjeros (Sanofi-Pasteur, GlaxoSmithKline, Instituto Finlay, etc.). Algunos de esos convenios permitieron la producción de vacunas como la triple viral (sarampión, paperas, rubéola), influenza, rotavirus, rabia, etcétera. Los diferentes acuerdos de cooperación internacional entre los países latinoamericanos también tendrán una importancia fundamental para el desarrollo de políticas de salud pública que le garanticen a la población el acceso a las vacunas. 313 Biotecnología TABLA 1. Producción de vacunas para uso humano (Brasil) Institución Instituto Butantan Vacunas DT, infantil (difteria y tétano) DT, adulto (difteria y tétano) DTP (difteria, tétano y tos convulsa, también llamada coqueluche o pertussis) Hepatitis B recombinante Influenza Poliomielitis Triple viral (sarampión, paperas y rubéola) Meningitis meningocócicas (A/C, por Haemophilus influenzae, HIB e HIB/DTP) Fiebre amarilla Rabia animal y humana (PV-BHK) Tuberculosis (BCG) Laboratorio BioManguinhos Tecpar (Instituto de Tecnología de Paraná) Fundación Ataulfo de Paiva 5. EL ROL DE LAS VACUNAS EN LA ERRADICACIÓN DE ENFERMEDADES El caso de la viruela La viruela es una enfermedad eruptiva contagiosa transmitida por un virus. El período de incubación dura entre 7 y 17 días, y los síntomas principales son: fiebre alta, fatiga y una erupción generalizada de vesículas por todo el cuerpo. La mortalidad de la enfermedad es del 30%, y quienes sobreviven conservan las lesiones y marcas características. En la Antigüedad, el faraón Ramsés V de Egipto habría muerto de viruela. Diseminada por los mercaderes hasta la India, la enfermedad luego se propagó a China (siglo I) y Japón (siglo VI), y volvió a Europa con los cruzados en los siglos XI-XII. La primera estrategia para combatir la viruela partió de una simple observación: quien la padece una vez y se recupera, no la volverá a padecer. Por eso, en el Lejano Oriente (India y China, siglo XI), las personas eran inoculadas con el pus de las vesículas de los enfermos que presentaban una forma benigna de la enfermedad. Aunque desarrollaran la enfermedad, esta era benigna y que314 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas daban protegidas por el resto de sus vidas. Claro que no siempre se lograban los resultados esperados: 0,5 a 2% de las personas inoculadas morían al desarrollar la enfermedad en su forma más grave. A pesar de estos accidentes, la viruela disminuyó en los pueblos que practicaban la “variolización”. En 1520, con la llegada a México de un esclavo infectado, la viruela entró en América. El contacto con este nuevo patógeno tuvo consecuencias nefastas para las poblaciones indígenas: en menos de doscientos años la viruela exterminó al 95% de la población. Durante los dos siglos siguientes la viruela dejó su rastro trágico en todas partes, cobrando vidas de pobres y ricos –como la del rey de Francia, Luis XV. Al comienzo del siglo XVIII se introdujo la variolización en Inglaterra. Años más tarde, el médico inoculador Edward Jenner oyó decir que las ordeñadoras contaminadas con una enfermedad benigna de las vacas, que se manifestaba con pústulas en la ubre, nunca desarrollaban viruela. En 1796, después de inocular en un niño la viruela vacuna y días más tarde la viruela humana, Jenner observó que el niño permanecía sano. El método de Jenner se difundió rápidamente por Europa, donde recibió el nombre de vacunación (por vacuna, del latín vacca), término que más tarde se extendería a los diversos tipos de inmunización artificial para prevenir una enfermedad. La vacunación fue introducida en Brasil en 1840, por el barón de Barbacena. En 1904, cuando Oswaldo Cruz era el Director General de Salud Pública, el gobierno decretó la obligatoriedad de la vacuna antivariólica. La resistencia de la población de Río de Janeiro, que se manifestó en motines y una revuelta histórica, obligó al gobierno a rever la medida. En 1908, después de una violenta epidemia de viruela (10.000 casos diagnosticados), la población acabó por aceptar la vacuna. Aunque los brotes de viruela se espaciaran notablemente con la vacunación, se calcula que 300 millones de personas murieron de viruela en el siglo XX. En la década de 1970, la Organización Mundial de la Salud reemplazó la vacunación masiva por una campaña de erradicación “en anillo”: al detectar un caso nuevo se aislaba a la víctima y se vacunaba inmediatamente a todas las personas que estaban en contacto con ella. Como el efecto de la vacuna era muy rápido, esa estrategia tuvo resultados extraordinarios, si bien que en ocasión de un brote ocurrido en Yugoslavia (1972) tuvo que ser complementada con una vacunación masiva. El último caso de viruela ocurrió en Somalia en 1977. Con la confirmación de la erradicación de la viruela en 1979, y la contaminación posterior de dos personas por el escape del virus de un laboratorio de la Universidad de Birmingham (Reino Unido, 1978), las reservas del virus 315 Biotecnología de la viruela comenzaron a ser eliminadas. Sin embargo, dos lotes fueron conservados en el CDC (Centro de Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, EUA) y en el VECTRO (Instituto para Preparaciones Virales, Moscú, Rusia). Aunque su destrucción estaba prevista para el año 2000, eso no ha ocurrido todavía. La mera posibilidad de un acto de terrorismo con este virus es atemorizante. No se puede descartar la existencia de reservas de virus en otros laboratorios y los médicos pueden tener dificultades en diagnosticar una enfermedad que hoy está restricta a los libros de texto. A fines de la década de 1970 se dejó de vacunar a la población, de modo que buena parte de ella no ha recibido nunca algún tipo de inmunización, y el resto pudo haber perdido la inmunidad por falta de refuerzos. Existe una pequeña reserva de vacunas que sobró de décadas atrás, pero su validez es incierta. Finalmente, existen contraindicaciones para la aplicación de la vacuna en personas con eczemas o inmunodeprimidas, mucho más frecuentes hoy que a comienzos del siglo XX. Aunque la viruela haya sido erradicada, no podemos prescindir de las vacunas eficientes y seguras que han sido formuladas gracias a las nuevas tecnologías y que ya están siendo evaluadas en ensayos clínicos. El caso de la poliomielitis La poliomielitis o parálisis infantil es una enfermedad infecciosa causada por un enterovirus que se transmite por el agua. El período de incubación es de 4 a 35 días, y el 10% de las personas infectadas desarrollan síntomas tales como fiebre, fatiga, dolor de cabeza, vómitos, constipación o diarrea, rigidez en la nuca y dolor en las extremidades. El 1% de las personas infectadas desarrolla la forma paralítica de la enfermedad. El poliovirus pasa del intestino a la corriente sanguínea e invade el sistema nervioso central, donde se multiplica destruyendo a las neuronas motoras y causando la parálisis de las extremidades. En los casos más graves en que el virus se aloja en el bulbo, los pacientes precisan ayuda mecánica para respirar. La enfermedad puede dejar también secuelas motoras permanentes (PPS o “síndrome pospolio”). Aunque hay evidencias de casos de polio en el Antiguo Egipto, los primeros brotes epidémicos ocurrieron a fines del siglo XIX, cuando comenzó a ser estudiada. En 1908, K. Landsteiner confirmó que se trataba de una enfermedad infecciosa, después de inocular monos con el tejido nervioso de un paciente muerto. 316 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas En la primera mitad del siglo XX, las epidemias de poliomielitis dejaron numerosas víctimas, especialmente entre los niños. Se sospecha que si bien las mejores condiciones higiénicas evitaban el contacto prematuro con el virus, la exposición tardía en la edad escolar encontraba un grupo vulnerable, favoreciendo la aparición de brotes. Hasta la década de 1950, las medidas preventivas eran limitadas y la enfermedad, aterradora. Al haber un brote, las escuelas cerraban y los niños eran privados del contacto entre ellos, permaneciendo aislados hasta que pasara el peligro. La llegada de una vacuna tuvo una repercusión extraordinaria. La vacuna de virus inactivados de Jonas Salk (IPV, del inglés, inactivated polio vaccine) comenzó a ser aplicada en 1954. Para fabricarla, tres tipos de poliovirus eran cultivados en riñón de mono (Macacus rhesus) y, posteriormente, se los inactivaba con formalina. Una segunda opción apareció en 1963, con la vacuna de virus atenuados de Albert Sabin (OPV, del inglés oral polio vaccine). Debido a modificaciones en los procesos productivos, la eficiencia de ambas vacunas aumentó considerablemente en los años posteriores. Ambas tienen ventajas y desventajas. La inyección (IPV) demanda agujas y jeringas estériles, y por eso es más cara y menos segura que la ingestión por gotas (OPV). Por otro lado, una vacuna de virus atenuados como la OPV debe mantenerse en frío. Desde el punto de vista de la eficacia, la OPV confiere una inmunidad más amplia, porque envuelve la mucosa digestiva y frena la transmisión del virus salvaje. Pero al estar basada en virus atenuados, la OPV es peligrosa para las personas inmunodeprimidas, porque aunque no fueran vacunadas, el virus podría llegarles a través de la contaminación con heces de personas inmunizadas. Por estas ventajas y desventajas algunos países usan la IPV y otros la OPV. Hay nuevas vacunas que se están investigando como, por ejemplo, una de tipo recombinante en la que el gen de una proteína de la cápside viral se insertó en el genoma de Escherichia coli. Esta bacteria, que coloniza normalmente el intestino, sintetizaría la proteína que inmunizaría al hospedador. A pesar del éxito de la vacunación, la erradicación de la enfermedad parece ser más compleja que lo esperado. La polio aún subsiste en algunas regiones de África, del subcontinente indio y del Extremo Oriente, donde las campañas de vacunación son complejas y muchas veces interrumpidas por conflictos bélicos. El brote ocurrido en Holanda (1992-1993) en un grupo que se opone a la vacunación por motivos religiosos, mostró que el virus salvaje continúa presente en la naturaleza. En 2000, la polio reapareció en Haití y República Dominicana. En la ocasión se comprobó que el virus atenuado puede revertir y que aún cuando no se detecten más casos de polio, 317 Biotecnología la vacunación deberá mantenerse por varios años. En 2004 hubo un nuevo brote de polio en países del oeste africano, confirmando que el objetivo aún está distante. El caso de la influenza La influenza o gripe es una enfermedad caracterizada por los siguientes síntomas: fiebre, dolores musculares, garganta inflamada, fatiga y dolor de cabeza. El agente infeccioso es el virus de la influenza que está formado por ARN dentro de un capsídeo proteico y rodeado por una envoltura, derivada de la membrana celular del hospedero. El hecho de tener ARN como material genético, confiere a su portador una variabilidad enorme, puesto que los errores de replicación no son reparados por ningún mecanismo celular, como en el caso del ADN. Los virus de influenza se clasifican en tres categorías (A, B y C). Según las variantes de dos glicoproteínas de membrana (hemaglutinina, H; neuraminidasa, N) se diferencian varios subtipos como, por ejemplo: H1N1, H5N1, etc. Los virus de influenza de la categoría A son los más peligrosos, porque se multiplican tanto en el hombre como en otras especies (aves, cerdos, perros, caballos). Al saltar de una especie a otra, el material genético de diferente origen recombina, formando virus con características nuevas. Para desencadenar una pandemia es necesario que ese virus infecte al hombre y sufra una mutación que posibilite la transmisión de una persona a otra. En el siglo XX, varias pandemias de gripe asolaron la Tierra. En 1918, un brote de gripe surgió en España, desde donde se difundió por todo el mundo, causando la muerte de 40 a 70 millones de personas. El virus H1N1 de la gripe española perdió buena parte de su patogenicidad a partir de 1920, pero continuó circulando en la población durante varias décadas. En 1957, la pandemia siguiente se originó en China. La gripe asiática (subtipo H2N2) causó la muerte de dos millones de personas. Pocos años después, en 1968, el subtipo H3N2 apareció en Hong Kong y se distribuyó por el mundo, dejando 47.000 muertos. La gripe aviaria (subtipo H5N1) surgió en Asia en 1997. Este brote es preocupante porque trae una amenaza doble. La primera es la necesidad de eliminar a las aves contaminadas, con las consiguientes pérdidas económicas. La segunda es una eventual mutación del virus que permita la transmisión de persona a persona, porque hasta ahora siempre ocurrió de ave a ave y de ave a hombre. De ocurrir esa mutación, la pandemia solo podrá frenarse con medicamentos antivirales y vacunas para animales y humanos. 318 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas Los métodos tradicionales de producción de vacunas no sirven para el H5N1 porque emplean embriones de pollo. Seleccionando la información genética relevante del virus, y transfiriéndola a un virus de laboratorio, se puede obtener un prototipo viral para la producción de la vacuna, que reúne la información para estimular la respuesta inmune contra el H5N1 y puede crecer en embriones de pollo. La gripe A (subtipo H1N1) o gripe porcina, apareció en México en 2009. A diferencia de las variantes anteriores, este virus causó más muertes entre los jóvenes y las mujeres embarazadas que entre las personas mayores, un fenómeno que podría tener explicación en la circulación del H1N1 durante varias décadas. La existencia de medicamentos antivirales contribuyó al control de la pandemia. No obstante, la movilización de las autoridades nacionales y de las empresas farmacéuticas fue decisiva para obtener una vacuna adecuada. Durante esta última pandemia, se verificó que es muy difícil producir rápidamente una vacuna en huevos embrionados, de los cuales se necesitan 900 millones para obtener 300 millones de dosis de vacunas. En caso de urgencia, sería más rápido producirlas en cultivos celulares. Una de las dificultades para encontrar una vacuna es la mutabilidad de los virus de la influenza. El candidato a vacuna de hoy puede no servir mañana, por lo que es difícil determinar con qué antígenos del virus armar la vacuna. Por eso las vacunas contra la gripe se preparan anualmente, eligiendo las cepas que se supone causarán la próxima epidemia. Obviamente, algunas resultan más eficientes que otras. En el caso de una pandemia, las grandes empresas no tendrán suficientes vacunas para la población. Previendo esta situación, el Instituto Butantan de Brasil se está preparando para producir vacunas contra la gripe. Con un objetivo similar se creó en Argentina el Centro Biotecnológico César Milstein, una asociación entre el CEVAN (Centro de Virología Animal) y la Fundación Pablo Cassará. 6. LA AMENAZA DE LAS ENFERMEDADES EMERGENTES A medida que eliminamos o controlamos enfermedades, emergen otras nuevas y reaparecen algunas de las que creíamos desaparecidas. La destrucción de los hábitats naturales deja al hombre a la merced de agentes infecciosos con los cuales nunca tuvo contacto. El crecimiento de la población, el incremento de los viajes e intercambios comerciales internacionales, así como 319 Biotecnología los cambios de comportamiento, son también factores determinantes para la dispersión de agentes infecciosos. Por otro lado, los microorganismos adquieren resistencia a los medicamentos. La gripe española, la hepatitis B, las fiebres hemorrágicas (Junín, Lassa, Marburg, Ébola, etc.), la enfermedad de Lyme, la enfermedad de los Legionarios, el VIH/sida, la Escherichia coli 0157:H7 contaminante de los alimentos, el virus del Nilo occidental, la BSE (encefalopatía espongiforme bovina), el dengue, son algunos de los ejemplos de enfermedades emergentes. Varias cuentan con pruebas de diagnóstico, pero muy pocas con vacunas (hepatitis B, enfermedad de Lyme). En este sentido hay que considerar que transcurre bastante tiempo entre la descripción e identificación del patógeno y la producción de una vacuna. De estas enfermedades, la más insidiosa tal vez sea el sida, porque debilita al sistema inmune dejándolo sin armas para hacerle frente a infecciones oportunistas (virus, hongos, bacterias, cáncer). Los primeros casos aparecieron en 1981 y se extendieron rápidamente en la población. Se estima que en un único año (2002), murieron 3,1 millones de personas y se contaminaron 5 millones. Aproximadamente el 90% de las nuevas contaminaciones ocurren en los países en desarrollo, especialmente en el sur de África y en Asia. A la sombra del sida y de la adicción a drogas inyectables reaparece la tuberculosis, ahora causada por gérmenes multirresistentes a los medicamentos. A pesar de las medidas preventivas y de los grandes progresos alcanzados en el tratamiento del sida, sería ideal encontrar una vacuna. Las dificultades son enormes, porque tendría que activar a las células T auxiliadoras, reguladoras de la respuesta inmune, que son las células que el virus destruye. Como generalmente el virus penetra en el organismo por vía anal o vaginal, permaneciendo un tiempo en la corriente sanguínea antes de invadir las células, la vacuna debería estimular ambas vías, humoral y celular, y llegar a las mucosas. En la lucha contra el sida hay varias estrategias posibles. Una de ellas es impedir que el virus invada al organismo. La otra, ayudar al organismo a impedir la progresión y la transmisión de la enfermedad. La falta de un modelo animal adecuado y las frecuentes mutaciones del virus complican la tarea. Aunque los resultados obtenidos hasta ahora hayan sido decepcionantes, se están haciendo ensayos clínicos con vacunas de subunidades, de vectores virales recombinantes y de ADN. Tal vez nos encontremos un poco más cerca del control de la enfermedad. El SARS (del inglés, severe acute respiratory syndrome) es una enfermedad viral que se transmite por el aire. Emergió en China en 2003, y se diseminó 320 Capítulo XVII. Biotecnología y salud: las vacunas rápidamente por 30 países. La enfermedad mató al 10-15% de las personas infectadas y representa una amenaza porque cabe la posibilidad de que reaparezca en algún momento. A diferencia de los virus de la neumonía o de la gripe, el agente infeccioso es una cepa patogénica de coronavirus. Según la secuencia completa de su genoma, parecería ser el resultado de una recombinación ocurrida naturalmente entre dos virus, uno de ave y otro de ratón. Se espera conseguir una vacuna en los próximos cinco años. 7. EL BIOTERRORISMO Después del atentado a las torres del World Trade Center (Estados Unidos, septiembre de 2001), la diseminación intencional de esporas por el correo causó un brote de ántrax, alertando al mundo sobre la amenaza del bioterrorismo. No fue la primera vez que se utilizaron armas biológicas. Los romanos infectaban con animales muertos los pozos de agua de sus enemigos; en América (del Sur y del Norte) los colonizadores exterminaron tribus indígenas con mantas contaminadas dejadas como regalo; antes de retirarse, el ejército tártaro de Janibeg catapultó a sus muertos por la peste sobre la ciudadela sitiada de Kaffa (Crimea, 1346), iniciando una terrible epidemia que se difundió en Europa y diezmó a la población, y que aún hoy mata a 2.000 personas por año en África y en Asia. En 1941, Japón diseminó la peste bubónica en el norte de China, en cinco ocasiones. Se estima que una docena de países dispondría de armas biológicas de destrucción masiva, incluyendo a unos 70 agentes infecciosos. Actualmente (o a corto plazo) hay vacunas para algunas de ellas, como el ántrax y la viruela. Sin embargo, la vacunación no sería un método apropiado para la prevención masiva desde un punto de vista científico, sanitario o económico. Por eso, una buena parte del esfuerzo antiterrorista se orienta al mejoramiento del diagnóstico y la búsqueda de nuevos medicamentos antivirales y antibacterianos. Resulta preocupante la cantidad de información referente al genoma de patógenos que se encuentra en los bancos de datos públicos, ya que se teme que ese conocimiento sea empleado para elaborar armas biológicas. En 2002, un grupo de investigadores norteamericanos mostró que pueden obtenerse partículas infecciosas sintéticas de poliovirus, a partir de la secuencia genómica disponible en internet. Después de sintetizar algunos fragmentos de ADN y encargar otros a algunas empresas especializadas, juntaron los 321 Biotecnología pedazos y construyeron una molécula de ADN de 7.500 pares de bases. Después de transcribir la información y transferir el ARN a un medio con componentes celulares, obtuvieron partículas virales. Recientemente, otro grupo de investigadores utilizó el mismo método para sintetizar el virus de la gripe española. Estos hechos han levantado una polémica sobre la conveniencia de que estén disponibles secuencias que representen un riesgo para la seguridad. También se ha discutido acerca de la responsabilidad de las empresas que sintetizan cadenas de nucleótidos, sin verificar el riesgo o la procedencia del pedido. El peligro del bioterrorismo no debe ser subestimado. Una nueva disciplina, denominada bioprotección, biocustodia o biocontención, lidia con el uso inadecuado del conocimiento biológico y, particularmente, con las investigaciones consideradas de uso doble. 322 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico 1. LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO El reconocimiento de los síntomas de una enfermedad exige del médico conocimiento y experiencia. El diagnóstico se establece en función de varios elementos, como la historia clínica del paciente, la información obtenida mediante una serie de preguntas, los exámenes físicos, y una batería de análisis y pruebas de laboratorio. Estas últimas detectan a los factores químicos, microbianos o genéticos que causan o están asociados a una enfermedad. Las pruebas de laboratorio se hacen a partir de muestras de tejidos y fluidos corporales, a petición del médico. Si bien algunos son rápidos, como las tipificaciones sanguíneas, otros llevan tiempo, como los cultivos de microorganismos. La mayoría de ellos se hace con kits comerciales, pero aún hay pruebas que deben hacerse en el laboratorio, especialmente las que requieren una observación al microscopio (anatomía patológica, parasitología). Los resultados se evalúan según un conjunto de valores considerados normales, y se remiten al médico como una fuente objetiva de información. Cualquier negligencia relativa a la adopción de las pruebas adecuadas puede tener consecuencias graves para la salud pública. Basta mencionar el ejemplo de Francia, que pese a la existencia en el mercado de un ensayo de la empresa Abbott para el diagnóstico del VIH, en 1985 postergó el rastreo de las donaciones de sangre, como una medida proteccionista para favorecer el lanzamiento de un ensayo francés. Como consecuencia, 297 personas recibieron transfusiones de sangre contaminada, una tragedia que obligó a tres ministros de Estado a comparecer ante la justicia y responder por el escándalo. Como parte de los sectores médico y veterinario, la industria del diagnóstico in vitro espera crecer, estimándose que alcanzará un volumen de ventas aproximado de 60 mil millones de dólares, en 2014. El sector que más prospera es el de diagnósticos moleculares (enfermedades infecciosas y 323 Biotecnología cardiovasculares, oncología y farmacogenética), en función del crecimiento de los mercados de América Latina, Este Europeo, Medio Oriente y Este Asiático. Las tendencias actuales Una de las tendencias actuales es la centralización de las pruebas, en un sistema automatizado de alta tecnología donde se integren los reactivos, los instrumentos analíticos y los productos accesorios de control de calidad. Por eso, los análisis clínicos están concentrándose en unas pocas empresas, con suficiente poder económico como para acceder a la tecnología y a un volumen de muestras suficientemente amplio que justifique el empleo de esos sistemas. La construcción de dispositivos miniaturizados de arrays moleculares de proteínas, anticuerpos o ácidos nucleicos estimuló el desarrollo de varias plataformas comerciales (Affymetrix, Illumina, Agilent, AppliedBiosystems, Incyte/Stanford, etc.). La llegada de materiales y dispositivos construidos en escala nanométrica deberá revolucionar las pruebas in vitro. El desarrollo de la tecnología microfluídica permitió la miniaturización de pruebas diagnósticas, en dispositivos que realizan automáticamente las diversas etapas del procedimiento. Con los biochips microfluídicos o lab-on-a-chip (LOC), se obtienen resultados precisos en el consultorio médico, en el hospital (emergencia, unidad de terapia intensiva) o en algún lugar aislado, sin necesidad de recurrir al laboratorio. Se estima que en 2014, el mercado global de los productos lab-on-a-chip será de 2,1 mil millones de dólares. Como otra línea en el mercado, hay kits relativamente simples que permiten el prediagnóstico de embarazo y el monitoreo de condiciones crónicas (diabetes, tenor de colesterol y triglicéridos), y son vendidos en las farmacias o por internet. ¿Qué es una buena prueba de diagnóstico? Las técnicas bioquímicas, inmunológicas y moleculares ocupan un lugar preponderante, porque reúnen varias cualidades (Tabla 1). Aunque se aplican también en el área ambiental (análisis de suelos, calidad del agua) y en la industria de alimentos (identificación de contaminantes en los alimentos o las materias primas), en este capítulo nos limitaremos a analizar su utilización en el área de salud. 324 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico TABLA 1. Las cualidades de una buena prueba de diagnóstico Calidad Sensibilidad Especificidad Exactitud Reproductibilidad Definición Dar un resultado positivo cuando la condición está presente Dar un resultado negativo cuando la condición no está presente Dar el mismo valor que el obtenido con otro método Dar siempre el mismo valor en la misma muestra Las diferentes técnicas Técnicas de base biológica A partir de la década de 1970, las técnicas clásicas de identificación microbiana comenzaron a ser sustituidas por sistemas miniaturizados. En los sistemas API de la empresa Biomérieux, por ejemplo, se adiciona una alícuota de suspensión bacteriana a minitubos con los reactivos necesarios para determinar sus características fisiológicas. Dependiendo del caso, las reacciones tienen lugar en condiciones aerobias o anaerobias. Técnicas de base inmunológica Basadas en la reacción antígeno-anticuerpo (aglutinación y precipitación), las técnicas inmunológicas recibieron un gran impulso a partir de 1975, con el desarrollo de la tecnología de los hibridomas. Desde entonces, el principal progreso ha sido la construcción, por ingeniería genética, de bibliotecas de bacteriófagos productores de fragmentos de anticuerpos humanos. En estos fagos el gen de una proteína viral ha sido fusionado con el gen correspondiente a la región variable de un anticuerpo, aislado de linfocitos B humanos. Aún siendo compleja, demorada y cara, la producción de anticuerpos monoclonales abastece los laboratorios con reactivos estándar, específicos y sensibles. Asociados a moléculas radioactivas o fluorescentes, los anticuerpos monoclonales detectan los antígenos correspondientes en células, tejidos, sueros y separaciones electroforéticas (inmunofluorescencia, radioinmunoensayo, Western Blot, etc.). También se utilizan para separar las diferentes poblaciones celulares (CellSorter) y localizar tumores. 325 Biotecnología En otras pruebas se usan anticuerpos unidos a enzimas, que forman un producto coloreado en presencia del sustrato (ELISA o enzyme linked immunosorbent assay). Estas pruebas detectan y miden la concentración de anticuerpos (infecciones, enfermedades autoinmunes) y de antígenos (hormonas, antígenos cancerosos, alérgenos en los alimentos y en el polvo casero, toxinas alimentarias, esteroides usados ilícitamente por atletas, drogas como la cocaína y los opiáceos, etc.). Las reacciones se procesan en microplacas de poliestireno con un número variable de cavidades, en los que se fija el anticuerpo (o el antígeno), lo que permite hacer numerosos ensayos al mismo tiempo, con un volumen mínimo de reactivos, y automatizar la lectura de los resultados (Figura 1). Existen también microarrays, en láminas donde se fijan más de una centena de proteínas o de anticuerpos por centímetro cuadrado. A diferencia de los chips microfluídicos, que separan y procesan proteínas, esos microarrays separan las proteínas del medio y las fijan, posibilitando su identificación. Estos dispositivos son de gran importancia en los estudios relativos al proteoma y se estima que el mercado global de microarrays proteicos llegue a 848 millones de dólares, en 2014. Las técnicas de base genética La acumulación del conocimiento sobre el genoma humano y de otros organismos favorece la utilización de estas tecnologías para el diagnóstico clínico. El empleo de sondas simplificó la metodología del estudio de los cariotipos. En el procedimiento denominado SKY (del inglés, spectral karyotyping), los cromosomas se marcan con sondas específicas fluorescentes de diferente intensidad, que la computadora transforma en una imagen con colores brillantes y bien definidos. Mediante este artificio se pueden identificar rápidamente los pares cromosómicos e, inclusive, las traslocaciones pequeñas. Las sondas específicas sirven también para localizar cromosomas y secuencias génicas en las células (FISH, del inglés fluorescence in situ hybridization y ASO, del inglés allele-specific oligonucleotide) y en los fragmentos de ácidos nucleicos separados por electroforesis en geles (Southern y Northern Blot, Fingerprint). Pero la gran estrella de las pruebas de diagnóstico es la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés, polymerase chain reaction), una tecnología que amplifica cantidades ínfimas de ADN, posibilitando los análisis 326 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico FIGURA 1. Prueba positiva de ELISA (métodos directo e indirecto) MÉTODO DIRECTO El anticuerpo está fijo en la placa de microtitulación MÉTODO INDIRECTO El antígeno está fijo en la placa de microtitulación El antígeno presente en la muestra de sangre se fija al anticuerpo. Se retira el exceso (lavado) El anticuerpo presente en la muestra de suero se fija al antígeno. Se retira el exceso (lavado) Los anticuerpos asociados a una enzima E se fijan al antígeno. Se retira el exceso (lavado) Los anticuerpos específicos para la inmunoglobulina humana se fijan a los anticuerpos del suero. Se retira el exceso (lavado) Al agregar el sustrato de la enzima se forma un producto colorido Al agregar el sustrato de la enzima se forma un producto colorido La intensidad del color es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra de sangre La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la muestra de suero posteriores. En el área médica, la PCR se usa principalmente para detectar organismos infecciosos y variaciones genéticas en los pacientes. Hay diferentes variantes que permiten la amplificación de segmentos más extensos y de diversas secuencias blanco, así como la medición de la cantidad de ácidos nucleicos, inclusive ARN. De la combinación de las propiedades de esas variantes surgen otras más eficientes, que cuando se aplican a la detección de marcadores específicos permiten, por ejemplo, verificar la desaparición de un clon celular maligno y determinar si es necesario prolongar un tratamiento oncológico. 327 Biotecnología Recientemente, con el monitoreo de la reacción con anticuerpos fluorescentes, se consiguieron eliminar los estudios complementarios (electroforesis en gel) posteriores a la amplificación. Así, los resultados se obtienen rápidamente y “en tiempo real”. La versatilidad de esta tecnología se refleja en el número de procedimientos posibles: Qualitative-PCR, QuantitativePC, Multiplex-PCR, ReverseTranscriptase-PCR, LT-PCR, RealTime-PCR, PCR in situ, RealTime-ELISA-PCR, etcétera. Los mayores progresos surgen de la construcción de sistemas miniaturizados como los biochips microfluídicos (lab-on-a-chip) y los microarrays y biochips de ADN. Un biochip microfluídico reúne en un único dispositivo las etapas de un procedimiento de diagnóstico complejo: extracción de la muestra, separación electroforética, coloración/descoloración e identificación. El lab-on-a-chip exige una intervención humana mínima, y da rápidamente un resultado preciso que puede ser archivado fácilmente. Otro tipo de dispositivo es el microarray, que puede tener hasta 100.000 sondas de ADN por centímetro cuadrado, fijas en una lámina. La hibridización de estas sondas con moléculas de ácidos nucleicos marcados (ADNc) es detectada por barrido (scanning) y se observa como puntos fluorescentes (Figura 2). Los microarrays son utilizados en los estudios de expresión génica y para el secuenciamiento rápido de oligonucleótidos. El estudio simultáneo de centenas de genes comienza a revelar varios aspectos del funcionamiento del genoma y de las interrelaciones entre los genes. Sus aplicaciones permitirán grandes progresos en el diagnóstico de las enfermedades cardíacas, neurosiquiátricas y oncológicas. También permitirán la elección de tratamientos farmacológicos adecuados al perfil de cada paciente. Se estima que, en 2014 el mercado global de microarrays de ADN llegue a 2,7 mil millones de dólares. 2. LAS PRUEBAS DE RASTREO Solicitadas por el médico para controlar el estado de salud del paciente, las pruebas de rastreo constituyen una rutina que varía en función del sexo y la edad. Generalmente se realizan en muestras de sangre y orina, y su objetivo es detectar cualquier disfunción de manera de inducir cambios en el estilo de vida del paciente e iniciar rápidamente un tratamiento. Como ejemplos podemos nombrar al hemograma, el análisis de orina, el lipidograma y, también, la identificación del antígeno prostático para diagnóstico del cáncer, etcétera. 328 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico FIGURA 2. Uso de arrays en el diagnóstico de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, asociadas al riesgo de padecer cáncer de mama u ovario Se compara el patrón obtenido en la hibridización de los fragmentos de ADNc marcados de una paciente y un control normal. La hibridización de ambos ADN, del ADN de la paciente o del ADN del control se evidencia por barrido con colores diferentes. Tejido de la paciente Tejido control Extracción del ARNm Extracción del ARNm Preparación del ADNc (transcriptasa reversa) Preparación del ADNc (transcriptasa reversa) Amplificación y marcación del ADN con colorantes de diferente fluorescencia Mezcla en cantidades iguales de los ADNc marcados Hibridización con las sondas fijadas en la placa del microarray y lavado Barrido y lectura de la imagen Puntos de diferentes colores identifican, respectivamente, los sitios de hibridización de los ADNc de la paciente y del control. Un tercer color identifica los sitios de hibridización de ambas muestras de ADNc, y un cuarto los de ninguna de las dos Diagnóstico 3. EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS La transmisión de una enfermedad infecciosa se detiene con el tratamiento, que es posterior al diagnóstico. En los países ricos, y también en algunos sectores de los países en desarrollo, las nuevas pruebas de diagnóstico se encuentran al alcance de la población. Pero esta no es la realidad de los países más pobres, sin acceso a una tecnología que exige materiales y equipamientos especializados. En estos países, una de las principales causas de mortalidad 329 Biotecnología continúa siendo la alta incidencia de enfermedades infecciosas, entre las cuales hay que incluir las emergentes (VIH/sida), las re-emergentes (tuberculosis) y las correspondientes al vasto grupo de enfermedades abandonadas (malaria, etcétera). El diagnóstico del VIH se basa en el reconocimiento de una proteína (p24) del virus y en la presencia de anticuerpos (ELISA, Western Blot), dos pruebas que actualmente pueden combinarse en una sola. La gran innovación sería complementar o sustituir de las pruebas actuales, por otras más rápidas que no requieran una infraestructura de laboratorio. Una vez diagnosticada la infección, hay dos pruebas que acompañan su evolución: la determinación de la carga viral, medida por PCR cuantitativa, y el conteo de células CD4. Según los resultados, se inicia al tratamiento correspondiente. La resistencia de la cepa viral a los medicamentos se evalúa mediante pruebas genéticas. Los kits para el diagnóstico del VIH/sida ya se venden en algunos países, aunque su uso se encuentre limitado por la necesidad de apoyo psicológico y la dificultad de lidiar con resultados “falso positivo” o “falso negativo”. Sin embargo, en manos de personal entrenado, las pruebas de diagnóstico rápido son una herramienta valiosa para el diagnóstico de esta infección y otras enfermedades de importancia epidemiológica, como hepatitis, sífilis y malaria. El diagnóstico de la malaria depende generalmente de observaciones clínicas confirmadas por microscopía, una técnica que a pesar de ser relativamente económica, exige personal entrenado. Aunque existen pruebas genéticas, los ensayos inmunológicos rápidos resultan más adecuados en las regiones más alejadas, sin laboratorios ni equipamientos. A un costo menor, reconocen al Plasmodium falciparum, una de las especies que causan la enfermedad, facilitando la elección del tratamiento específico. El diagnóstico de la tuberculosis comprende una serie de etapas lentas y trabajosas. La infección latente se descubre con la reacción a la tuberculina, mientras que la enfermedad se detecta a partir de radiografías, observaciones microscópicas (baciloscopía) y cultivo microbiano. Hay pruebas más recientes que identifican anticuerpos (ELISA) en sangre y al patógeno Mycobacterium tuberculosis directamente en el esputo, con sondas genéticas o PCR. Aunque son mucho más rápidas y eficientes, su difusión está limitada por el costo. Los países emergentes necesitan pruebas de diagnóstico adaptadas a las enfermedades que los afectan como, por ejemplo, la enfermedad de Chagas, la leishmaniasis, la malaria, la leptospirosis, el dengue, las infecciones por rotavirus, etc. Varias empresas latinoamericanas desarrollan tecnologías avanzadas y comercializan sus kits de diagnóstico en varios países (Argentina, 330 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico Brasil, Chile, Colombia, Cuba, Venezuela y Uruguay). Algunos son innovadores como, por ejemplo, los kits para detectar el mal de Chagas de varias empresas argentinas. 4. LA TIPIFICACIÓN DE TEJIDOS Sangre La tipificación de los glóbulos rojos clasifica a las personas en cuatro grupos para los marcadores ABO (A, B, AB y O) y dos para el sistema Rh (Rh+ y Rh-). La caracterización de rutina de este último durante el embarazo permite tomar medidas en caso de incompatibilidad sanguínea madre-feto. También es necesaria la tipificación sanguínea de los sistemas ABO y Rh antes de una transfusión, práctica que salva vidas en pacientes que sufrieron hemorragias (accidente, cirugía, enfermedades digestivas, etc.) o que presentan un cuadro de anemia severa (quimioterapia, cáncer, enfermedades hematológicas). A veces no basta con la tipificación ABO/Rh de los antígenos de superficie de los glóbulos rojos, porque existen otros sistemas de grupos sanguíneos que pueden desencadenar una reacción grave. En pacientes que pasaron por un embarazo o recibieron una transfusión, los anticuerpos para estos sistemas se investigan con kits que incluyen paneles de glóbulos rojos adecuados. La palabra final la dan las pruebas de compatibilidad, en las que se colocan los glóbulos rojos del donante en presencia del suero del receptor. Estas pruebas personalizadas son indispensables en la rutina de un banco de sangre, y son realizadas por personal especializado. En los centros de salud que procesan un gran número de muestras de sangre, las pruebas serológicas clásicas en tubos de vidrio están siendo reemplazadas por nuevas tecnologías que se desarrollan en estaciones de trabajo automatizadas: GelTests para tipificación de glóbulos rojos, ACT (del inglés affinity column technology) para identificar subclases de inmunoglobulinas en glóbulos rojos sensibilizados, tecnología en fase sólida para determinar anticuerpos en placas de microtitulación. Otros tejidos y órganos El rechazo de un órgano trasplantado se debe a la incompatibilidad entre sus respectivos tejidos. Además de los antígenos del grupo sanguíneo (ABO), 331 Biotecnología hay otros marcadores de identidad que también se expresan en las células de un organismo. El sistema inmune los utiliza para diferenciar a las células que forman parte de “lo propio” de las que no pertenecen al organismo (“no propio”). Estos antígenos son codificados por un conjunto de genes estrechamente ligados y localizados en el cromosoma 6. Los genes HLA, HLB y HLC corresponden a los antígenos de clase I, que se encuentran en todas las células, salvo en los glóbulos rojos. El locus HLD determina otros tres antígenos (DR, DQ y DP), denominados de Clase II, que solo aparecen en algunas células (macrófagos, monocitos, células dendríticas y células endoteliales). Desde el punto de vista clínico, los más importantes son los antígenos de clase I codificados por alelos de HLA y HLB y los de clase II relacionados con DR. La herencia del sistema HLA sigue un patrón de co-dominancia, es decir que ambos alelos se expresan en las células. Cuando una persona es caracterizada como HLA - A1 A3 B8 B14 DR2 DR10, eso significa que en un cromosoma lleva los alelos A1 B8 DR2 heredados de uno de los padres y en el otro los A3 B14 DR10, heredados del otro. Estos genes están estrechamente ligados y se transmiten en bloques, denominados haplotipos. En principio, como estos genes cuentan con más de 450 alelos, las combinaciones posibles serían millones y cada persona tendría una identidad única. Sin embargo, algunos haplotipos son más frecuentes que otros, especialmente en determinados grupos étnicos. En la tipificación de los tejidos se utilizan diversas técnicas. Los antígenos celulares se identifican con baterías de anticuerpos e instrumentación de laboratorio. La incompatibilidad entre los linfocitos o tejidos del donante, y los linfocitos del receptor, es evidenciada por la proliferación celular in vitro (reacción mixta). También se usa la PCR para caracterizar a los genes HLADP del donante y del receptor (pruebas de ADN). Antes de un trasplante se procede a una prueba de compatibilidad entre el suero del receptor y los tejidos del donante, para verificar la ausencia de anticuerpos contra el órgano a trasplantar (crossmatch), que pueden aparecer debido a embarazos, trasplantes anteriores o transfusiones. 5. LA PRÁCTICA FORENSE Con excepción de los gemelos idénticos, ninguna persona es idéntica a otra. Durante casi un siglo, la identificación de las personas dependió de las 332 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico FIGURA 3. El sistema HLA humano A. El cromosoma 6 B. La herencia de los haplotipos Madre Padre impresiones digitales. Los estudios bioquímicos e inmunológicos facilitaron la resolución de muchos crímenes, a pesar de la dificultad para encontrar el material en cantidades suficientes y en el estado de conservación adecuado. El análisis del ADN para la identificación de las personas se usa desde la década de 1980, cuando A. Jeffreys ideó la técnica del Fingerprint, estableciendo una relación única entre un individuo y su secuencia génica. La identificación se focaliza en las pequeñas secuencias no codificantes, que se repiten un número variable de veces, originando segmentos de diferente tamaño dispersos en el ADN (minisatélites o VNTR, del inglés variable number of tandem repeats; microsatélites o STR, del inglés short tandem repeats). Estos se separan por electroforesis y luego pueden detectarse con sondas. También se pueden amplificar por PCR y, en los métodos más recientes, es posible analizar hasta veinte loci simultáneamente usando una coloración específica para cada uno. Como la probabilidad de que dos personas elegidas al azar tengan el mismo perfil de ADN es menor que uno en un billón, el resultado es prácticamente único para cada individuo. En la determinación de la paternidad, los estudios de grupos sanguíneos y de proteínas del suero fueron complementados o reemplazados por las pruebas de ADN, que se transformaron en el foco de varias investigaciones muy comentadas en los medios. En Brasil, por ejemplo, el jugador de fútbol Pelé tuvo que reconocer la paternidad de Sandra Regina; y Pedrinho, un niño secuestrado en la maternidad luego de su nacimiento, pudo reencontrarse años más tarde con su verdadera familia. 333 Biotecnología A pesar de las críticas sobre la posibilidad de que se cometan errores de laboratorio por la contaminación de muestras, el riesgo de la participación de personal poco entrenado y la dificultad en la interpretación estadística de los datos, en pocos años el análisis de ADN se transformó en una herramienta indispensable en la práctica forense. En 1992 se identificaron los huesos encontrados años antes, en una tumba en Brasil, como pertenecientes al comandante del campo de exterminio de Auschwitz, el nazi Joseph Mengele, uno de los hombres más buscados después de la Segunda Guerra Mundial. Luego de años de misterios y rumores, los cadáveres enterrados en una fosa común cerca de Ekaterinburg fueron reconocidos en 1994 como pertenecientes al zar Nicolás II, su familia y servidores, asesinados durante la Revolución Rusa (1918). Más recientemente, en los Estados Unidos, la mancha de semen en el vestido azul de una pasante se transformó en una pieza esencial para solicitar el impeachment del presidente Clinton. El análisis de ADN es la única forma de reconocer a las víctimas de catástrofes, conflictos bélicos y atentados, como el del World Trade Center (Nueva York, 2001) o de la estación de Atocha (Madrid, 2004). Y años después a su instigador, Osama Bin Laden. Si las muestras están muy degradadas, se procede a analizar el ADN mitocondrial, que se transmite por vía materna y cuenta con una región que al ser muy variable permite la identificación de las personas. Esta metodología ha sido aplicada en Argentina. Durante el régimen militar que gobernó al país en el período 1976-1983, fueron exterminadas (“desaparecieron”) entre 9.000 y 30.000 personas. Hubo muchos niños separados de sus familias y entregados en adopción, bajo una nueva identidad. La comparación entre su ADN y el de sus abuelas maternas permitió que muchos hijos de “desaparecidos” recuperasen su identidad. 6. EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS Las limitaciones de las pruebas Las enfermedades genéticas representan a un grupo heterogéneo de patologías que obedece a diversas causas: alteraciones en el número y en la estructura de los cromosomas, acción de un gen determinando la síntesis de una proteína anormal o su ausencia, acción de varios genes interactuando con factores ambientales (humo de cigarrillo, dieta, estrés, etcétera). 334 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico El diagnóstico se apoya en observaciones clínicas y pruebas de laboratorio (metabolismo, cromosomas, ADN). La localización y la secuenciación de los genes responsables por las principales enfermedades monogénicas posibilitaron el desarrollo de pruebas genéticas. Sin embargo, estas presentan algunas limitaciones, debidas a la propia heterogeneidad del determinismo genético, como por ejemplo: Algunas mutaciones son inocuas para la salud del portador (polimorfismos). Mutaciones en genes diferentes pueden causar la misma enfermedad. Mutaciones diferentes dentro de un mismo gen pueden causar la misma enfermedad. Mutaciones diferentes dentro del mismo gen pueden causar enfermedades parecidas, pero con pronóstico diferente (benigno o grave). Por consiguiente, puede ser que una prueba genética no detecte todas las mutaciones capaces de causar una enfermedad, y que su sensibilidad dependa de la inclusión en la misma prueba de la información más reciente proveniente de la investigación genética. Existen enfermedades genéticas que aparecen en una familia debido a mutaciones en algún gen desconocido. No siempre es posible describir la mutación, pero en algunos casos las pruebas de ligamiento permiten inferencias sobre la transmisión de la enfermedad. En estas pruebas se sigue la transmisión de un marcador, que es otro gen estrechamente ligado al gen desconocido. Un estudio desarrollado por 50 grupos de investigación (Wellcome Trust Case Control Consortium) identificó recientemente 24 regiones del genoma humano estrechamente relacionadas con siete enfermedades diferentes: Crohn, diabetes 1 y 2, disturbios cardiovasculares, hipertensión, artritis reumatoide y enfermedad bipolar. Es difícil determinar cuál es la contribución de cada gen en las enfermedades que presentan un patrón de herencia complejo, donde varios genes interactúan con factores ambientales. A menos que haya un gen que tenga un efecto mucho mayor que el resto, las pruebas genéticas son, por ahora, de difícil elaboración. La presencia de determinados alelos, como BRCA1 y BRCA2 está asociada a una predisposición familiar al cáncer de mama. Pero la recíproca no es cierta, porque en la mayoría de los casos de cáncer de mama no se detectan esos alelos. No todas las enfermedades genéticas son familiares, pueden aparecer debido a mutaciones o alteraciones cromosómicas ocurridas a lo largo de la vida. 335 Biotecnología Las estrategias seguidas A pesar de sus limitaciones, las pruebas genéticas representan un avance significativo desde el punto de vista médico e individual. Se pueden realizar en cualquier momento de la vida de una persona, y responden a diferentes objetivos. El rastreo de portadores se hace cuando una pareja planea tener hijos y quiere saber si lleva o no un determinado alelo, ya sea porque hay casos de enfermedad en la familia, o porque pertenece a una población donde la frecuencia de la enfermedad es alta. En las familias afectadas, las pruebas genéticas identifican a los individuos portadores de un gen o de una alteración cromosómica que pueda traer problemas, para ellos o para su descendencia. Rastreo de portadores y aconsejamiento genético son dos medidas que consiguieron disminuir la incidencia de varias enfermedades en algunas comunidades: anemia falciforme entre los afroamericanos, enfermedad de Tay-Sachs entre los judíos ashkenazim, fibrosis quística entre los irlandeses. El rastreo de errores innatos del metabolismo en el recién nacido permite el tratamiento de algunas condiciones, evitando daños y lesiones irreparables. Aproximadamente 5% de los niños nace con problemas congénitos o hereditarios, algunos de los cuales pueden ser previstos mediante tests genéticos de rastreo. A partir de la década de 1960, se verificó la disminución de deficiencias mentales causadas por fenilcetonuria, gracias a la implantación de la prueba de Guthrie, o “prueba del talón” que mide la cantidad de fenilalanina en la sangre del recién nacido. Una nueva técnica, la espectrometría de masa puede detectar 20 trastornos metabólicos en una única prueba. El diagnóstico prenatal se realiza cuando hay algún riesgo o indicio de enfermedad genética en el feto. Por ejemplo, entre la 15a y la 20a semana de embarazo, la concentración elevada de -fetoproteína en la sangre materna indica la posibilidad de anomalías en el feto, como el síndrome de Down. En este caso se le puede aconsejar a la madre una amniocentesis, en la que se extrae una pequeña cantidad de líquido amniótico en el que se estudian las células del feto para confirmar o excluir varios diagnósticos. La madre podrá optar también por una biopsia de vellosidades coriónicas, en la que se analizan células de la placenta (corion). En una fecundación in vitro, el diagnóstico puede preceder a la implantación del embrión. Luego de tres divisiones celulares, cuando el embrión se encuentra en un estado de ocho células, se remueve una para la determinación del sexo y de las características genéticas. El procedimiento no causa daño al embrión. 336 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico TABLA 2. Algunas de las más de 8.000 enfermedades genéticas descriptas En las enfermedades monogénicas la transmisión muestra un patrón claro de herencia, que no siempre es fácil de evidenciar en las enfermedades esporádicas o multifactoriales. Los ejemplos que figuran en la tabla corresponden a mutaciones en el genoma nuclear Tipo de enfermedad Herencia Ejemplo Síndrome de Down Cromosómica Esporádica Síndrome de Turner Síndrome de Klinefelter Fibrosis quística Fenilcetonuria Autosómica recesiva Anemia falciforme Enfermedad de Tay-Sachs Talasemias Características Aparición de los síntomas Grado variable de retraso mental, Nacimiento etcétera Alteraciones en la diferenciación sexual (mujeres) Alteraciones en la diferenciación sexual (hombres) Nacimiento Nacimiento Diversas complicaciones debidas a la secreción de mucus demasiado 1-2 años espeso Deficiencia mental Nacimiento Anemia crónica, infecciones/crisis A partir de dolorosas o hemolíticas los 6 meses Sordera, ceguera, contracturas, espasticidad Anemia severa, deformaciones esqueléticas 3-6 meses A partir de los 6 meses Monogénica Hipercolesterolemia Nivel de colesterol alto, que causa 20-30 años familiar enfermedad coronaria juvenil Autosómica dominante Enfermedad de Huntington Riñón poliquístico Movimientos involuntarios, demencia 35-45 años Quistes en hígado, páncreas, bazo 40-60 años y riñón Alteraciones en la coagulación sanguínea, sangrado excesivo de las heridas y hemorragias internas Degeneración muscular Retraso mental, automutilación Dificultad para respirar Bloqueo de las arterias, ataques cardíacos A partir de 1 año 1-3 años Nacimiento Nacimiento Edad adulta Hemofilias Ligada al X Distrofia muscular de Duchenne Síndrome de Lesch-Nyan Contribución Asma Multifactorial genética Enfermedad variable cardiovascular Fuente: Issues in Human Genetics (EIBE). 337 Biotecnología En el adulto, las pruebas genéticas se hacen en función de evidencias clínicas, para confirmar o descartar un diagnóstico. En otros, para prever si una persona que no presenta síntomas va a desarrollar una enfermedad de la cual ya existen casos en la familia (enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer), o para detectar la presencia de algunas mutaciones génicas asociadas a la predisposición a ciertas enfermedades. Diagnóstico preventivo y predictivo Al poder asociar un gen con una enfermedad, las pruebas genéticas permiten iniciar un tratamiento apropiado, que trata los síntomas o retarda su aparición (hemofilia, distrofia muscular de Becker-Duchenne, fibrosis quística, etc.). Pero no siempre resultan claras cuáles son las ventajas del diagnóstico de una alteración génica para la cual no existe cura ni alivio. En este caso, la existencia de una prueba de diagnóstico puede llevar a elecciones complejas. Consideremos, por ejemplo, la corea de Huntington, una enfermedad de difícil tratamiento, que se manifiesta tardíamente y se transmite de modo autosómico dominante. La decisión de hacer la prueba depende de la persona, pero afecta también a sus parientes, ya que el diagnóstico brinda información sobre la constitución genética de los otros integrantes de la familia. Otro ejemplo es el de la transmisión familiar de la enfermedad de Alzheimer, en que las personas pueden querer saber o no si van a desarrollar los síntomas. Los avances tecnológicos recientes abren el camino para el estudio de enfermedades que resultan de la interacción entre factores genéticos y ambientales. No se trata de prever una enfermedad, sino de calcular cuál es la probabilidad de desarrollarla. La función de un diagnóstico predictivo es darles a las personas la posibilidad de hacer elecciones saludables, modificando su modo de vida y aumentando la vigilancia frente a determinados síntomas. Existen actualmente pruebas para la predisposición a enfermedades cardiovasculares, enfermedad periodontal, predisposición al cáncer de mama, de ovario, de colon y de endometrio. También se están desarrollando ensayos predictivos de respuesta a los medicamentos. La predicción tiene sus limitaciones. Por ejemplo, las mujeres con el gen BRCA1 tienen un 80% de probabilidad de desarrollar la enfermedad a los 65 años, un riesgo considerado alto, pero sin certeza absoluta. Gracias al diagnóstico predictivo, esas mujeres pueden aumentar las medidas preventivas, como mamografías, controles médicos, etc. Pero desde el punto de vista preventivo, no se puede ignorar que la predisposición familiar responde solo 338 Capítulo XVIII. Biotecnología y salud: las pruebas de diagnóstico por el 5-10% de los casos de cáncer, mientras que los 90-95% restantes se deben a mutaciones adquiridas a lo largo de la vida. Se calcula que en 20 años, en los países desarrollados, la expansión del mercado de las pruebas genéticas y de los medicamentos relacionados permitirá los tratamientos de salud presintomáticos. ¿Cuántos serán necesarios? ¿Cuántas personas se sentirán erróneamente seguras con respecto al estilo de vida que adoptaron? La implementación de la medicina predictiva debe ser analizada con mucho criterio por todos los sectores de la sociedad. ¿Quién controlará la aplicación de las pruebas genéticas? ¿Cómo garantizar que la decisión de someterse a una prueba obedezca exclusivamente a una elección personal? ¿Quién tendrá acceso a la información resultante? ¿Será posible formar una subclase de individuos sin seguros de salud ni empleos, discriminados según sus genes? 339 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos 1. LA INDUSTRIA DE MEDICAMENTOS El origen de la farmacia se atribuye a Galeno (siglo II), un médico romano que elaboró numerosas preparaciones medicinales a partir de elementos del mundo natural. Su legado se conservó durante la Edad Media en conventos y monasterios (“farmacia galénica”). En el siglo XVI, el médico y alquimista suizo Paracelso estableció las bases conceptuales de la farmacología, al postular que los agentes curativos del microcosmo (mundo interior) deben buscarse en las sustancias químicas del macrocosmo (mundo exterior). Debemos también a Paracelso otros importantes conceptos: para cada enfermedad hay un remedio específico y cualquier remedio puede ser tóxico, dependiendo de la dosis. A partir del siglo XVIII, el desarrollo de la química contribuyó sustancialmente al progreso de las técnicas preparativas. En los laboratorios farmacéuticos, fundados en la primera mitad del siglo XIX, los métodos artesanales fueron reemplazados por sistemas de producción industrial que se afianzaron rápidamente. En la actualidad, el sector farmacéutico engloba a los fabricantes de varias categorías de medicamentos (marca, medicamentos genéricos y de venta libre) y a las empresas que desarrollan investigaciones o elaboran productos nuevos. La industria sustenta numerosas actividades de investigación y desarrollo de nuevos productos. Solo uno de los 5.000 a 10.000 compuestos estudiados inicialmente llegará al mercado, después de un proceso selectivo que lleva entre 10 y 15 años y cuesta unos 800 millones de dólares. El retorno de la inversión está garantizado por los lucros y por un sistema de patentes válido por 20 años (Figura 1). El control de la producción de medicamentos se encuentra hoy en manos de grandes corporaciones multinacionales que pasan por ciclos de fusión, consolidación y expansión. El sector, extremadamente competitivo y dinámico, absorbe rápidamente los avances científicos y tecnológicos. En la disputa por un mercado en crecimiento, se destacan como empresas líderes: 341 Biotecnología Pfizer, Novartis, Sanofi-Aventis, Merck & Co., Roche, GlaxoSmithKline, AstraZeneca, Johnson & Johnson, Ely Lilly y Abbott. Cada una de estas empresas contabiliza ventas anuales por valores superiores a los US$ 19 mil millones. En 2010 el volumen global de ventas de medicamentos para uso humano alcanzó los US$ 850 mil millones. Las principales categorías terapéuticas son los medicamentos oncológicos, los agentes respiratorios, los reguladores de lípidos, los antidiabéticos y los antipsicóticos. Se estima que en 2014, el volumen global de ventas de medicamentos llegará a mil millones de dólares. En los últimos años, ha disminuido el número de medicamentos nuevos colocados en el mercado, hubo un aumento del número de compuestos en ensayos preclínicos o clínicos. La llegada de nuevas tecnologías robóticas, informáticas y biológicas afecta a la estructura del sector, que podrá reorganizarse en los próximos años. 2. LOS PRINCIPIOS ACTIVOS DE LAS PLANTAS El caso de la aspirina En el siglo XVIII, pociones preparadas con la corteza del sauce blanco (Salix alba), eran utilizadas para calmar el dolor y bajar la fiebre. El principio activo era la salicilina, y de sus cristales se extrajo el ácido salicílico, un compuesto de efecto poderoso cuya fórmula química fue develada rápidamente. En 1874, se fundó la primera empresa que sintetizó ácido salicílico para comercializarlo como un producto para aliviar el dolor. El ácido salicílico era muy amargo y causaba problemas estomacales. Por acetilación, Felix Hoffman obtuvo el ácido acetilsalicílico, un compuesto con menos efectos colaterales con el nombre de aspirina, vendido por Bayer a partir de 1900 (Figura 2). Actualmente se venden aproximadamente 10 mil millones de comprimidos por año. A pesar de la difusión alcanzada, el modo de acción de la aspirina permaneció desconocido por mucho tiempo. Esto no impidió que en 1969 acompañara a los astronautas de la Apolo II durante el primer vuelo a la luna. En 1971 se descubrió que el ácido acetilsalicílico se une a ciertas enzimas, dificultando la síntesis de prostaglandinas. Este grupo de sustancias, que aumenta la sensibilidad de los nervios al dolor, es producido naturalmente durante las infecciones o cuando hay heridas. Al impedir la agregación de 342 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos FIGURA 1. Etapas del desarrollo de un medicamento 5.000 compuestos 0 2 Descubrimiento Fase preclínica 5 compuestos Ensayos clínicos 4 6 8 10 12 1 compuesto Procedimientos administrativos 14 16 Fase IV: Vigilancia farmacológica 18 20 22 24 Años Vencimiento de la patente Genéricos Inicio de las investigaciones. Estudios de laboratorios y ensayos con animales para evaluar la actividad biológica y la seguridad Pedido de patente (3,5 a 4,5 años) Pedido de aprobación para iniciar los ensayos en seres humanos Fase I: Acompañamiento farmacocinético y primeros estudios sobre seguridad y dosaje en 20 a 100 voluntarios sanos (1 año) Fase II: Eficiencia y efectos colaterales en 100 a 500 pacientes voluntarios (2 años) Fase III: Monitoreo de las reacciones al uso prolongado del medicamento en 1.000 a 5.000 pacientes voluntarios (3 años) Proceso de aprobación del nuevo medicamento (2,5 años) FIGURA 2. Fórmula de la aspirina La acetilación del ácido salicílico produce un compuesto con menos efectos colaterales Ácido salicílico Ácido acetilsalicílico 343 Biotecnología las plaquetas, la aspirina también ayuda a prevenir problemas de coagulación sanguínea y, eventualmente, los ataques cardíacos. Los fitoterápicos Muchas de las 20.000 especies de plantas medicinales conocidas representan la única fuente de tratamiento accesible para la población más pobre del planeta. Por otro lado, una parte de la población es adepta de las medicinas alternativas y, especialmente, del consumo de medicamentos fitoterápicos tradicionales, que considera más suaves y con menos efectos colaterales. En esta línea de pensamiento, lo “natural” es percibido como bueno y se admite que el extracto vegetal (principio biológicamente activo) es más eficiente que alguna de sus partes. Los fitoterápicos son productos relativamente baratos, de venta libre y con pocas oportunidades de patentes. Su eficiencia varía con las condiciones de cultivo de las plantas, ya que la síntesis de las sustancias activas depende del suelo, de la estación e, inclusive, del momento del día. Hay pocos estudios en gran escala sobre las plantas medicinales y poco se sabe sobre sus efectos secundarios. Además, no siempre han pasado por controles de calidad estrictos. La promoción de la medicina tradicional por la OMS, enunciada en la declaración de Alma-Ata (1978) sobre la atención primaria de la salud, marcó una mudanza de actitud en relación a los fitoterápicos, cuyo uso aumentó significativamente a partir de 1990. El mercado de fitoterápicos entró en una nueva etapa a partir de la publicación de un manual relativo al control de calidad de los materiales extraídos de las plantas medicinales (OMS, 1998) y el establecimiento de directrices generales sobre la metodología de investigación y evaluación de las medicinas tradicionales (OMS, 2000). Se estima que el volumen de ventas actual sea de 62 mil millones de dólares por año. Las nuevas tecnologías Las grandes empresas de productos farmacéuticos se perfilan en una línea totalmente diferente. El descubrimiento reciente de algunas sustancias antitumorales de origen vegetal (taxol, vinblastina, vincristina, etc.) estimuló la búsqueda de principios activos en plantas, animales y microorganismos, especialmente en regiones de gran biodiversidad. Las opiniones no son unánimes en relación a posibles y eventuales des344 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos cubrimientos de moléculas con aplicaciones terapéuticas. Algunas empresas farmacéuticas consideran que, en casi doscientos años de prospección, ya se habrían descubierto prácticamente todos los principios activos de interés, y prefieren pasar al diseño de medicamentos por química combinatorial y modelos computacionales. Otras ponderan que, por su diversidad, hay que buscar nuevas moléculas en los microorganismos y en las plantas, y que aún existirían numerosas fuentes de principios activos desconocidos en la flora tan diversa como mal estudiada de muchas regiones. En las últimas décadas hubo cambios en el campo de la investigación de los productos naturales, gracias a la disponibilidad de tecnologías basadas en la robótica y en la automatización de los ensayos biológicos. El análisis de las sustancias químicas presentes en una planta o sus extractos (alcaloides, terpenos, esteroides, glucósidos, etc.) se realiza por técnicas analíticas automatizadas, y los datos se almacenan en bancos de datos (Chemical Fingerprint). La robotización permite realizar ensayos de actividad biológica de hasta 200.000 productos por día (HTS, del inglés, high throughput systems) y los estudios quimioinformáticos establecen correlaciones estadísticas entre estructura y actividad. Después de identificado un principio activo, sus características farmacológicas pueden ser mejoradas por transformaciones químicas, con el objetivo de reemplazar una molécula natural por otra sintética equivalente o ligeramente modificada. La necesidad de un marco legal En los países que cuentan con una biodiversidad importante, se discute cómo hacer los estudios de bioprospección y cuál es el rol que deberían desempeñar las instituciones nacionales o extranjeras y las empresas farmacéuticas. El riesgo de biopiratería es real. En el siglo XIX, el hevea o árbol del caucho fue sacado subrepticiamente de la Amazonia y plantado en Malasia. Brasil importa una versión sintética del catopril, un medicamento descubierto por científicos brasileños en el veneno de la cobra Bothrops. A partir de 1991, en Costa Rica, el InBio (Instituto Nacional de Biodiversidad) negoció acuerdos de bioprospección, primero con Merck por un millón de dólares, y más tarde con otras empresas farmacéuticas. Estos acuerdos mejoraron la capacitación del país desde varios puntos de vista: científico, tecnológico e institucional. Sin embargo, a pesar de haber encontrado varias moléculas promisorias, hasta el momento ninguna de ellas generó un nuevo medicamento. 345 Biotecnología Aproximadamente en la misma época se inició un programa de prospección de agentes bioactivos en tierras áridas de América Latina. El programa incluyó instituciones norteamericanas (Universidad de Arizona, National Institutes of Health, NIH, United States Department of Agriculture, USDA), argentinas (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, INTA, Universidad de la Patagonia), chilenas (Universidad Pontificia de Chile) y mexicanas (Universidad Nacional Autónoma de México). Los resultados de las investigaciones desarrolladas durante ocho años están almacenados en un banco de datos. Las numerosas críticas que recibieron estas y otras iniciativas, como, por ejemplo, el convenio Novartis-Fundación Bio-Amazonia, muestran la necesidad de establecer un marco legal para la protección de la biodiversidad y de trabajar de acuerdo con la Convención de la Diversidad Biológica. 3. LOS ANTIBIÓTICOS El caso de la penicilina Hasta la Segunda Guerra Mundial las armas disponibles para combatir las infecciones se limitaban a unas pocas vacunas y antitoxinas. El Salvarsan, descubierto por Paul Ehrlich (1910) y comercializado por Hoechst para el tratamiento de la sífilis, era un derivado del arsénico. Además de tóxico era inyectable, por lo tanto difícil de aplicar en una época en que no existían las jeringas. A fines de la década de 1930, los derivados de la sulfonamida o “sulfas” tuvieron más éxito como inhibidores del crecimiento microbiano. En 1928, el bacteriólogo Alexander Fleming (1928) observó en una placa de Petri, previamente sembrada con estafilococos, la ausencia de crecimiento bacteriano alrededor de un hongo contaminante, identificado como Penicillium notatum. Después de aislarlo y cultivarlo, Fleming consiguió extraer una sustancia activa y probó su acción bactericida en animales. Esta sustancia, denominada penicilina, resultó ser un antiséptico eficaz que podía aplicarse o inyectarse en dosis altas, porque no era tóxico ni irritante. Este resultado no tuvo ninguna repercusión en la comunidad científica. En 1940, en la Universidad de Oxford, los investigadores H. Florey y E. Chain obtuvieron en el laboratorio una sal sódica de penicilina de bajo grado de pureza (Figura 3). En los primeros ensayos, la penicilina mostró un efecto extraordinario, pero la cantidad disponible aún era pequeña para 346 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos FIGURA 3. Fórmula de la penicilina En la fórmula de la penicilina se puede observar un anillo -lactámico y una cadena lateral (R). Algunas bacterias sintetizan -lactamasas, enzimas que al destruir el anillo desactivan a las penicilinas naturales. Modificando la cadena lateral se obtuvieron penicilinas semisintéticas, resistentes a esas enzimas su uso terapéutico. Florey y Chain se mudaron entonces en 1941 a Peoria (Illinois, Estados Unidos), donde la industria farmacéutica (en particular las empresas Pfizer y Merck) se comprometió a producir penicilina en gran escala. Dos factores fueron decisivos. El primero fue el descubrimiento, en un melón podrido, de una cepa de Penicillium chrysogenum capaz de producir 200 veces más penicilina que la cepa original. El segundo fue el aumento de la productividad, que pasó de 50 mg/l a 50-100g/l, al sustituir el método tradicional de cultivo en frascos por el cultivo sumergido en biorreactores con capacidad de 40.000 a 200.000 litros. En 1944, las fuerzas aliadas dispusieron de penicilina en cantidad suficiente para tratar a los soldados heridos durante la invasión a Europa. Los límites al uso de los antibióticos Luego del éxito de la penicilina, comenzó la búsqueda de otros antibióticos entre los microbios del suelo. Este ambiente es muy competitivo y la síntesis de un antibiótico confiere una ventaja selectiva al microorganismo productor. En pocos años se descubrieron la actinomicina, la neomicina y 347 Biotecnología la estreptomicina, que fue el primer antibiótico eficiente para el tratamiento de la tuberculosis. Un poco más tarde aparecieron en el mercado los antibióticos de amplio espectro, como el cloranfenicol, la aureomicina y la terramicina. Paralelamente, la industria respondió con cambios tecnológicos, mejorando los métodos de extracción y de purificación, e investigando formas moleculares alternativas que faciliten su aplicación clínica. La entrada en el mercado de nuevos productos (eritromicina, vancomicina, ampicilina, meticilina, cefalosporinas) posibilitó la cura de enfermos y heridos para los cuales, sesenta años atrás, la medicina no tenía tratamiento. Sin embargo, el tiempo mostró el otro lado de la moneda. Así como en el suelo los microorganismos encuentran formas de protección contra los antibióticos producidos por otras especies, el uso clínico indiscriminado de antibióticos favoreció la aparición de cepas resistentes que se difundieron rápidamente. Los antibióticos actúan de diversos modos, pero siempre afectando unas pocas funciones vitales de la célula, como la síntesis de la pared celular, del ADN, del ARN, de las proteínas o del ácido fólico. A cada blanco le corresponde una forma de resistencia. Por ejemplo, la síntesis de -lactamasas desactiva a las penicilinas y las cefalosporinas, y una modificación del sitio blanco en el ribosoma permite escapar de la inhibición de la síntesis de proteínas causada por la estreptomicina. Hay otros casos, como la resistencia a tetraciclina o a múltiples drogas, en los que una alteración en la permeabilidad celular provoca la extrusión del antibiótico hacia afuera de la célula. La diseminación de la resistencia a drogas también se produce de forma horizontal, por transferencia de plásmidos a otras bacterias. Para mantener alguna ventaja sobre las bacterias, en esta carrera sin fin entre el uso de antibióticos y la aparición de microorganismos resistentes, habrá que continuar desarrollando nuevos productos. La necesidad de innovación Los principales tipos de antibióticos que utilizamos fueron descubiertos entre 1940 y 1962. Llevó 30 años la llegada al mercado de las oxazolidinonas, una nueva clase de moléculas que bloquean la síntesis de proteínas en bacterias. En realidad, aunque haya muchas sustancias con propiedades antibióticas, pocas tienen interés desde el punto de vista clínico. Al encontrar dificultades para descubrir moléculas nuevas y para evitar la aparición de resistencia, la 348 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos industria invirtió en las llamadas me-too drugs, que son las mismas sustancias, pero con pequeñas modificaciones químicas. Mientras tanto, como muchas patentes están vencidas, llegaron al mercado las formas genéricas de algunos de los antibióticos más difundidos, como el Augmentin (amoxacilina y clavulanato) o el Cipro (ciproflaxin). En los últimos años muchas empresas abandonaron este mercado para atender al sector bastante más lucrativo de las enfermedades crónicas. Actualmente, solo cinco de las mayores continúan produciendo antibióticos: Abbott, Novartis, Astra-Zeneca, Merck, Pfizer y Johnson & Johnson. El espacio vacante fue ocupado por empresas nuevas, como Basilea Pharmaceutica que lanzó el Ceftobiprole, una cefalosporina de quinta generación, eficaz contra los MRSA (del inglés metacillin-resistent Staphylococcus aureus) y otros supermicrobios. Los antibióticos representan el 65% del mercado de medicamentos antiinfecciosos, que incluye también los antivirales y antifúngicos. Se estima que llegará a US$ 40 mil millones en 2015. Una de las estrategias para el desarrollo de nuevos antibióticos es la búsqueda de compuestos o extractos naturales con actividad inhibitoria del crecimiento de microorganismos, haciendo los ensayos biológicos a alta velocidad en sistemas robotizados (HTS). Otra es estudiar los péptidos naturales con acción antibiótica producidos por microorganismos, plantas y animales, tanto terrestres como marinos, e incrementar su eficiencia mediante alteraciones de su estructura molecular. La construcción de péptidos sintéticos por química combinatorial también es una alternativa interesante. Una tercera opción sería encontrar en el metabolismo del hospedero algún blanco que impida la infección. Los nuevos métodos in silico permiten investigar las estructuras moleculares relacionadas con una actividad biológica determinada y, también, utilizar los datos genómicos para identificar un blanco medicamentoso. El éxito en el diseño de productos nuevos dependerá de la genómica comparativa y funcional de los microorganismos, una disciplina capaz de esclarecer la función de los genes y de mostrar cuáles son los blancos que podrían atacarse (Tabla 1). Se espera que los antibióticos basados en la genómica estén disponibles en la próxima década, porque el camino de la genómica ya está siendo transitado por algunas empresas biotecnológicas. Sin embargo, resulta difícil para ellas enfrentar la etapa de ensayos clínicos, que demanda inversiones estimadas en US$150-200 millones, valores que solo las grandes empresas farmacéuticas pueden cubrir. 349 Biotecnología TABLA 1. Entrada de los antibióticos (productos naturales) y de los antibacterianos (sintéticos) en el mercado Fecha 1936 1940 1949 1950 1952 1962 2000 2003 2005 2007 Antibióticos y antibacterianos Sulfonamidas (sulfas) -lactámicos Cloranfenicol, tetraciclinas Aminoglicósidos Macrólidos Quinolonas, estreptograminas Oxazolidinonas Lipopéptidos Glicilglicinas Mutilinas 4. LAS PRIMERAS MOLÉCULAS TERAPÉUTICAS El caso de la insulina La insulina es una hormona producida en el páncreas, que regula el metabolismo de la glucosa en el cuerpo (Figura 4, A). Cuando el páncreas no produce suficiente insulina, el nivel de glucosa en la sangre aumenta. El exceso es eliminado en la orina, arrastrando mucha agua. Los síntomas incluyen sed excesiva, pérdida de peso y peligro de deshidratación. Las complicaciones resultantes incluyen nefropatías, retinopatías, neuropatías y enfermedades cardiovasculares. Este es el cuadro de la diabetes mellitus, una enfermedad conocida desde hace siglos y que hoy puede ser tratada. En el 5 al 10% de los casos la falta de insulina se debe a la destrucción de las células del páncreas por el sistema inmune. Esta forma de la enfermedad afecta a niños y adolescentes (diabetes de tipo 1). En el resto de los casos, las personas precisan más insulina de la que producen (diabetes de tipo 2). Esta forma generalmente se manifiesta en personas mayores, con sobrepeso, inactivas, con una historia familiar que indica predisposición, episodios ante350 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos riores en gestaciones, etc. Además de otros medicamentos y eventualmente de insulina, el tratamiento incluye dieta y ejercicios moderados. En 1920, F. Banting comprobó el efecto hipoglucemiante de extractos de páncreas de perro. Poco después comenzaron a ser comercializadas las insulinas extraídas del páncreas de vacas y cerdos. Estas insulinas animales salvaron numerosas vidas pero causaban reacciones alérgicas, al haber diferencias con los aminoácidos correspondientes a la insulina humana. Desde el punto de vista de la estructura química, las diferencias son pequeñas. La molécula de insulina humana consta de dos cadenas de aminoácidos, unidas entre sí por puentes disulfuro. La insulina bovina difiere de la humana en las posiciones 8 y 10 de la cadena A y en la posición 30 de la cadena B; la insulina porcina solo difiere en la posición 30 de la cadena B. El tamaño de la molécula de insulina hace que la síntesis química sea económicamente inviable. Sin embargo, sustituyendo un aminoácido (alanina) por otro (treonina) en la extremidad de una de las cadenas de la insulina porcina, se obtiene una molécula con la secuencia de la insulina humana. Esta insulina semisintética representó un progreso en relación a las insulinas animales, pero aún quedaban por resolver algunos problemas relacionados con la obtención de la materia prima y el tratamiento de residuos. La tecnología del ADN recombinante revolucionó la producción de insulina humana, permitiendo su síntesis en microorganismos genéticamente modificados: primero en Escherichia coli (Eli-Lilly, 1982) y más tarde en levaduras (Novo, 1987). Con la insulina recombinante, un producto más estable y de mejor calidad que los existentes, la biotecnología obtuvo uno de sus primeros e indiscutibles éxitos (Figura 4, B y C). La sustitución del producto natural Ya sea por la influencia de factores genéticos, ambientales o culturales, o por la existencia de mejores métodos de diagnóstico, millones de personas en el mundo entero dependen hoy de inyecciones regulares de insulina. La incidencia de diabetes de tipo 2 está aumentando en niños y adolescentes, en algunos grupos étnicos que adoptaron modos de vida y de alimentación diferentes y, también, en las poblaciones urbanas de inmigrantes. En 2025, el número de diabéticos podría llegar a 300 millones. Las insulinas humanas recombinante y semisintética reemplazan a las insulinas mixtas (bovina, porcina) que aún permanecen en el mercado, pero a un precio menor. Para el tratamiento, resulta de gran importancia el grado de pureza y el tiempo de reacción (rápido, intermedio o largo). En los 351 Biotecnología FIGURA 4. Estructura y síntesis de la insulina A. La molécula de insulina humana Reemplazando al aminoácido alanina por treonina en esa posición, se obtiene una molécula con la misma secuencia de la insulina humana + Cadena B + Cadena A B. La síntesis in vivo de la insulina en las células pancreáticas B A C a r T du n ó i c e R n ó i c o mde l a ea s ñlyu nó n i ent e r asc l adenasA yB a u c é l o M e ru p a o s r c B A C e R n de ó i c o m ac l adena C n i o r Ps na i l u B A n Is na i l u AR N m de i ns na i l u próximos años, el mercado pasará por reformulaciones, al expirar algunas patentes, y al llegar al mercado insulinas no inyectables, administradas oralmente o por inhalación. Actualmente, la producción de insulina se concentra en tres grandes conglomerados farmacéuticos: Eli-Lilly, Novo-Nordisk y Aventis (una fusión de Hoechst y Rhône Poulenc). En Brasil, la Novo-Nordisk absorbió recientemente el área de producción de Biobrás, una empresa nacional que 352 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos FIGURA 4. Continuación C. La síntesis en Escherichia coli (1982) Por tratarse de un organismo procarionte, la bacteria no puede realizar las modificaciones postraduccionales de eucariontes, por eso hay que sintetizar cada una de las cadenas por separado y asociarlas posteriormente, o bien producir proinsulina y tratarla enzimáticamente Síntesis de la cadena A Inserción en un plásmido y clonado en E. coli Extracción de la cadena proteica A A A Síntesis de la cadena B Inserción en un plásmido y clonado en E. coli Extracción de la cadena proteica B B Unión química de las cadenas A y B B Insulina durante más de 20 años abasteció de insulina a gran parte del mercado latinoamericano. Una firma nueva, Biomm, conservó la patente para la insulina humana, desarrollada anteriormente por Biobrás, y existen proyectos para reiniciar la producción nacional de insulina (Biomm, União Química, Farmanguinhos). En Argentina, la insulina humana recombinante está siendo producida por los laboratorios Denver Farma. 5. LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES Las bases tecnológicas Las proteínas terapéuticas tienen un tamaño 100 veces mayor que el de las moléculas presentes en los medicamentos convencionales. Los métodos extractivos suministran cantidades mínimas que no llegarían nunca a satisfacer la demanda del mercado, de modo que la producción de esas proteínas sería prácticamente imposible sin la tecnología del ADN recombinante. 353 Biotecnología El sector de medicamentos asimiló rápidamente el progreso tecnológico. En la década de 1980 se obtuvieron las primeras proteínas terapéuticas (insulina, interferón), a partir de bacterias y levaduras transformadas genéticamente y cultivadas en biorreactores. Más tarde, estas fueron sustituidas por células de mamífero. Así se consiguieron proteínas de excelente calidad, pero con costos de producción muy elevados. Con el objetivo de aumentar la productividad y disminuir los costos, se obtuvieron plantas y animales transgénicos (vacas, cabras, ovejas, etc.) que producen una centena de proteínas de tipo recombinante, muchas de las cuales ya se encuentran en la fase de ensayos clínicos. El primer anticoagulante extraído de la leche de una cabra transgénica entró en el mercado en 2009 (Atryn, de GTC Biotherapeutics). La hostilidad de la sociedad hacia las plantas y alimentos transgénicos no se extiende a los animales transgénicos ni a los medicamentos recombinantes. El principio de equivalencia, contencioso en el sector de agroalimentos, está totalmente aceptado en relación a los nuevos medicamentos. Una actitud contradictoria que llama a la reflexión. Los productos y sus usos Las proteínas terapéuticas o biofármacos cumplen diversas funciones (Tabla 2). Algunas reemplazan moléculas naturales (hormonas, interferones, factores estimuladores del crecimiento celular, factores de coagulación sanguínea). Otras son productos especialmente diseñados para cumplir una función medicamentosa (trombolíticos como el tPA o factor activador de plasminógeno, estreptoquinasa, uroquinasa, anticuerpos monoclonales y antígenos para vacunas). Se usan fundamentalmente en las áreas médicas de hematología, oncología, diabetes y endocrinología, artritis, inflamación, enfermedades inmunes y enfermedades genéticas lisosómicas (Gaucher, Hurler, Fabry, Pompe). La industria biotecnológica Se estima que para 2014 el mercado global de productos biotecnológicos será de 103 mil millones de dólares, un valor que representa algo más de la décima parte del mercado farmacéutico mundial. Más de trescientas proteínas aprobadas, y muchas otras en ensayos clínicos, muestran un mercado en crecimiento cuyo sector más dinámico es el de los anticuerpos monoclonales, con una previsión de 79.000 millones de dólares, en 2015. 354 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos TABLA 2. Proteínas recombinantes de interés médico Producto Factores de coagulación Factor VIII Factor IX Factor VIIa Anticoagulantes Activador del plasminógeno tisular Activador del plasminógeno tisular Hirudina Hormonas Insulina Hormona de crecimiento Levaduras E. coli E. coli Diabetes mellitus Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, síndrome de Turner Infertilidad, anovulación y superovulación Osteoporosis Reproducción asistida Detección/tratamiento de cáncer de tiroides Ciertas formas de infertilidad Enfermedad de Paget Hipoglucemia Cultivo de células de mamífero E. coli Levaduras Infarto de miocardio Infarto de miocardio Trombocitopenia y prevención de trombosis Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Hemofilia A Hemofilia B Ciertas formas de hemofilia Sistema de producción Indicación terapéutica Folículo-estimulante Paratiroidea Gonadotrofina coriónica Tirotrofina Luteinizante Calcitonina Glucagon Cultivo de células de mamífero E. coli Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero E. coli Levaduras 355 Biotecnología TABLA 2. Continuación... Producto Factores hematopoyéticos Eritropoyetina (EPO) Factor estimulante de colonias de granulocitos/ macrófagos (GM-CSF) Interferón e interleuquinas Interferón alfa (IFN alfa) Interferón beta (IFN beta) Interferón gamma (IFN gamma 1b) Interleuquina 2 (IL-2) Vacunas Antihepatitis B Antihepatitis A Antienfermedad de Lyme Anticuerpos monoclonales recombinantes Anti-IgE (recombinante) Anti-TNF (recombinante) Anti-IL2 Producto Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Sistema de producción Asma Artritis reumatoidea Prevención del rechazo agudo de trasplante de riñón Indicación terapéutica Levaduras Levaduras E. coli Inmunización contra la hepatitis B Inmunización contra la hepatitis A Inmunización contra la enfermedad de Lyme E. coli Cultivo de células de mamífero E. coli E. coli Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer Esclerosis múltiple Enfermedad granulomatosa crónica Cáncer de riñón Cultivo de células de mamífero E. coli Anemia Neutropenia, trasplante autólogo de médula Sistema de producción Indicación terapéutica Otros productos recombinantes Proteína morfogénica del hueso-2 Cultivo de células de mamífero Fractura de tibia 356 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos TABLA 2 ... Producto Galactosidasa Iaronidasa Proteína C Beta-glucocerebrosidasa DNAsa Sistema de producción Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero Cultivo de células de mamífero E. coli Cultivo de células de mamífero Indicación terapéutica Enfermedad de Fabry (deficiencia en alfa-galactosidasa) Mucopolisacaridosis Sepsis severa Enfermedad de Gaucher Fibrosis quística Fuente: Nature Biotechnology, vol. 21, Nº 8, 2003, en <http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/07_a.php>. Con el progreso de los estudios genómicos, en los próximos años más biofármacos serán descubiertos y patentados. Los inmensos bancos de datos y las técnicas de selección asistidas por computadora permitirán disminuir el tiempo necesario para los estudios experimentales. Varios de los biofármacos líderes de ventas son anticuerpos terapéuticos (Tabla 3). La mayoría se destina a la oncología o al tratamiento de la artritis y de otras enfermedades inmunes e inflamatorias. Existe por lo menos uno que permite la obtención de imágenes, y otro en que la molécula se encuentra acoplada a una toxina que destruye células tumorales. Casi una centena se encuentra en la fase final del proceso de aprobación. En América Latina existe una industria farmacéutica formada por empresas extranjeras y nacionales que fabrican medicamentos para consumo interno y para exportación. Empresas nacionales producen biofármacos en Argentina, Cuba, México, y en menor grado en Brasil. Los principales productos biotecnológicos son los anticoagulantes (eritropoyetina), las hormonas, los interferones y y los factores estimuladores del crecimiento celular. Argentina cuenta con un sector farmacéutico sólido y competitivo. Empresas como Biosidus, Pablo Cassará, Amega Biotech, Chemo (ELGA Romikin) producen localmente varias proteínas recombinantes que exportan a diversos países de Asia, Oriente y América Latina. Biosidus obtuvo con éxito el primer “tambo farmacéutico” de vacas transgénicas productoras de hormona de crecimiento, que sin duda le garantizará una posición destacada 357 Biotecnología TABLA 3. Las 15 proteínas terapéuticas líderes, que representan el 74% del mercado global de ventas de productos biotecnológicos Nombre genérico y eritropoyetina Nombre comercial Epogen, Epogin, Procrit, Eprex, NeoRecormon, Aranesp PEG Intron, Pegasys Avonex, Rebif, Betaseron Novulin, Humalin, Humalog Neupogen, Neulasta Empresas Amgen, J & J, Roche, Kirin, Sankyo Schering Plough, Roche, Biogen, Idec, Serono, Schering AG, Chiron Novo Nordisk, Lilly Amgen, Roche, Schering y interferón Insulina humana Factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) Rituximab Etarnecept Infliximab Trastuzumab Hormona de crecimiento Palivizumab Hormona folículoestimulante FSH Glucocerebrosidase Adalimuzab Factor VIII Toxina botulínica Bevacizumab Rituxan Enbrel Remicade Herceptin Serostim, Saizen, Humatrope, Protopin, Neutropin Synagis Gonal F, Folistim Cerezyme, Ceradase Humira Novo Seven Botox Avastin Roche Amgen, Wyeth J&J Roche Serono, Biogen Idec, Roche, Novo Nordisk, Akzo Nobel, Lilly MedImmune Serono, Akzo Nobel Genzyme Abbott Novo Nordisk Allergan Genentech, Roche 358 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos en el sector productivo. El laboratorio Pablo Cassará obtuvo recientemente una enzima recombinante capaz de reparar las lesiones causadas por la exposición a los rayos X. Ambas empresas distribuyen sus productos en Brasil, donde solo el Instituto Butantan produce el anticoagulante eritropoyetina. También comercializa proteínas recombinantes el grupo Amega Biotech. En Brasil, las empresas públicas (Farmanguinhos, Instituto Butantan) tienen un papel determinante en la producción de medicamentos, destacándose en la producción de retrovirales y eritropoyetina. Sin embargo, aún es necesario importar biofármacos, algunos de los cuales son distribuidos por el Sistema Único de Salud (eritropoyetina, inmunoglucerasa, infliximab, interferón, somatropina recombinante humana y, recientemente, rituximab). Los acuerdos de transferencia de tecnología para 25 productos, entre laboratorios nacionales (públicos y privados) y extranjeros, pueden revertir la situación. La empresa mexicana ProBioMed ha desarrollado, junto con el sector universitario, una decena de proteínas recombinantes (anticoagulantes, interferones, factores estimuladores del crecimiento celular). Su estrategia contempla extender la exportación de sus productos a otros países de América Central y del Sur. Cuba ha registrado numerosos productos biotecnológicos, desarrollados por centros de investigación (Centro de Inmunología Molecular, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Centro Nacional de Biopreparados e Instituto Finlay) y comercializados por empresas farmacéuticas asociadas (Heber Biotec, CIMAB, etc.). Actualmente, Cuba produce 11 vacunas, más de 40 moléculas terapéuticas y varios sistemas de inmunodiagnóstico. Estos productos le dieron aproximadamente 900 patentes en el exterior y son exportados a 40 países. Así como el níquel, el tabaco o el azúcar, la biotecnología es uno de los principales productos de exportación de la isla. 6. LOS MEDICAMENTOS PERSONALIZADOS La farmacogenómica El mapeo del genoma fue el primer paso para el desarrollo de nuevos productos y acciones terapéuticas, un terreno donde se afirma la farmacogenómica, una disciplina nueva que pretende identificar las diferencias genéticas asociadas a diversas enfermedades. Dado que los seres humanos comparten el 99,9% del genoma, las variaciones entre ellos deben buscarse en el 0,1% restante, es decir entre los 30 359 Biotecnología millones de polimorfismos de un único nucleótido o SNP (del inglés, single nucleotide polymorphisms). Se trata de variaciones de una base distribuidas a lo largo del genoma, a razón de aproximadamente 1 cada 1.000 nucleótidos. Los más interesantes ocurren dentro de un gen o en una región reguladora. El estudio de cada uno de esos SNP está más allá de las capacidades tecnológicas actuales, pero sabiendo que dos puntos que se encuentran muy próximos en el cromosoma tienden a transmitirse juntos, se puede dividir el cromosoma en bloques de aproximadamente 10.000 bases (haplotipos) y caracterizarlos para algunos de los SNP de cada bloque (Figura 5). Este es el objetivo del International HapMap, concluido recientemente y basado en el genoma de personas de origen europeo, asiático y africano. La importancia del mapeo del genoma humano fue percibida claramente en su momento por las empresas farmacéuticas. Antes de completarse la secuenciación, algunas de las grandes empresas farmacéuticas (GlaxoWellcome, Novartis) comenzaron a compilar información sobre los genes que podían asociarse a enfermedades y a localizar SNP dentro de algunos genes previamente seleccionados. En 1999, la empresa deCODE obtuvo de Islandia, por 200 millones de dólares, la exclusividad para elaborar un gigantesco banco de datos con los registros de salud, genealogías y los perfiles de ADN de sus habitantes. Poblada hace 1.000 años por los vikingos, y con poco contacto con otras poblaciones, Islandia cuenta con una población homogénea de 270.000 habitantes, especialmente interesante para este tipo de estudios. El proyecto suscitó controversia. El objetivo del acuerdo entre deCODE y Hoffmann-La Roche era la identificación de los genes responsables por varias enfermedades. Si los resultados fueran positivos, los habitantes de Islandia tendrían derecho al acceso gratuito, por cinco años, a los medicamentos desarrollados. Debido a problemas éticos y legales, la empresa enfrentó algunas dificultades en la construcción de su banco de datos de 140.000 islandeses. Pese a haber descubierto una decena de blancos medicamentosos, entre ellos proteínas relacionadas con cardiopatías, osteoporosis y esquizofrenia, los resultados no fueron considerados satisfactorios por los inversores. En bancarrota, la empresa fue vendida en 2009 para Saga Investments LLC e Illumina. Hoy, la nueva deCode, llamada deCODEme, comercializa pruebas diagnósticas y estudios genómicos. Debido a problemas legales, los datos y las muestras biológicas no pudieron ser vendidos y permanecen en Islandia. Existen otros proyectos en la misma línea de investigación, como Estonian Genome (Estonia), Galileo Genomics (Canadá), Oxagen (Inglaterra), Rockefeller University (Micronesia), UK Bank (Inglaterra). Wellcome Trust 360 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos FIGURA 5. Los fundamentos del proyecto internacional HapMap De tanto en tanto se encuentran SNP que son variaciones de una base en la secuencia del ADN. Bastan dos SNP en la secuencia de una de las cadenas de tres individuos, para diferenciarlos Individuo 1 ...A...C...A...T...G... ...T...G...T...A...C... Individuo 2 ...A...C...A...G...G... ...T...G...T...C...C... Individuo 3 ...G...C...A...T...G... ...C...G...T...A...C... Case Control Consortium encontró 24 asociaciones génicas a siete enfermedades (Crohn, enfermedad cardiovascular, diabetes 1 y 2, hipertensión, artritis reumatoide y trastorno bipolar). La farmacogenética Antes de llegar al mercado, los medicamentos pasan por varias fases de estudios clínicos. No todas las personas reaccionan del mismo modo a un medicamento, de modo que este puede resultar eficaz para unos y tóxico para otros. Cuando ocurren en una frecuencia baja, las reacciones a un medicamento solo llegan a ser detectadas a partir de la fase III de los estudios clínicos, que comprenden entre 1.000 y 5.000 voluntarios. A veces los efectos adversos solo se descubren en la fase IV, de vigilancia farmacológica. La farmacogenética es una disciplina que investiga cuáles son las diferencias genéticas dentro de una población que permitan prever diferentes respuestas a un medicamento. Las reacciones adversas son temidas por los pacientes, por los médicos y por la industria farmacéutica, que se protege mediante prospectos cuidadosamente elaborados. Solo en Estados Unidos, las reacciones adversas causan 100.000 muertes y dos millones de internaciones por año. Por ejemplo, se sabe que alrededor del 60% de los medicamentos son degradados por una familia de enzimas (citocromo P450). Dependiendo de sus características enzimáticas individuales, algunas personas los metabolizan 361 Biotecnología rápidamente, y otras no. Sabiendo a cuál de los dos grupos pertenece un paciente, se puede determinar qué dosis del medicamento deberá usarse para minimizar los efectos adversos. Asociando los SNP y las respuestas diferenciales a medicamentos, se puede dividir a la población en subgrupos y ofrecerles un tratamiento “personalizado”. Actualmente, antes de iniciar un tratamiento de cáncer de mama con la herceptina, se realiza una prueba genética en la paciente para saber si el medicamento se ajusta o no a su caso. En pacientes VIH positivos, se busca la presencia del alelo HLA-B*5701 antes de iniciar un tratamiento con abacavir, porque los portadores de ese alelo pueden ser hipersensitivos al medicamento. La farmacogenética dará a los pacientes más posibilidades de recibir la medicación adecuada y en la dosis correcta. Por otro lado, las empresas farmacéuticas podrán elegir sus voluntarios para los ensayos clínicos en el subgrupo apropiado, evitando que un producto nuevo sea descartado por falta de la respuesta adecuada. En el futuro, en vez de un único producto campeón de ventas, una empresa podrá ofrecer medicamentos diferentes, respondiendo cada uno a las expectativas de un tipo de consumidor. 7. EL COSTO DE LOS NUEVOS MEDICAMENTOS Se estima que solo el 3% de los medicamentos desarrollados entre 1975 y 1999 fueron destinados al tratamiento de enfermedades tropicales, y que de estos, la mitad fue incentivada por la Organización Mundial de la Salud. Si bien hay algunas empresas farmacéuticas que dedican algo de investigación a las enfermedades abandonadas de los países en desarrollo, aún faltan los medicamentos adecuados. Del consumo mundial de medicamentos, el 88% corresponde a un bloque de regiones formado por América del Norte (49%), Europa (28%) y Japón (11%). Como la población de estos países está envejeciendo, los principales objetivos para el desarrollo de medicamentos nuevos son las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, las alteraciones respiratorias, así como otras enfermedades que afectan la calidad de vida (osteoporosis, artritis y las enfermedades de Parkinson y de Alzheimer). La mayoría de las grandes corporaciones está instalada en Estados Unidos, donde tienen su principal mercado y una legislación favorable. En América Latina, el sector está dominado por las empresas internacionales, y salvo algunas excepciones analizadas previamente (BioSidus, ProBioMed, Heber Biotec), hay poca inversión en la investigación y el desarrollo de nuevos productos. 362 Capítulo XIX. Biotecnología y salud: los medicamentos El costo de los medicamentos depende en gran parte de las inversiones de la industria farmacéutica en la investigación y el desarrollo de nuevos productos. El tiempo y el costo de desarrollo de un medicamento dependen de la duración de los ensayos clínicos y del uso de la tecnología (robótica, bioinformática, química combinatorial, selección de compuestos biológicos a alta velocidad, biochips y microarrays). Para las grandes empresas farmacéuticas, una medida del éxito significa conseguir un medicamento que alcance un valor de ventas de mil millones de dólares (blockbusters), lo que no es fácil. En términos de investigación y desarrollo de medicamentos, cualquier enfermedad que afecte a menos de 200.000 personas no es interesante para la industria, a menos que reciba algunas compensaciones. En Estados Unidos, la Orphan Drug Act (1983) da incentivos financieros a las empresas farmacéuticas que desarrollan productos para esas enfermedades. También garantiza que ningún medicamento equivalente será aprobado durante siete años, a menos de tratarse de uno mejor. Se promulgaron legislaciones equivalentes en otros países (Japón, 1993; Australia, 1998; Singapur, 1999; Unión Europea, 2000). Se abre así un campo donde las empresas de biotecnología se insertan con éxito, ya que varios de sus productos tratan enfermedades de origen genético, incluyendo alteraciones de receptores celulares, enzimas y proteínas estructurales. 8. PATENTES Y GENÉRICOS La patente sobre un medicamento da a la empresa que lo desarrolló el derecho de exclusividad sobre su comercialización, durante veinte años. Cuando vence, el medicamento pasa a ser de dominio público, es decir que puede ser copiado y comercializado a un precio 30-50% menor. Esto ocurre porque, además de sustentar los costos de investigación y desarrollo de un medicamento, una buena parte del presupuesto de las empresas farmacéuticas se dedica a la propaganda y marketing de sus productos. A partir del vencimiento de la patente, los medicamentos genéricos pueden entrar en el mercado. Estos son productos que contienen el mismo principio activo y la misma dosis que el medicamento de referencia, así como los mismos efectos terapéuticos. Las grandes empresas farmacéuticas no descuidan el mercado global de medicamentos genéricos, que llega a 62 mil millones de dólares, pero la producción de genéricos es posible para cualquier empresa que domine las dificultades tecnológicas del proceso productivo. 363 Biotecnología Además de medicamentos de marca (innovadores), o genéricos (con el mismo principio activo y bioequivalente al innovador), en América Latina se comercializan medicamentos similares, con el mismo principio activo que el innovador, pero sin ninguna garantía de bioequivalencia. Estas copias fueron lanzadas al mercado por falta de una ley de patentes o antes de su promulgación. Los genéricos se identifican mediante una denominación común internacional, pero en algunos países esa denominación se usa para los similares, confundiendo al consumidor. En Brasil, la aprobación de los ensayos de bioequivalencia es una exigencia legal para que un medicamento pueda rotularse como genérico. Hay siete antivirales genéricos para el tratamiento del VIH/sida producidos por Far-Manguinhos que, con el mismo precio, son preferidos para la compra y distribución en la red pública de salud, con respecto a los de marca. Esto representa para Brasil ingresos de 400 millones de dólares por año. Con respecto a los productos biotecnológicos, próximamente vencerán las patentes de varias moléculas: -interferón, insulina humana, hormona de crecimiento, vacuna contra la hepatitis B, etc. Dado el costo que los nuevos medicamentos representan para los sistemas de salud, hay que pensar en la producción de genéricos de varias proteínas terapéuticas. Si bien Estados Unidos se muestra reacio al respecto, no se descarta que próximamente la Unión Europea entre en el mercado de biomoléculas genéricas. Se admite que en algunos casos, como situaciones de emergencias nacionales, circunstancias de extrema urgencia y prácticas anticompetitivas, se justifica el uso de una patente sin la autorización de quien detenta el derecho. Esta salvaguarda se encuentra en el Acuerdo sobre Aspectos de los Derechos de Propiedad Intelectual Relacionados al Comercio (TRIPS Agreement) de la Organización Mundial del Comercio, vigente desde 1995. El artículo 31 señala que el uso de la patente sin autorización estaría justificado si se hubieran hecho los esfuerzos necesarios para su uso en condiciones comerciales razonables. En ocasión de la amenaza terrorista del ántrax, Estados Unidos pensó en quebrar la patente del antibiótico Cipro. En los países en desarrollo, el acceso a los medicamentos es considerado un derecho fundamental de los pacientes con VIH/sida. Sin embargo, y a pesar de largas discusiones en el marco de la Organización Mundial de Comercio, millones de personas mueren anualmente por falta de ellos. 364 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos 1. LA APROBACIÓN DE UN TRATAMIENTO NUEVO Un tratamiento nuevo solo puede convertirse en práctica médica después de superar varias etapas. La primera corresponde a los estudios preclínicos, que comprenden investigaciones de laboratorio y experimentos con animales. Realizados en universidades o empresas, con financiamiento público o privado, sus resultados son verificados cuidadosamente, repetidos y publicados por la comunidad científica. Cuando, en función de la cantidad de información reunida, resulte razonable extender el procedimiento al ser humano, se solicitará formalmente, la autorización para iniciar los ensayos clínicos. Estos son necesarios para obtener información sobre la seguridad, la eficacia y los efectos colaterales del tratamiento. Durante los ensayos clínicos, el nuevo tratamiento podrá revelarse mejor o peor que los ya existentes. Si los resultados son satisfactorios, se solicita la aprobación de la agencia reguladora correspondiente (FDA, Food and Drug Administration, en los Estados Unidos; EMA, European Medical Agency, en la Unión Europea; ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, en Brasil; ANMAT, Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, en la Argentina). Una vez autorizado, el tratamiento nuevo pasa a ser una práctica médica de aplicación general. Sin embargo, continuará siendo vigilado para monitorear efectos negativos que solo puedan ser detectados en una población de mayor tamaño. Sea clínico o quirúrgico, el tratamiento nuevo será considerado experimental cuando utilice medicamentos, vacunas, pruebas diagnósticas, aparatos o técnicas cuya seguridad, eficacia y forma de aplicación sean todavía objeto de investigaciones en fase I, II o III. 2. EL PROGRESO DE LAS INMUNOTERAPIAS Los términos “terapia biológica” e “inmunoterapia” se refieren a los tratamientos que utilizan elementos del sistema inmune en el combate a las enfermedades. 365 Biotecnología Las bases de la inmunoterapia fueron establecidas en la segunda mitad del siglo XIX, con los experimentos de E. Von Behring y S. Kitasato. Estos extrajeron suero con antitoxina diftérica de un animal infectado y se lo administraron a otro animal, previamente inoculado con toxina diftérica. La administración de anticuerpos específicos estimuló una respuesta inmune inmediata, pasiva y de corta duración. Con ese experimento, Behring y Kitasato establecieron los principios de la seroterapia, una práctica que salvó muchas vidas y que todavía es la principal arma de defensa contra los venenos de víboras y otros animales ponzoñosos. La tecnología de hibridomas (1975) despertó gran entusiasmo, porque se esperaba que al estar dirigidos contra antígenos específicos, los anticuerpos monoclonales cumplieran la función de la mítica “bala mágica” en el reconocimiento del blanco. Defraudando las expectativas, el éxito no llegó tan rápidamente al campo terapéutico como al de los análisis clínicos. Después del Muromonab CD3 (Orthoclone OK3), un anticuerpo monoclonal que reduce la respuesta inmune, evitando el rechazo a los trasplantes, pasaron varios años antes que otro producto recibiera la aprobación de las agencias regulatorias. Había una razón técnica. Los anticuerpos monoclonales desencadenaban la respuesta inmune, porque eran producidos con células de roedores y reconocidos como non-self por los seres humanos. Modificando y, eventualmente, sustituyendo algunas partes de la molécula murina se consiguieron moléculas “quiméricas”, “humanizadas” y, más tarde, “humanas”, en líneas microbianas o animales transgénicos. Solucionado ese problema, los anticuerpos monoclonales entraron en el mercado. Existen actualmente productos para la prevención de infecciones virales, el bloqueo de IgE (asma alérgica), la inhibición de inflamaciones (artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis), el tratamiento de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes (lupus), diversos tipos de cáncer, etc. Algunos están asociados a una sustancia citotóxica (gentuzumab ozogamicin, Mylotarg, de Wyeth) o a un radioisótopo (Y-ibritumomab tiuexetan, Zevalin, de Spectrum Pharmaceuticals). Pero las aplicaciones no se restringen necesariamente a esas enfermedades. Es muy posible que surjan otras, relativas a las enfermedades emergentes y el bioterrorismo. Existen bibliotecas de anticuerpos monoclonales en las que se podría seleccionar rápidamente la molécula específica para un antígeno dado, en sistemas robotizados, altamente eficientes para la exploración molecular. El mercado global de los nuevos anticuerpos monoclonales de uso terapéutico está en crecimiento. Diez anticuerpos monoclonales son blockbusters, 366 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos es decir que alcanzaron ventas superiores a mil millones de dólares en 2010 (Tabla 1). Las terapias biológicas tienen aún el inconveniente de ser caras. Consideremos, por ejemplo, el caso del trastuzumab (Herceptin), que reconoce e inactiva el receptor de un factor de crecimiento presente en algunas células tumorales. Es el único anticuerpo monoclonal eficiente para combatir tumores sólidos. Se calcula que el costo anual del tratamiento de un paciente con Herceptin oscila entre 70 mil y 100 mil dólares. 3. EL CÁNCER Una enfermedad de origen genético La palabra cáncer se refiere a un conjunto de más de 100 enfermedades que pueden desarrollarse en cualquier órgano del cuerpo y que afectan a una persona de cada ocho de la población. Las células cancerosas son células que escapan de las señales de control de la división celular, se dividen indefinidamente y dejan de diferenciarse. Al perder algunos receptores de la membrana celular, estas células se separan de las células vecinas y se esparcen por el cuerpo. Se sabe que el 1% del genoma humano está relacionado con la aparición de un cáncer y que la transformación de una célula normal en cancerosa depende de dos tipos de genes: los protooncogenes y los genes supresores de tumor. Los protooncogenes codifican proteínas que estimulan la división celular, inhiben la diferenciación y detienen la apoptosis o “suicidio celular”. La mutación que los transforma en oncogenes aumenta la síntesis de esas proteínas e induce a las células a multiplicarse indefinidamente. En contrapartida, los genes supresores de tumores estimulan la autodestrucción de las células que sufrieron mutación, pero se encuentran alterados o ausentes en las células cancerosas. Las mutaciones generan antígenos “específicos de tumor”, como las proteínas anormales ras y p53, el aumento significativo de la enzima tirosinasa o la reaparición de proteínas oncofetales (alfafetoproteína y antígeno carcinoembriogénico). Otros antígenos se expresan únicamente en el tumor de un único individuo, o solo aparecen en las células tumorales de los individuos afectados por determinado tipo de tumor. En genes que no están directamente asociados al tumor, algunas mutaciones pueden originar “antígenos asociados al tumor” y estos pueden ser utilizados como biomarcadores. 367 Biotecnología TABLA 1. Los diez anticuerpos monoclonales de uso terapéutico, líderes de ventas en 2010 Nombre genérico (marca) Infliximab (Remicade) Empresas Indicaciones Ventas (en US$ mil millones) 8.0 Johnson & Johnson Merck Mitsubishi Tanabe Artritis reumatoide Colitis ulcerativa Enfermedad de Crohn Psoriasis Artritis psoriática Espondilosis anquilosante Cáncer de colon Linfoma no Hodgkin Artritis reumatoide Artritis reumatoide Psoriasis Artritis idiopática juvenil Artritis psoriática Espondilosis anquilosante Enfermedad de Crohn Cáncer de mama Cáncer de colon, cabeza y cuello Degeneración macular Esclerosis múltiple Asma alérgica Virus respiratorio sincicial Bevacizumab (Avastin) Rituximab (Rituxan) Adalimumab (Humira) Roche Roche Abbott 6.8 6.7 6.5 Trastuzumab (Herceptin) Cetuximab (Erbitux) Ranibizumab (Lucentis) Natalizumab (Tysabri) Omalizumab (Xolair) Palivizumab (Synagis) Roche BMS Merck Serono Novartis Roche Biogen Idec Elan Roche Novartis Astra Zeneca 5.5 3.2 3.1 1.75 1.1 1.0 Fuente: con datos de <http://knol.google.com/k/krishan-maggon/top-ten-monoclonalantibodies-2010/3fy5eowy8suq3/143#>. 368 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos Las mutaciones pueden ser causadas por diversos factores, ambientales (agentes químicos, radiación, virus) o genéticos (heredados o adquiridos durante la vida). Aunque casi siempre ocurren en las células somáticas, también pueden suceder en las células germinales. Algunas son puntuales, otras son cromosómicas. Al acumular media docena de mutaciones en esos genes, las células se vuelven cancerosas. Normalmente, son eliminadas por el sistema inmune, pero cuando esta respuesta falla, las células cancerosas comienzan a proliferar (Figura 1). Las terapias biológicas Las terapias biológicas complementan los tratamientos clásicos del cáncer, que todavía son la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia. El progreso de la ingeniería genética permitió la producción de proteínas recombinantes y en consecuencia, de nuevas terapias. Algunas contemplan el refuerzo de la actividad inmunológica a través de las citoquinas, mensajeros químicos que representan las señales de comunicación entre las células del sistema inmune (-interferón, interleuquina IL-2). Otras se administran a las personas que pasaron por quimioterapias o sufren inmunodeficiencias, para estimular la proliferación de las células sanguíneas (eritropoyetina). FIGURA 1. Formación de una célula cancerosa Es necesario que se acumulen varias mutaciones para que una célula adquiera características cancerosas. El proceso puede llevar más de 50 años, pero si hubiera mutaciones heredadas (predisposición), el cáncer de colon se puede desarrollar prematuramente Célula normal Primera mutación (gen APC) Segunda mutación (gen ras) Tercera mutación (gen DCC) Cuarta mutación (gen p53) Célula cancerosa 369 Biotecnología Se está trabajando también en la construcción de nanodispositivos para dirigir los medicamentos hasta las células blanco, como los liposomas y las nanopartículas magnéticas. Estas últimas serían especialmente interesantes porque podrían ser transportadas, en un campo magnético, directamente hasta el lugar del tumor. Las vacunas terapéuticas Una de las primeras terapias complementarias contra el cáncer es la inoculación con la vacuna BCG (Bacilo de Calmette y Guérin) que estimula en el paciente una reacción inmunológica de tipo celular, extensiva a las células cancerosas. Las vacunas profilácticas son aquellas que se aplican en los individuos sanos para prevenir las enfermedades. Dentro de esta línea, existen vacunas contra algunos de los agentes virales sabidamente relacionados con la aparición del cáncer. Se trata de las vacunas contra el virus de la hepatitis B (VHB), asociado al cáncer de hígado, y contra el virus del papiloma humano (VPH), responsable por el 70% de los cánceres de útero (Gardasil, Merck; Cevarix, GlaxoSmithKline). Estas vacunas cumplen una acción preventiva. El objetivo de las vacunas terapéuticas actuales es el tratamiento de los individuos que ya están enfermos, estimulando directamente la respuesta inmune del organismo para que pueda eliminar las células cancerosas. Pese a la enorme cantidad de procedimientos posibles, todos son experimentales. Una posibilidad es la aplicación de antígenos sintéticos, específicos o asociados al tumor. Una de las principales dificultades está en la elección de los antígenos que deberían ser incluidos en la vacuna, porque si bien algunos son comunes a varios tipos de células cancerosas, otros solo aparecen en cánceres específicos. La vacuna ideal tendría que ser eficaz en cualquier paciente con determinado tipo de cáncer. Las vacunas de vectores (virus, ADN desnudo) consiguen una respuesta inmunológica más fuerte que las vacunas de antígenos. Las células cancerosas podrían ser infectadas por vectores virales modificados, cargados con moléculas moduladoras de la respuesta inmune, o con enzimas capaces de transformar una droga inactiva en activa. Otra posibilidad sería la elaboración de vacunas contra tumores, utilizando células debilitadas o muertas. Provenientes del mismo paciente, o de otro, esas células expresarían antígenos asociados a un tumor y estimularían la respuesta inmune. Una variante de vacuna tumoral envuelve el estímulo ex vivo de las células del sistema inmune, de modo tal que estas expresen el antígeno. Esta 370 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos estrategia ha dado origen a la primera vacuna terapéutica (sipuleucel-T, o Provenge, de Dendreon) contra el cáncer de próstata hormono-refractario, autorizada por la FDA, en los Estados Unidos (2010). El emprendimiento representó para la empresa Dendreon, una inversión del orden de mil millones de dólares. El sipuleucel-T es una proteína de fusión entre una enzima específica de las células cancerosas (PAP, del inglés prostatic alcaline phosphatase) y un modulador de las respuesta inmune (GM-CSF, del inglés granulocytes and macrophages colony stimulating factor). El tratamiento tiene que ser adaptado a cada paciente. Comienza con la extracción de las células presentadoras de antígeno (células dendríticas) del paciente, sigue con la incorporación in vitro de los antígenos tumorales y termina con la reinfusión de las células modificadas en el mismo paciente (Figura 2). En el momento del lanzamiento, Dendreon estimaba el costo de cada tratamiento en 93.000 dólares. La tecnología es promisoria pero, debido a su complejidad tecnológica y al costo de un tratamiento personalizado, difícilmente las vacunas terapéuticas podrán beneficiar a un sector amplio de la sociedad. FIGURA 2. El tratamiento con sipuleucel-T (Provenge) A. Extracción de células dendríticas Leucoféresis (3 horas) Células dendríticas B. Incubación de las células con Provenge 2 a 3 días Células dendríticas + Provenge (PAP-GM-CSF) Células dendríticas que incorporaron el antígeno tumoral PAP-GM-CSF C. Reinfusión de las células modificadas en el paciente (tres veces, con dos semanas de intervalo) Estímulo de la respuesta de las células-T al antígeno tumoral PAP-GM-CSF y, consecuentemente, contra las células cancerosas 371 Biotecnología 4. LAS TERAPIAS GÉNICAS Terapia somática y germinal La terapia génica puede tener varias modalidades. Una de ellas consiste en inhibir la expresión de un gen, otra en interferir con su producto génico para que este se vuelva inactivo. Una tercera consiste en sustituir un gen inactivo por una copia funcional que se exprese y sintetice la proteína que falta. Esta proteína puede ser una enzima normal, una molécula que torne a la célula vulnerable al ataque del sistema inmune, una sustancia tóxica, o una enzima que desencadene la apoptosis en una célula cancerosa (Figura 3). El objetivo de la terapia génica es modificar exclusivamente las células somáticas del individuo, sin pretender que esta modificación se transmita a la siguiente generación. Del mismo modo que en un trasplante se transfiere un órgano o un tejido, en la terapia somática se transfiere un gen, y el efecto se limita al individuo que lo recibe. Como para cualquier tipo de terapia experimental, las objeciones se centran en el empleo de una tecnología aún imperfecta, que comprende riesgos y de la cual se desconocen los efectos a largo plazo. También suscita mucha resistencia la eventual transferencia de genes a las células germinales, porque en ese caso las modificaciones se transmitirían a la descendencia. Cualquier intento de modificar la línea germinal es inaceptable porque permitiría la eugenesia, es decir, la selección genética para alcanzar el “genotipo ideal”. Desde esta óptica, ¿qué caracteres se considerarían “saludables”? ¿Y por quién? La historia del siglo XX, con su secuela de horrores (esterilización de deficientes y enfermos mentales en Estados Unidos, persecuciones en la Alemania nazi, etc.) muestra que deben tomarse todos los cuidados para impedir la discriminación genética y la implementación de una sociedad arbitraria. La terapia génica de la línea germinal no está permitida en ningún país. Los altibajos de una tecnología De todas las nuevas biotecnologías, la más difícil de evaluar es la terapia génica porque, además de presentar problemas éticos y religiosos, a lo largo de los últimos 25 años tuvo una historia de altibajos, pasando alternativamente por escándalos, triunfos y fracasos. Las primeras experiencias de terapia génica para el tratamiento o la cura de una enfermedad fueron realizadas por Martin Cline en Estados Unidos (1980). 372 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos FIGURA 3. Fundamentos de la terapia génica Copias de un gen normal, previamente clonado en bacterias Virus Inserción en un vector Liposoma Introducción del gen normal en las células de una persona con una enfermedad genética Pulmón Músculo Hígado Cultivo de células (médula ósea) Reimplantación No solo no tuvieron éxito, sino que despertaron una reacción contraria unánime. El comité de ética correspondiente no las había autorizado y, además, los estudios experimentales previos eran insuficientes. El episodio motivó la implementación de reglas estrictas para estos tratamientos. En 1990, fue autorizado en Estados Unidos el primer tratamiento por terapia génica de dos casos de inmunodeficiencia combinada grave (SCID, del inglés severe combined immunodeficiency), una enfermedad en la que la falta de la enzima desaminasa de adenosina (ADA) bloquea un camino metabólico, causando la acumulación de una sustancia que destruye a los linfocitos T. Los niños con esta deficiencia enzimática tienen una vida corta, porque padecen continuamente de infecciones. El tratamiento usual es la administración de enzimas, pero los pacientes acaban desarrollando alergias a los componentes del producto inyectado. Para ellos el único recurso es el trasplante de medula ósea, siempre y cuando haya algún donante compatible. La terapia aprobada por la FDA consistía en extraer linfocitos de la sangre, transferirles un gen normal de ADA y reinyectar los linfocitos modificados en la circulación sanguínea del paciente. Se aplicó el procedimiento en Ashanti da Silva y más tarde en otra niña, Cynthia, que tuvieron una 373 Biotecnología mejora significativa. Como los linfocitos tienen un período de vida corto, se repitió periódicamente el procedimiento. Después de dos años, algunas de las células modificadas sobrevivientes produjeron ADA pero, en cantidad insuficiente, de modo que ninguna de las niñas pudo prescindir del tratamiento enzimático. El problema persistió en los estudios posteriores y ningún paciente pudo abandonar el tratamiento alternativo con la enzima, aun cuando la modificación genética fuera realizada en células madre de la médula ósea o de cordón umbilical. Este problema enfrió el interés por las investigaciones en esta área. En 1999, Jesse Gelsinger, un joven de 18 años afectado por una deficiencia de OTC (ornitina transcarbamilasa), que se presentara como voluntario para un tratamiento de terapia génica en la Universidad de Pensilvania, murió debido a una reacción inmunológica al adenovirus usado como vector. En Francia, en 2000, la terapia génica de una variante de inmunodeficiencia (SCID-X1) pareció ser exitosa en nueve de los diez niños tratados. Sin embargo, cuatro niños desarrollaron leucemia y uno murió, porque el vector viral se insertó en un lugar no esperado, inactivando un gen supresor de tumor. Estos fracasos mostraron que se trataba de una tecnología imperfecta. Dos años más tarde se renovaron las esperanzas de los pacientes de SCID y sus familiares, debido a la puesta a punto de una nueva técnica que, mediante la remoción parcial de médula ósea, favorece el desarrollo de células madre modificadas genéticamente. Por otro lado, se limitó la participación en los tratamientos experimentales de SCID a niños que nunca hubieran recibido el tratamiento experimental con ADA. La primera paciente tratada es Salsabil, una niña palestina de dos años de edad, que crece saludable. El estado del arte El campo de las terapias génicas cuenta con numerosos estudios, en diferentes etapas de realización. Las dificultades son enormes, porque se trata de transferir un gen a una determinada célula, localizada en cierto tejido, y conseguir que ese gen funcione adecuadamente y de forma duradera. El punto más débil es la necesidad de contar con vectores seguros y procedimientos eficaces. El único producto comercial disponible en el mercado ha sido desarrollado y autorizado en China (2004). La Gendicina (Shenzhen SiBiono Gene Tech) es un adenovirus con el gen supresor de tumores p53, utilizado en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. 374 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos De los numerosos estudios en vía de realización, se esperan resultados positivos en relación a las infecciones virales (VIH/sida) y los síndromes genéticos (hemofilia, talasemia, Huntington, Duchenne, fibrosis quística, SCID), además de progresos en los estudios oncológicos y sobre enfermedades cardiovasculares y neurológicas. El éxito podría estar cerca, tanto en relación a SCID como a otras dos enfermedades genéticas (amaurosis congénita de Leber o ALC, y adrenoleucodistrofia, ALD). Son enfermedades de baja frecuencia, que entran en la categoría de tratamientos/medicamentos abandonados, garantizando incentivos financieros a las empresas farmacéuticas. Las tres podrían ser tratadas modificando genéticamente células madre ex vivo, es decir mediante un tratamiento personalizado complejo. En la lucha contra las enfermedades infecciosas como el VIH/sida, encontramos diferentes líneas de investigación. Una de ellas busca bloquear la replicación del virus, otra los receptores que el virus VIH usa para entrar en el linfocito T. Ninguno de esos estudios superó todavía la fase correspondiente a los ensayos clínicos. El futuro de las terapias génicas es controvertido. Del mismo modo que en relación a otras terapias experimentales, las objeciones se centran en la utilización de una tecnología imperfecta, que envuelve riesgos y de la cual se desconocen los efectos a largo plazo. Sin embargo, el alto número de investigaciones en desarrollo y de ensayos en fase II y III, indicarían que en un futuro próximo algunas de las dificultades podrían ser superadas. La terapia génica despierta algunas inquietudes con respecto al deporte. En 1998, un equipo entero de ciclistas fue eliminado del “Tour de France” por el uso indebido de la eritropoyetina, que aumenta el número de glóbulos rojos. Fraudes de este tipo no podrían detectarse si el atleta fuera modificado genéticamente para aumentar naturalmente su producción de eritropoyetina. En 2008, en Alemania, hubo un confuso caso de doping de atletas, protagonizado por un entrenador y un producto de terapia génica en fase preclínica (Repoxygen, Oxford Biomedica) que induce la liberación de la eritropoyetina, en bajas concentraciones de oxígeno. Las promesas del silenciamiento génico A lo largo de los últimos treinta años se descubrieron varios mecanismos de silenciamiento génico, basados en los diversos tipos de ARN y sus propiedades (Figura 4). 375 Biotecnología FIGURA 4. Tecnologías de silenciamiento génico A. Las ribozimas Ribozima ARN ARN fragmentado B. El ARN antisense Síntesis de proteínas ADN Transcripción ARNm ADN Transcripción ARNm ARN anti sense Inhibición de la síntesis proteica por ARN antisense Traducción No hay traducción C. El ARN interferente ARN de 2 filamentos Pequeño ARN interferente ARNm exógeno o endógeno Complejo enzimático El ARNm es fragmentado Exterior Membrana celular Citoplasma Las ribozimas son moléculas de ARN con propiedades catalíticas, que cortan otras moléculas de ARN cuando en ambas secuencias hay algunos nucleótidos complementarios. Su descubrimiento tuvo una importancia extraordinaria, porque permitió la construcción de una teoría sobre el origen de la vida en un mundo de ARN. El uso de ribozimas como agentes biológicos, ya sea para inactivar un gen o para inhibir la replicación del VIH en células infectadas, ha dado pie 376 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos a numerosas y exitosas investigaciones. Sin embargo, ningún producto ha entrado hasta ahora al mercado. También despertó grandes expectativas la tecnología antisense, que utiliza el mecanismo de transcripción para inactivar un gen. Normalmente, el ARN transcripto es complementario a una de las cadenas del ADN. Colocando un promotor en la otra cadena, se consigue la transcripción de un ARN complementario al original. La asociación de ambos transcriptos, sense y antisense, forma una molécula doble que no podrá unirse a los ribosomas para la síntesis proteica, o que será destruida por otros mecanismos celulares. Uno de los primeros éxitos de la tecnología antisense fue en el sector hortigranjero, con el tomate FlavSavr, que maduraba en la planta sin ablandarse. Aplicada en terapias génicas, la tecnología antisense posibilitó el desarrollo de un medicamento para el tratamiento de infecciones oculares por citomegalovirus en pacientes con VIH/sida. El formivirsen (Vitravene, Isis Pharmaceuticals) fue autorizado en 1998 por la FDA de los Estados Unidos. Actualmente, se están realizando ensayos clínicos para una docena de medicamentos de este tipo, pero ninguno de ellos estará disponible hasta 2015. Otra tecnología reciente es la del ARN de interferencia (ARNi), originada también en investigaciones de fisiología vegetal. En 1990 se realizaron experiencias relacionadas con la coloración de petunias en las que la introducción de un gen extra, en lugar de flores más pigmentadas, originaba flores blancas. Se describieron casos similares de “silenciamiento génico” en el gusano Caenorhabditis elegans y en la mosca Drosophila melanogaster. Más tarde se observó que, si en vez de un gen se introducen en la célula filamentos dobles de ARN con más de 200 nucleótidos, también se produce la inactivación de la expresión génica, y que esta ocurre una vez realizada la transcripción. Se sabe hoy que estas moléculas de ARN son fragmentadas en pedazos menores que se asocian a un complejo enzimático, retomando su forma de hebra simple y destruyendo a cualquier ARNm que presente una secuencia complementaria. Se cree que la maquinaria enzimática involucrada en el proceso de interferencia habría surgido como una forma de defensa contra los virus de ARN de doble cadena. Pero, actualmente se sabe que también es un elemento importante en la regulación de la expresión génica. La tecnología de ARN de interferencia (ARNi) es una herramienta de laboratorio poderosísima, que permite entender la función de los genes y su regulación, de forma mucho más simple y eficiente que mediante la construcción de animales knock-out. Además de ser utilizada en las investigacio377 Biotecnología nes sobre genómica funcional, esta tecnología abre numerosas posibilidades de tratamiento para las infecciones virales y las enfermedades genéticas o neurológicas. En relación al cáncer, permitió la inactivación in vitro de moléculas asociadas a la patología y a la progresión de la enfermedad. Los tejidos que podrían ser tratados más fácilmente serían los del ojo, la piel, las membranas mucosas y los tumores locales. Las investigaciones más avanzadas corresponden al tratamiento de la degeneración macular y la infección por el virus respiratorio sincicial. Aunque hay aplicaciones exitosas en el área agrícola, en el área de salud aún falta superar la fase experimental y resolver varios problemas previos a su utilización clínica. Los más importantes son la introducción del ácido nucleico en la célula y el control de su radio de acción, para restringir la interferencia a la molécula-blanco. A pesar del éxito de los estudios in vitro, esta tecnología es aún experimental, y su aplicación en el ser humano, incipiente. 5. LOS TRASPLANTES Los trasplantes de órganos El primer intento data de 1899, con el trasplante del riñón de un perro a otro. Desde las primeras experiencias resultó obvio que el fenómeno de rechazo es el principal obstáculo para los trasplantes de órganos, con la excepción de la córnea, cuyo primer trasplante exitoso se realizó en 1905. El primer trasplante de corazón fue realizado por el cirujano Christian Barnard en Sudáfrica (1967), con gran repercusión en los medios de comunicación. El mundo entero acompañó los comunicados médicos emitidos en Ciudad del Cabo, hasta la muerte del paciente que ocurrió 18 días más tarde. Durante varios años los problemas de rechazo no encontraron solución. En la década de 1980, además de mejorar las técnicas quirúrgicas y la caracterización de los antígenos de los tejidos, aparecieron los primeros medicamentos inmunosupresores (ciclosporina). En los centros médicos de todo el mundo se reemplazan con éxito diversos órganos (corazón, riñón, hígado, córnea, médula ósea, piel y páncreas). Algunos procedimientos son relativamente simples. En un isotrasplante, la transferencia se hace de un individuo a su gemelo (ovario, riñón). En un autotrasplante se reemplaza, por ejemplo, una arteria coronaria por una safena o un fragmento de piel dañado por otro. Ya en el alotrasplante, que 378 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos es la transferencia de un órgano de un individuo a otro, se requiere la supresión del sistema inmune para que el organismo pueda aceptar una parte “no propia”. En caso contrario el órgano será rechazado e incluso, también, el órgano podrá rechazar al hospedador. A la dificultad de encontrar un donante, se suma la de encontrar un donante compatible. Por eso una alternativa sería el xenotrasplante, es decir, la transferencia de un órgano de un animal al hombre. Debido al tamaño y la estructura de sus órganos, el cerdo parece ser el animal más indicado. En 1906 se hizo la prueba de unir el riñón de un cerdo al brazo de una muchacha, una experiencia que resultó fatal. Hoy se sabe que debido a la presencia en las células porcinas de galactosa- -1-3 galactosa, un tipo de molécula que no se encuentra en primates, habrá un rechazo violento a menos que se apliquen altas dosis de medicamentos inmunosupresores. El encapsulado de las células animales en una matriz inerte que las aísle, y al mismo tiempo deje pasar a los nutrientes y productos celulares, podría evitar el rechazo. Este procedimiento se aplicó recientemente en pacientes diabéticos que recibieron células porcinas encapsuladas que comenzaron a secretar insulina. También se aplicó en una centena de pacientes con cáncer, para la secreción de moléculas que alivian el dolor. A fines de 2002, dos empresas (PPL Therapeutics e Immerge Bio Therapeutics) anunciaron haber conseguido clonar cerdos en los que el gen correspondiente a la enzima que sintetiza el antígeno galactosa- -1-3 galactosa fue desactivado por doble knock out. Estos cerdos podrían ser una fuente de órganos para un trasplante temporario a seres humanos. Sin embargo, aun eliminando el peligro del rechazo agudo, falta por resolver el rechazo que desencadenarían las proteínas porcinas. Una objeción importante para los xenotrasplantes es el riesgo de introducir retrovirus de otras especies en los seres humanos, con resultados imprevisibles. La ingeniería de tejidos La ingeniería de tejidos emerge en la interfase de la biología celular, la medicina, la bioquímica y la bioingeniería, con el objetivo de reemplazar órganos y tejidos. Hace años que se utiliza el cultivo de piel in vitro para reparar lesiones causadas por quemaduras. Basta un pequeño fragmento de piel aislado del propio paciente, para formar en tres semanas una superficie cincuenta veces mayor. Antes de ser aplicada, la nueva piel se amolda a una superficie bio379 Biotecnología degradable para evitar que se desgarre durante el proceso. Con este procedimiento se tratan quemaduras y heridas difíciles de cicatrizar. La “biomimética” permite la reparación in vivo del tejido óseo, usando como molde un polímero donde migran y se expanden las células regenerativas internas. La tecnología se aplica en la reparación de fracturas óseas y de lesiones causadas por enfermedad periodontal y, también, en la reconstrucción del cartílago de las articulaciones. Recientemente, fue trasplantada con éxito una tráquea construida con células madre del propio paciente cultivadas sobre un molde poroso. Este parece ser el primer paso en la construcción in vitro de estructuras tridimensionales análogas a los órganos, por cultivo de células sobre un polímero, dirigiendo el crecimiento por estimulación con factores de crecimiento. Por ahora parece más sencillo construir estructuras mecánicas que órganos complejos, como un riñón o un pulmón. Las células madre Las células madre se encuentran en el embrión y en los tejidos adultos (medula ósea, sangre periférica, cordón umbilical, placenta, córnea y retina, pulpa dentaria, hígado, piel, tracto gastrointestinal y páncreas). Pese a que solo recientemente se logró cultivar células madre en el laboratorio, estas encontraron rápidamente una aplicación en el tratamiento de algunas enfermedades. Hoy en día el trasplante de células madre adultas ha dejado de ser un tratamiento experimental para convertirse en un método terapéutico en las enfermedades hematológicas, oncológicas, hereditarias e inmunológicas. Salvo en el caso de un autotrasplante, es necesario encontrar un donante que sea compatible con el paciente. Este problema puede solucionarse almacenando sangre de cordón umbilical en grandes bancos públicos, como los que ya existen en Argentina, Brasil y México. Los estudios indican que la probabilidad de que una persona necesite sus propias células es de 1:100.000, por lo cual no se justifica el costo del depósito para uso propio en bancos privados. Células madre multipotentes El éxito de los trasplantes de piel, de córnea y de médula ósea se explica por la presencia de células madre multipotentes en los tejidos adultos, donde proliferan durante largos períodos de tiempo. Conservan la capacidad de 380 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos diferenciarse en diferentes tipos celulares y son responsables por el crecimiento y la reparación de los tejidos. Las células madre hematopoyéticas se encuentran en frecuencias bajísimas en la médula ósea (1:10.000 a 1:15.000) y en la sangre periférica (1:100.000). Aunque sus características morfológicas no las distingan de otras células, la presencia de marcadores moleculares específicos en la membrana celular permite separarlas y, más tarde, infundirlas en la misma persona o en otra compatible. Estas células pueden reemplazar a los trasplantes de médula en el tratamiento de leucemias y linfomas, de enfermedades hereditarias hematológicas y en la recuperación de los pacientes que recibieron quimioterapia. Aún quedan algunas dudas con respecto a su modo de acción y la posibilidad de multiplicación descontrolada. Sin embargo, los resultados clínicos con células madre adultas son alentadores. En varios países ya se están usando en la regeneración de miocardio de pacientes cardíacos y con la enfermedad de Chagas, para el tratamiento del accidente cerebrovascular y la diabetes, y para la reparación de daños neurológicos, con resultados satisfactorios. Hay numerosas investigaciones sobre la capacidad regenerativa de las células madre adultas en la cicatrización de quemaduras, la sustitución de células de la córnea, la regeneración de hueso y cartílago, el tratamiento de artritis y la reparación de fracturas. Pese a que algunos aspectos relativos a su modo de acción no estén totalmente aclarados, los ensayos clínicos son promisorios. Células madre pluripotentes Debido a las limitaciones existentes en la capacidad de diferenciación de las células madre adultas, muchos investigadores se interesaron por las células madre embrionarias, que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula y son mucho más fáciles de cultivar en el laboratorio (Tabla 2). Uno de los mayores desafíos actuales es entender los mecanismos que controlan el crecimiento y la diferenciación celular. Recientemente, Advanced Cell Technology inició en los Estados Unidos los primeros ensayos clínicos para el tratamiento de dos formas de ceguera. Otras dos empresas también comenzaron los ensayos relativos a la regeneración de médula espinal (Geron) y de células dañadas por derrame cerebral (Reneuron), respectivamente. A fines de 2011, Geron anunció la suspensión de esa línea de investigación, por motivos económicos. El gran entusiasmo despertado por las células madre embrionarias se explica porque en algún momento se esperaba que fuera posible crear líneas 381 Biotecnología TABLA 2. Características comparadas de las células madre, embrionarias y adultas Células madre embrionarias Pluripotentes, se pueden diferenciar en cualquiera de los más de 200 tipos celulares del organismo Aproximadamente 30 células, fáciles de encontrar en un embrión de tres a cinco días Fáciles de cultivar en el laboratorio Inducen rechazo Células madre adultas Al diferenciarse lo hacen en un número limitado de tipos celulares. Las investigaciones recientes indican que la plasticidad podría ser bastante mayor Difíciles de encontrar en los tejidos Más difíciles de cultivar en el laboratorio Inducen rechazo al ser trasplantadas, pero pueden reintroducirse en la misma persona, a modo de injerto autólogo personalizadas, a través de la transferencia nuclear. Al llevar la información genética del paciente, las células madre embrionarias regenerarían los órganos lesionados sin causar problemas de rechazo. También podrían ser objeto de una terapia génica (Figura 5). El procedimiento, llamado clonaje terapéutico, abriría caminos para el tratamiento de enfermedades para las cuales tenemos pocos recursos terapéuticos (Parkinson, Alzheimer, Duchenne, etc.). Sin embargo, hasta no ser resueltos varios problemas técnicos, éticos y legales, el clonaje terapéutico se mantiene en el terreno experimental del laboratorio. En 2007, la controversia moral y filosófica sobre el uso de embriones como fuente de células madre para el clonaje terapéutico pareció totalmente superada. Al insertar algunos genes en células somáticas diferenciadas se consiguió obtener células tronco iPS (del inglés, induced pluripotent stem cells), con propiedades equivalentes a las de las células madre embrionarias. Con las células iPS irá a desarrollarse rápidamente la tecnología de reprogramación celular, aumentando nuestro conocimiento sobre el control genético de la diferenciación y abriendo una nueva senda para la implementación de pruebas, medicamentos y tratamientos nuevos. Aspectos polémicos de las células madre Las células madre embrionarias representarían la posibilidad de nuevos tratamientos de regeneración celular para enfermedades cardíacas, diabetes, 382 Capítulo XX. Biotecnología y salud: los nuevos tratamientos FIGURA 5. Clonación terapéutica Es una forma de generar células madre embrionarias con la información genética del donante del núcleo celular Paciente Células sanas del paciente Transferencia nuclear Fusión Ovocito Ovocito sin núcleo Infusión Células madre diferenciadas Células madre recuperadas Embrión lesiones de la médula espinal, distrofia de Duchenne, ceguera, sordera y enfermedad de Parkinson. Los principales objetivos son las enfermedades hematológicas, las enfermedades crónicas (cardiovasculares, neurodegenerativas, nefropatías, diabetes tipo 1), el accidente cerebrovascular, las inmunodeficiencias y los traumas de la médula espinal. Con el objetivo de obtener células capaces de reconstruir cualquier tipo celular, en los últimos años del siglo XX varios núcleos de investigación trataron de obtener líneas de células madre embrionarias. Las pocas existentes se obtuvieron de fetos abortados y de los embriones supernumerarios, resultantes de las fertilizaciones in vitro. Como esas líneas eran cultivadas con suero bovino o con fibroblastos de ratón, nunca hubieran podido tener aplicación clínica. Entre 2001 y 2009, en los Estados Unidos no fueron otorgados fondos públicos para investigaciones con nuevas líneas de células madre embrionarias. Sin embargo, la iniciativa privada no sufrió ninguna restricción y cada estado de ese país pudo fijar sus reglas. Paralelamente, varios países establecieron su legislación, en función de consideraciones científicas, éticas y religiosas. En 2005, investigadores surcoreanos declararon haber construido por transferencia nuclear, 11 líneas de células madre embrionarias de pacientes 383 Biotecnología de diversas enfermedades. Pese al notable entusiasmo despertado por estos trabajos, al poco tiempo comenzaron a surgir dudas sobre la veracidad de los resultados divulgados y los propios investigadores tuvieron que reconocer que esas líneas nunca existieron. Por otro lado, en las investigaciones se habrían utilizado ovocitos de mujeres que trabajaban en el laboratorio. El escándalo llamó la atención sobre la fragilidad ética de algunos estudios. Otro aspecto controvertido es el uso de los embriones supernumerarios de las clínicas de fertilidad asistida como fuente de células madre embrionarias. Esos embriones son el resultado de las fecundaciones in vitro y aunque se conservan congelados durante un cierto tiempo, a mediano plazo son eliminados. Un sector de la sociedad argumenta que la extracción de células madre de embriones es realizada estrictamente de 4 a 14 días después de la fecundación y que después de cierto tiempo esos embriones no pueden ser reimplantados con seguridad. En esa línea de pensamiento, sería mejor utilizarlos para las investigaciones sobre nuevos tratamientos de enfermedades que hoy no tienen cura. En contraposición, otro sector considera que la vida comienza con la fecundación y que esas investigaciones no respetan el estatus legal y moral del embrión. Consideran inadmisible que sean creados embriones in vitro para las investigaciones científicas. En una tercera posición se encuentran los que consideran que las terapias celulares son una tecnología incipiente y que todavía se necesita de mucha investigación preclínica. Este grupo tiende a postergar cualquier decisión hasta que haya evidencias concretas sobre la tecnología y sus beneficios, pidiendo más reflexión. En principio, el descubrimiento de las iPS parece haberles dado razón. Finalmente, otro motivo de preocupación es la proliferación del turismo médico, atrás de la promesa de curas milagrosas. Recientemente, un niño israelí con ataxia telagietacsia fue diagnosticado con un tumor cerebral, después de un tratamiento con células madre fetales, realizado en Rusia. Los estudios posteriores con marcadores celulares mostraron que el tumor había sido originado por las células implantadas. 384 Capítulo XXI. Consideraciones finales En los capítulos anteriores, al revisar los fundamentos de las biotecnologías, destacamos algunos ejemplos de emprendimientos latinoamericanos exitosos: el desarrollo del sector agropecuario y de la industria de medicamentos en la Argentina, la plataforma genómica y la producción de vacunas en Brasil, el alcance de la biominería en Chile, el éxito de la experiencia de Cuba, etcétera. A pesar de las dificultades económicas y políticas, estas experiencias fueron posibles gracias a una condición fundamental, la de contar con instituciones competentes, además de una masa crítica de investigadores y personal técnico entrenado. Aunque en algunos casos esos recursos existían previamente, en otros tuvieron que ser creados. La biotecnología es una disciplina basada en el conocimiento. La educación cumple un papel fundamental, tanto en la formación de los cuadros profesionales de todos los niveles, como en la divulgación y difusión de los conocimientos necesarios para la comprensión de esta nueva tecnología. Estos conocimientos son indispensables para evaluar adecuadamente sus beneficios y establecer las normas para su uso. En los albores del siglo XXI, en un momento histórico mundial de conflictos y cambios sociales, las incógnitas que nos rodean son varias: ¿Cómo estimular el interés de las nuevas generaciones por el conocimiento científico y tecnológico? ¿Cómo evitar que aumente la distancia científico-tecnológica entre los países desarrollados y en desarrollo? ¿Cómo se verán afectados los rumbos de la investigación científica y tecnológica con la creciente disminución del financiamiento público y la entrada del financiamiento privado? ¿Cómo la privatización de la investigación científica y tecnológica alterará, a través del sistema de patentes, la transparencia del proceso de adquisición y divulgación del conocimiento? ¿Cómo pasar de la investigación científica al desarrollo tecnológico de un producto o servicio? ¿Cómo incubar y agrupar a las empresas que están dando sus primeros pasos? 385 Biotecnología ¿Cómo mantener la comunicación y la transferencia de conocimientos entre los países en desarrollo? ¿Cómo evitar la manipulación de la opinión pública? ¿Cómo asegurar que los beneficios de las biotecnologías lleguen a los pueblos más desfavorecidos? ¿Cómo conciliar seguridad e innovación tecnológica? ¿Cómo insertar las nuevas tecnologías en un contexto que garantice el respeto a los principios éticos fundamentales de nuestra sociedad? Para estas preguntas no hay una única respuesta. La discusión y el consenso son fundamentales. Río de Janeiro, octubre de 2012. 386 Bibliografía CAPÍTULO I Access Excellence (The National Health Museum), “Biotechnology Timelines”, <http://www. accessexcellence.com>. Agência da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de San Pablo, <http://www.agencia. fapesp.br>. Alcamo, I. E., DNA Technology: The awesome skill, Dubuque, Brown Publishers, 1996. Anciães, W. y J. E.Cassiolato, Biotecnologia: seus impactos no setor industrial, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, 1985. Associação Brasileira de Empresas de Biotecnologia, <http://www.abrabi.org.br>. Bioplanet, <www.bioplanet.net>. Bioteach, <http://bioteach.ubc.ca>. Biotechnology Industry Organization, <http://www.bio.org>. Bisang, R. et al. (coord.), “Las empresas de biotecnología en Argentina”, Universidad Nacional de General Sarmiento, Universidad Nacional de Quilmes y Centro de Estudios Urbanos y Regionales, Documento de Trabajo Nº 1, 2005. Borém, A. y F. R. Dos Santos, Biotecnologia Simplificada, Viçosa, Minas Gerais, Universidade Federal de Viçosa, 2001. Bud, R., The Uses of Life: a History of Biotechnology, Cambridge, Cambridge University Press, 1993. Bull, A. T. et al., Biotechnologie: Tendances et Perspectives Internationales, Organisation de Coopération et de Développement Economiques, 1982. Cátedra de biotecnologia, biodiversidad & derecho, <http://www.biotech.bioetica.org>. Centro Virtual de Biotecnología para las Américas, <http://www.ibt.unam.mx/virtual.cgi>. Checkbiotech, <http://www.checkbiotech.org>. Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología, <http://www. argenbio.org/h/inicio/index.php>. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología, <http://www.conicet.gov.ar>. Conselho de Informações sobre Biotecnologia, <http://www.cib.org.br>. Council for Biotechnology Information, <http://whybiotech.com>. Da Silva, E. J. et al., “Biotechnology and the developing world”, EJB Electronic Journal of Biotechnology, 5(1), 15/04/2002. Disponible en <http://www.ejb.org/content/vol5/issue1/full/1>. Dellacha, J., “Interacción en Argentina de los sectores público y privado en el área de biotecnología”, disponible en <http://www.foarbi.org.ar>. 387 Biotecnología De Rosnay J., Biotechnologies et Bio-industrie. Document annexe au rapport “Sciences de la vie et Société”présenté para F.Gros, F.Jacob et P. Royer à Monsieur le Président de la République, París, Seuil, La Documentation Française, 1979. Díaz, A., Bio... ¿qué? Biotecnología, el futuro llegó hace rato, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2005. Díaz, A. y D. Golombek (comps.), ADN: 50 años no es nada, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. Doelle, H. W., “Biotechnology and Human Development in Developing Countries”, disponible en <www.ejbiotechnology.info/content/vol4/issue3/issues/02/>. Electronic Journal Of Biotechnology, <http://www.ejb.org>. European Initiative for Biotechnology Education, “Biotechnology: Past and Present (Unit 17)”, 1999, disponible en <http://www.rdg.ac.uk/NCBE/>. Foro Argentino de Biotecnología, <http://www.foarbi.org.ar>. Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada, Biotecnología y Sociedad, <http:// www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/biotecno.htm>. Lemaux, P., “What is Biotechnology”, disponible en <http://ucbiotech.org/resources/biotech/ slides/biotech.html>. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Mendel G., “Experimentos de hibridación en plantas”, en Sinnott E.W. et al., Principios de Genética. Barcelona, Ediciones Omega, 1961. Nature, <http://nature.com>. OECD, “Policy Brief: Modern Biotechnology and the OECD”, 1999, <http://www.oecd. org/ehs/icgb>. Office of Technology Assessment, “Commercial Biotechnology, an International Analysis”, Washington, US-Congress, 1984. Petrusansky, C., “Aspecto económico de la biotecnología en Argentina: un enfoque actualizado”, trabajo presentado en la XXI Asamblea Nacional de Graduados en Ciencias Económicas, 2005. Disponible en <http://www.foarbi.org.ar/ppal/documentos.php>. Por qué biotecnología, <http://www.porquebiotecnologia.com.ar>. Pownall, I. E., “An internacional political economic view of the biotechnology industry”, EJB Electronic Journal of Biotechnology, 3(2), 15/08/2000. Disponible en <http://www.ejb.org /content/vol3/issue2/full/7>. Prentis, S., Biotechnology: A New Industrial Revolution, Nueva York, George Braziller Inc., 1984. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Rifkin, J., El siglo de la biotecnología, Barcelona, 1998, Crítica-Marcombo. Rosen, M., “Biotech industry reaches midpoint in 50-year maturation cycle”, Wisconsin Technology Network, <http://wistechnology.com>. Sasson, A., Biotechnologies in Developing countries: present and future, París, Unesco, 2000. ——, Biotechnologies and Development. París, Unesco, 1988. Science, <http://www.science.org>. 388 Bibliografía Science and Development Network (SciDevNet), <http://www.scidev.net>. Sistema de Informacion Especializada de Biotecnologia y Tecnologia de Alimentos de Colombia <http://www.colciencias.gov.co/simbiosis/>. Subsecretaría de la Pequeña y Mediana Empresa y Desarrollo Nacional, “Biotecnología”, Serie de Estudios Sectoriales, enero 2005. Disponible en <http://www.proargentina.gov.ar>. The European Association for Bioindustries (Europa Bio), <http://www.europabio.org>. Verástegui, J. (ed.), “La biotecnología en América Latina: panorama al año 2002”, Ottawa, CamBioTec, idrc, 2003. Disponible en <http://concytec.gob.pe/cambiotec>. Walker, M., “Is modifying genes playing God?”, 18/03/2004, disponible en <http://www. checkbiotech.org>. Warner, S., “Biotech takes on new industries”, The Scientist, 19(4), 45, 2005, <http://www. the-scientist.com/article/display/15291/>. CAPÍTULOS II, III, IV, VI, VII Almeida Lima, U. (coord.), Biotecnologia Industrial. Processos Fermentativos e Enzimáticos, vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Amabis, J. M. y G. R. Martho, Fundamentos da Biologia Moderna, 3a ed., San Pablo, Editora Moderna, 2002. American Cancer Society, “Monoclonal antibody therapy”, disponible en <http://www.cancer. org>. American Society For Microbiology, <http://www.asmusa.org/edusrc/resources.htm>. Associação Nacional de Biossegurança (ANBIO) <http://www.anbio.org.br>. Balandrin, M. F. et al., “Natural plant chemicals: Sources of industrial and medicinal materials”, Science, 228, 1985, pp. 1154-1160. Basiro, D., Immunology, Londres, The Biochemical Society, 1994. Bernot, A., L´Analyse des Génomes, 2ª ed., París, Dunod, 1999. Biotechnology and Biological Sciences Reasearch Council, <http://www.bbsrc.ac.uk>. Bom, E. P. S y N. Pereira Jr., Tecnologia Enzimática, Río de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999. Bom, E. P. S. et al., Enzimas em biotecnologia, Río de Janeiro, Interciência, 2008. Borzani, W. et al. (coords.), Biotecnologia. Engenharia Bioquímica, vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 1975. Bourgaud, F. et al., “Production of plant secondary metabolites: a historical perspective”, Plant Science 161, 2001, pp. 839-851. Brock, T. D. y M. T. Madigan, Biology of Micoorganisms, New Jersey, Prentice-Hall International, 1988. Bullock, J. y B. Kristiansen, Basic Biotechnology, Londres, Academic Press, 1987. Callegari, J. P., “Feu vert sur les microalgues”, Biofutur, 2, 1989. Calva-Calva, G. et al., “Plantas como biorreactores para la producción de biomoléculas y la remocion de xenobióticos”, Avance y perspectiva, Nº 21, XXX Aniversario de Biotecnología y Bioingenieria, 2002. 389 Biotecnología Campbell, N., Biology, 4ª ed., San Francisco, The Benjamin-Cummings Publishing Company, 1996. Campbell, N. y J. Reece, Biology, 8ª ed., San Francisco, The Benjamin-Cummings Publishing Company, 2008. Center for Genetics and Society, <http://www.genetics-and-society.org>. Control Disease Center, “Summary of recommended biosafety levels for infectious agents”, disponible en <http://www.cdc.gov>. Cooper, G. M., La célula, Madrid, Marban Libros, 2002. Defuria, D. M., “Plant Cell Culture Technology”, disponible en <http://www.agbiotechnet. com/nabc/nabc8/contents_8.asp>. Depalma, A., “Cell Culture Scale Up Made Easier”, Drug Discovery & Development, <http:// www.ddmag.com>. Dodds, J. H. y L. W. Roberts, Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge, Cambridge University Press, 1995. Edwards, D. y J. Batley, “Plant bioinformatics: from genome to phenome”, Trends in Biotechnology, 22, p. 5, 2004. Emery, N. y P. Gerin, “De la cellule aux cellules em culture: Comment cultiver les cellules animales”, Biofutur, 184, 1998. Francis, A. L., “Pharmers Market”, 2000, en <http://www.the-scientist.com/yr2000/may/ profile_000501.html>. Frantz, S., “In vivo we trust”, 2003, en <http://www.nature.com/drugdisc/nj/articles/ nrd1127.html>. Gallagher, R. y J. M. Perkel, “Seven cheers for technology”, The Scientist, 19 (16), 2005. Gellon, G., El huevo y la gallina, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. Genomes online database, <http://www.genomesonline.org/gold.cgi>. Global Knowledge Center on Crop Biotechnology, “Microbial Fermentation Pocket Nº 20”, disponible en <http://www.isaaa.org/kc/>. Grosbras, M. H., “La cellule”, La Recherche, 288, 1996. Halvorson, H. O. et al., “Marine biotechnology opportunities for Latin America”, EJB Electronic Journal of Biotechnology, vol. 4 (2), 2003. Disponible en <http://www.ejbiotechnology. info/content/vol4/issue2/issues/03/index.html>. Harvard’s Biotechnology Club, <http://www.thebiotechclub.org>. Keshavarz, T., “Fermentation (Industrial): Control of Fermentation Conditions”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999. <http://www.foodscience.cornell.edu/ fs406/readings.html>. Kimball’s Biology Pages, <http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/w/welcome. html>. Kirkham, S., “The omic explosion: a brief history of –ome”, The Biochemist, 25 (1), 2003. Disponible en <http://www.biochemist.org>. Kitchen Culture, <http://www.turbonet.com>. Larpent-Gourgaud, M. y J. J. Sanglier, Biotechnologies. Principes et Méthodes, París, Doin Editeurs, 1992. 390 Bibliografía Lehninger, A. L., Princípios de Bioquímica, San Pablo, Ed. Sarvier, 1989. Linenberg, R. D., “The many dimensions of plant tissue culture research. Tissue culture of woody plants. Care and handling of micropropagated plants”, en <http://www. aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/ pltissue/pltissue.html>. Lucas, R., “Monoclonal Antibodies: Production and Applications”, NCBE Newsletter, primavera, 1989. Madden, D., “Genes in the wash”, NCBE Newsletter, primavera, 1991. ——, “In a jam and out of a juice”, NCBE Newsletter, invierno, 1991. Madigan, M. T. et al., Microbiologia de Brock, San Pablo, Pearson Prentice Hall, 2004. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Rio de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Mantell, S. H. et al., Princípios de biotecnologia em plantas, Sociedade Brasileira de Genética, 1994. Menezes, T. J. B., “Microbiologia Industrial”, en Tratado de Microbiologia. Vol. 1, San Pablo, Ed. Manole, 1988. Microbiology On-Line, <http://www.microbiologyonline.org.uk>. Misawa, M., “Plant Tissue Culture: An alternative for production of useful metabolites”, FAO Agricultural Services Bulletin, Nº 108, 1994. Disponible en <http://www.fao.org/docrep/ t0831e/t0831e00.htm#con>. National Institute of General Medical Sciences, “Inside the Cell”, disponible en <http:// www.nigms.nih.gov/news/science_ed/life.html>. National Institutes Of Health, “Stem cells: a primer”, disponible en <http://www.nih.gov>. National Biology Infrastructure Information, <http://www.nbii.gov/discipline/botany/ index.html>. Nature, “Tissue Engineering”, 2000. Disponible en <http://biotech.nature.com>. Novo Nordisk, A ação das Enzimas, Dinamarca, Novo Nordisk A/S, 1995. Orive, G. et al., “Controversies over stem cell research”, Trends in Biotechnology, 21, 3, 2003. Pawar, P. A. et al., “Fermentation (Industrial): Recovery of metabolites”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999. Disponible en <http://www.foodscience. cornell.edu/fs406/readings.html>. Pelczar, M. J. et al., Microbiologia, Conceitos e Aplicações, San Pablo, Makron Books do Brasil, 1997. Pierik, R. L. M., Cultivo in vitro de las plantas superiores, Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990. Pires, Augusto E. F. y M. Simões Oliveira, “Processos com células animais”, en Biotecnologia Industrial. Processos Fermentativos e enzimáticos. Vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Pittsburg Tissue Engeneering Initiative, “About Tissue Engeneering”, disponible en <http:// www.ptei.org/about_te/index.html>. Playfair, J. H. L., Imunology at a Glance, 6ª ed., Blackwell Science, 1996. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Ridley, M., Genoma. La autobiografía de una especie en 23 cromossomas, Madrid, Grupo Santillana de Ediciones, 2000. 391 Biotecnología Sanchez, S., “Ecology and Industrial Microbiology. Microbial diversity-The bright and promising future of microbial manufacturing”, Current Opinion on Microbiology, 8, 2005, pp. 229-233. Schindle, L. et al., “Understanding the Immune System”, 2001. Disponible en <http:// newscenter.cancer.gov/sciencebehind/uis/uishome.htm>. Schloss, P. D. y J. Handelsman, “Biotechnological prospects from metagenomics”, Current Opinion on Microbiology, 14, 2003, pp. 303-310. Schmidell, W. et al. (coords.), Biotecnologia Industrial. Engenharia Bioquímica. Vol. 2, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Science in the Real World: Microbes in Action, <http://www.umsl.edu>. Scriban, R. (coord.), Biotecnología, San Pablo, Ed. Manole, 1985. Sigma, Aldrich, “Fundamental techniques in cell culture: A Laboratory Handbook”, 2003. Disponible en <http://www.sigmaaldrich.com>. Stem Cell Web Focus, <http://www.nature.com/nature/stemcells>. Streit, W. R. y R. A. Schmitz, “Metagenomics, the key to uncultured microbes”, Current Opinion on Microbiology, 7, 2004, pp. 492-498. Sulston, J. y G. Ferry, El hilo común de la humanidad, Madrid, Siglo XXI Editores, 2003. Taubes, G., “Antibody Drug Revival”, Technology Review, 2002. Disponible en <http://www. technologyreview.com>. Teixeira, P. y S. Valle, “Riscos biológicos em laboratório de pesquisa”, en Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar, Río de Janeiro, Ed. Fiocruz, 1996. Texas Horticulture Program, <http://aggie-horticulture.tamu.edu>. The Big Picture Book Of Virus, <http://www.tulane.edu>. The Biotechnology Institute, Your world, Biotechnology and you: Tissue Engineering, vol. 7, Nº 1, 1997. The Wellcome Trust, “New Biology and Society: beyond the genome”, Labnotes 2, 2000. Disponible en <http://www.wellcome.ac.uk>. The Microbial World, <http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/>. Torres, A. C. et al., Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Vol. 1, Brasilia, Embrapa-cbab, 1998. Universidade do Algarbe, “Algas; aspectos gerais, aplicações tecnológicas e uso comercial”. Disponible en <http://www.mar-alto.com/biologia/algas.shtml>. University of Wisconsin, Madison, “Embryonic stem cells”. Disponible en <http://www. news.wisc.edu/packages/stemcells/index.html>. Virtual Museum of Bacteria, <http://www.bacteriamuseum.org>. Walker, G., “Fermentation (Industrial): Media for Industrial Fermentations”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999. Disponible en <http://www.foodscience. cornell.edu/fs406/readings.html>. Welcome to the World of Algae, <http://www.botany.uwc.ac.za/algae>. Wymer, P. E. O., Enzymes and their role in Biotechnology, Londres, The Biochemical Society. Yussuf, C., “Fermentation (Industrial): Basic Considerations”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999. Disponible en <http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/ readings.html>. 392 Bibliografía CAPÍTULOS V, VIII, IX Access Excellence (The National Health Museum), <http://www.accessexcellence.com>. Alcamo, I. E., DNA Technology: The awesome skill, Dubuque, C. Brown Publishers, 1996. Bento Farra, S., DNA, Segredos e Misterios, San Pablo, Sarvier Ed., 1997 y 2008. Biotechnology Australia, “The tools of gene technology”. Disponible en <http://www. biotechnology.au>. Biotechnology Online, <http://www.biotechnology.gov.au/biotechnologyOnline/index.htm>. Borzani, W. et al. (coords.), Biotecnologia Industrial. Fundamentos. Vol. 1, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Brock, T. D. y M. T. Madigan, Biology of Micoorganisms, New Jersey, Ed. Prentice-Hall International, 1988. Brush, M., “Making sense of microchip array data”, 2001. Disponible en <http://www. the-scientist.com/yr2001/apr/profile_010430.html>. Bryce, C. F. A. y D. Pacini, The structure and function of nucleic acids, Londres, The Biochemical Society, 1998. Chua, J., “A buyer’s guide to DNA and RNA prep kits”, The Scientist, 18, 3, 2004. Constans, A., “The Microarray in Functional Genomics and Proteomics”, The Scientist, vol. 17, 3, 2003. Disponible en <http://www.the-scientist.com/yr2003/feb/lcprofile_ 030210.html>. ——, “State of the microarray: challenges and concerns with microarrays”, The Scientist. Disponible en <http://www.the-scientist.com/yr2003/feb/lcprofile_030210.html>. Cooper, G. M., La célula, Madrid, Marbán Libros, 2002. Da Silveira, J. M. F. J. et al. (orgs.), Biotecnologia e Recursos Genéticos. Desafios e Oportunidades para o Brasil, Campinas, Instituto de Economia-finep, 2004. De Weerdt, S. E., “What´s a genome?”, 2001. Disponible en <http://www.celera.com>. Dixon, B., “Genetics and the Undestanding of Life”, Birmingham, XVIIth International Congress of Genetics, 1993. DOE Human Genome Program, <http://www.er.doe.gov/production/oher/hug_top.html>. Dolan DNA Learning Center, Cold Spring Harbor Laboratory, <http:// www.dnalc.org>. Exploratorium, <http://www.exploratorium.org>. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, “Genetica molecular e tecnologia do DNA-recombinante”. Disponible en <http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila.php>. Genetic Science Learning Center, University Of Utah, <http://www.utah.edu>. Genetics Education Center, University of Kansas Medical Center, <http://www.kumc.edu>. Gwynne P. y G. Heebner, “Technologies in DNA chips and Microarrays II”, 2001. Disponible en <http://www.sciencemag.org/feature/e-market/benchtop/technologies_dnachips.shl>. ——, “Technologies in DNA chips and microarrays I”, 2001. Disponible en <http://www. sciencemag.org/feature/e-market/benchtop/dnamicro.shl>. ——, “Laboratory instrumentation and robotics”, 2000. Disponible en <http://www. sciencemag.org/feature/e-market/benchtop/labl.shl>. Houdebine, L. M., “La transgénèse animale et ses applications”, INRA, Prod.Anim. 11(1), 1998, pp. 81-94. 393 Biotecnología Human Genome Project Information, <http://www.ornl.gov/TechResources/Human_ Genome/home.html>. Kimball’s Biology Pages, <http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/>. Kornberg, A., La hélice de oro. Aventuras biotecnológicas: el recorrido de la ciencia a los negocios, Buenos Aires, Universidad Nacional de Quilmes, 2001. Larpent-Gourgaud, M. y J. J. Sanglier, Biotechnologies. Principes et Méthodes, París, Doin Editeurs, 1992. Lewis, R., Human Genetics: Concepts and applications, 4ª ed., Nueva York, The Mc Graw Hill Higher Education, 2001. Madden, D., “Essential genetic engeneering”, Newsletter, Nº 9, NCSB, Reading, 1990. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Melcher, U., “Molecular Genetics Techniques”, 2001. Disponible en <http://unige.ch/sciences/ biochimie/edelstein/geneframe/>. Moore, P., Recombinant DNA Technology, Londres, Biochemical Society, 1994. National Center for Biotechnology Information, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>. National Center for Human Genome Research, <http://www.nchgr.nih.gov>. National Health & Genetics Research Institute, “Fact Sheets”. Disponible en <http://www. genome.gov/10000202>. Nature, <http://www.nature.com>. New Scientist, <http://www.newscientist.com>. Nicholl, D. S. T., An Introduction to Genetic Engeneering, Cambridge, Cambridge University Press, 1994. NIH Office Of Science Education, “DNA chips: a genetics lab in the palm of your hand”, Snapshots of Science and Medicine, vol. 1, Nº 2. Disponible en <http://science-education. nih.gov/snapshots>. Oliveira Dos Santos, A. J., “Animais transgênicos e nocautes: soluções para muitos enigmas”, Ciência Hoje, vol. 25, Nº 146, 1999. Pietszsch, J., “Understanding the RNAissance”, 2003. Disponible en <http://nature.com/ horizon/rna/background/understanding.html>. Powledge, T., “The Polymerase Chain Reaction”, 2002. Disponible en <http://www.faseb. org/opar/bloodsupply/pcr.html>. Prentis, S., Biotechnology: a new industrial revolution, Nueva York, George Braziller, 1984. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Schenberg, A. C., “Elementos de Engenharia Genética”, en Biotecnologia Industrial. Fundamentos. Vol. 1, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Shi, L., “DNA Microarray (genome chip)”, 2002. Disponible en <http://www.gene-chips. com/>. Suzuki, D. et al., Introdução à Genética, 4ª ed., Río de Janeiro, Ed. Guanabara-Koogan, 1992. The Wellcome Trust, “Unveiling the Human Genome”, Wellcome News, 4, 2001. Disponible en <http://www.welcome.ac.uk>. University of Arizona, <http://www.arizona.edu>. 394 Bibliografía University of Buffalo, “Genomic Analysis –DNA fingerprinting”, 2002. Disponible en <http://www.biology.buffalo.edu/courses/bio129/nov19.html>. University of Washington, “Southern Blot”. Disponible en <http://www.biology.washington. edu/fingerprint/blot.html>. White, B., “Southerns, Northerns, Westerns & Cloning: ‘Molecular Searching’ Techniques. Winding your way through DNA”, 1995. Disponible en <http://www.mit.edu:8001/ esgbio/rdna/rdna.html>. Winstead, E., “The Evolving Art of Arrays”, 2000. Disponible en <http://www.celera.com/ genomics/news/articles/09_00/evolving_arrays.cfm>. CAPÍTULOS X, XI Acevedo, F., “Present and future of bioleaching in developing countries”, EJB - Electronic Journal of Biotechnology, vol. 5, Nº 2, 2002, en <http://www.ejb.org/contrnt/vol5/issue2/ issues/01/index.html>. Agrobio Colombia, <www.agrobio.org>. Almeida Lima, U. et al. (coords.), Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Anciães, W. y J. E. Cassiolato, Biotecnologia: sus impactos no setor industrial, Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico, 1985. Andrade, G., “Biotecnologia e meio Ambiente”. Disponible en <http://www.cib.org.br>. Associação Brasileira de Quimica Fina, <http://www.abrifina.org.br>. Avellar, L. H. N. et al., “Geração de eletricidade com biogás de esgoto: uma realidade”. Disponible en <http://www.biotecnologia.com.br/bio29/geração.html>. Badger, P. C., “Ethanol from cellulose: a general review”, en Janick, J. y A. Whipkey (eds.), Trends in new crops and new uses, Alexandria, ASHS Press, 2002. Banco Mundial, “El problema de la administración de residuos sólidos (SWM)”. Disponible en <http://bancomundial.org.ar/lfg/gas_expo2005_es.htm>. Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social (bndes), Centro de Gestão e Estudos Estratégicos, Bioetanol de cana-de-açúcar. Energia para o desenvolvimento sustentável, Río de Janeiro, 2008. Disponible en <http://www.bioetanoldecana.org>. Belgo Biotech, “Bioprocesses”. Disponible en <http://www.belgobiotech.be>. Bhattacharyya, B. C. y R. Banerjee, Environmental biotechnology, Nueva Delhi, Oxford University Press, 2007. Biodieslbr.com, <http://www.biodieselbr.com/biodiesel/biodiesel.htm>. Bioplanet, <www.bioplanet.net>. Bioportal. Biopolymers and Bioplastics, <http://www.bioportal.gc.ca>. Biotecnologia: Ensino e Divulgação, <http://www.bteduc.bio.br>. Biotechnology and Biological Sciences Research Council, <http://www.bbsrc.ac.uk>. Biotechnology and Industry Organization, “Industrial and environmental applications”. Disponible en <http://www.bio.org>. Biotechnology and Industry Organization (bio), Guide to Biotechnology, 2008. 395 Biotecnología Biotimes, <http://www.biotimes.com>. Bio-Wise – Biotechnology at Work, <http://www.dti.gov.uk/biowise>. Borém, A. y F. R. Dos Santos, Biotecnologia Simplificada, Viçosa (Minas Gerais), Universidade Federal de Viçosa, 2001. Bom, E. P. S. y N. Pereira Jr., Tecnologia Enzimática, Río de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999. Bom, E. P. S. et al., Enzimas em biotecnologia, Río de Janeiro, Interciência, 2008. Bthek Biotecnologia, <http://www.bthek.com.br>. Bud, R., The Uses of Life: a history of Biotechnology, Cambridge, Cambridge University Press, 1993. Bull, A.T. et al., Biotechnologie: Tendances et perspectives internationales, Organisation de Coopération et de Développement Economiques, 1982. Bullock, J. y B. Kristiansen, Basic Biotechnology, Londres, Academic Press, 1987. Campos Ferreira, O., “Avaliação preliminar do potencial de produção de etanol da cana de açúcar”, 2002. <http://ecen.com/eee34/limites_alcool.htm>. CECAE - Disque Tecnologia da Universidade de San Pablo, “Biodigestores”. <http://www. cecae.usp.br/Aprotec/respostas/RESP64.htm>. Centro Nacional de Referência em Biomassa, <http://www.cenbio.org.br>. Cevallos, D., “De gas invernadero a estrella de mercado”. Disponible en <http://www. tierramerica.net/2004/1218/articulo.shtml>. Checkbiotech, <http://www.checkbiotech.org>. Clayton, M., “Now, bioengineered trees are taking root”, consulta 10/03/2005, <http://www. checkbiotech.org>. Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental, “A produção mais limpa no setor sucroalcooleiro”, Câmara Ambiental do Setor Sucroalcooleiro. <http://www.cetesb. sp.gov.br>. ——, Opções para tratamento de esgotos de pequenas comunidades, San Pablo, Secretaria do Meio Ambiente, 1990. Corporación Nacional del Cobre de Chile, <http://www.codelco.com>. Council of the European Union, A Knowledge-Based-Bio-Economy in 2030. En route to the knowledge-based bio-economy, Cologne paper, 2007, <http://www.bioeconomy.net>. De Araujo, S. C., “A inoculação de leguminosas”, <http://www.biotecnologia.com.br/revista/ bio03/3hp_2.asp>. Dellomonaco, C. et al., “The path to next generation biofuels: successes and challenges in the era of synthetic biology”, Microbial cell factories, 9 (3), 2010, <http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/3>. Demain, A. L., “The business of biotechnology”, Industrial Biotechnology, 3 (3), 2007, pp. 269-283. Di Ciero, L. y W. Amaral, “Árvores geneticamente modificadas na silvicultura intensiva”, Biotecnologia, Ciencia e Desenvolvimento, 29, pp. 92-98. El Fantroussi, S. y S. N. Agathos, “Is bioaugmentation a feasible strategy for pollutant removal and site remediation?”, Current Opinion in Microbiology, 8, 2005, pp. 268-275. 396 Bibliografía Environmental Protection Agency, <http://www.epa.gov>. Environmental Science & Technology, <http://pubs.acs.org/journals/esthag/>. Europabio, “White Biotechnology: Gateway to a more sustainable future”. Disponible en <http://www.europabio.org>. European Federation of Biotechnology, “Environmental Biotechnology”, Task Group on Public Perceptions of Biotechnology, Briefing Paper 4, 1999. European Bioplastics, Bioplastics at a glance, <http://www.european-bioplastics.org>. European Comission, Biofuels in the European Union: A vision for 2030 and beyond. Final report of the Biofuels Research Advisory Council, Bruselas, 2006, <http://www.biofuelstp. eu/downloads/biofuels_vision_2030_en.pdf>. European Molecular Biology Organization (embo), “White biotechnology”, EMBO Reports, 4 (9), 2003. Food and Agriculture Organization of The United Nations (fao), The state of food and agriculture. Biofuels: prospects, risks and opportunities, Roma, 2008, <http://www. fao.org>. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (fapesp), <http://www.fapesp.br>. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (faperj), <http://www.faperj.br>. Galperin, M.Y. y A. J. M. Baker, “Environmental Biotechnology. From biofouling to bioremediation: the good, the bad and the vague”, Current Opinión in Microbiology, 15, 2004, pp. 167-169. Goldenberg, J., “Support Report for The Brazilian Energy Initiative”, World Summit On Sustainable Development, Johannesburg, South Africa, 26 de agosto a 4 de septiembre 2002. Goldenberg, J., “The brazilian biofuels industry”, Biotechnology for biofuels, 1 (6), 2008. —— y F. Brinkman, “Biotechnology and the environment. Unit 16”, European Initiative for Biotechnology Education, 2000. Grant, W. D. y P. E. Long, Microbiologia ambiental, Zaragoza, Editorial Acribia, 1989. Grant, B., “Future oil”, The Scientist, 23 (2), 2009. Greer, C. W. et al., “Genomics technologies for environmental science”, Environmental Science and Technology, 35:17, 2001. Gupta, M. N. y S. Raghava, “Relevance of chemistry to white biotechnology”, Chemistry Central Journal, 1 (17), 2007. Harris, P., “Beginners Guide To Biogas”, The University of Adelaide. Disponible en <http:// www.roseworthy.adelaide.edu.au/~pharris/biogas/beginners.html>. ——, Beginners Guide To Biogas, The University of Adelaide, <http://www.roseworthy.adelaide.edu.au/~pharris/biogas/beginners.html>. Henrikson, R., Biofuels from Algae? How ventures can harvest from the third great algae boom, 2009, <http://www.spirulina.com>. Hilbert, J. A., “Biomasa. La columna del especialista”, en <http://www.oni.escuelas. edu.ar/2004/GCBA/444/bio/bio_029.htm>. Holding, K., “Finding promise in white rot”, 5/5/2004, <www.biomedcentral.com/news/>. Industrial and Environmental Biotechnology: Implications for Trade and Development, “Informal note by the UNCTAD secretariat”. Disponible en <http://r0.unctad.org/trade_ env/docsbio/note.PDF>. 397 Biotecnología Industry and Environment, <http://www.unep.fr/media/review/ie_home.htm>. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (isaaa), “Biotech plants for bioremediation”, Pocket K, N° 25, <http://www.isaaa.org/resources/publications/pocketk/25/default.asp>. Jerez Guevara, C., “¿Has oído hablar de biolixiviación?”, <http://explora.cl/otros/biotec/ biolixi.html>. Larpent-Gourgaud, M. y J. J. Sanglier, Biotechnologies. Principes et Méthodes, París, Doin Editeurs, 1992. Lehmann, V., “Bioremediation: a solution for polluted soils in the south?”, Biotechnology and Development Monitor, N° 34, 1998. Lemos, M. V. F., “Novas tecnologias: controle biológico por Bacillus thuringiensis”. <http:// www.biotecnology.com.br/bio/hp_5.htm>. Leung, M., “Bioremediation: Techniques for cleaning up a mess”, BioTeach Journal, 2, 2004, pp. 18-22. Life Science Online, “Review on the Enzyme Market”, <http:// www.lifescience-online.com>. Lippel Santánna Jr., G., “Produção de enzimas microbianas”, en Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Levy, M., Tópicos em Química Fina, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 1987. Lorenz, P. y H. Zinke, “White biotechnology: differences in US and EU approaches?”, Trends in Biotechnology, 23 (12), 2005. Lorenzo, V. de, “Cleaning up polluted environments: how microbes can help. Research on safety of genetically modified organisms - a review of results”, European Comission, <http://ec.europa.eu/research/quality-of-life/gmo/05-bioremediation/05-intro.htm>. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior, Papel e celulose, <http:// www.desenvolvimento.gov.br/arquivo/sdp/proAcao/forCompetitividade/impZonLivComercio/ 12papelceluloseresumo.pdf>. National Science and Technology Council (nstc), Biotechnology Research Subcommittee, Biotechnology for the 21st century: new horizons, Cap. 3: “Opportunities in Environmental Biotechnology”, 1995. Disponible en <http://www.nal.usda.gov/bic/bio21/>. Noticiasdot.Com, “Argentinos inventan sistema biológico para eliminar pilas usadas”, 16/9/2003, <http:// www.noticias.dot>. Novozymes, “Discover the magic of enzymes”. Disponible en <http://www.novozymes. com>. OECD Observer, “Biotechnology and industry: a union of promise”, marzo 1, 1999. <http:// www.oecdobserver.org>. Office Of Technology Assessment, U.S. Congress, “The Chemical Industry”, Biotechnology in a global economy. Chapter 7. Washington, DC, U.S. Government, OTA-BA-494, octubre 1991. <http://wws.princeton.edu/cgi-bin/byteserv.prl/~ota/disk1/1991/9110/911002.pdf>. Organisation for Economic Co-Operation and Development, “Industrial Sustainability through Biotechnology”, 2001. <http://www1.oecd.org/publications/e-book/9301061e.pdf>. 398 Bibliografía Organisation for Economic Co-Operation and Development (oecd)- International Energy Agency (iea), From 1st to 2nd generation biofuel technologies. An overview of current industry and RD&D activities, París, noviembre 2008, <http://www.iea.org/papers/2008/2nd_ Biofuel_Gen_Exec_Sum.pdf>. Packaging Digest Staff, “Bioplastic industry defies economic crisis”, Packaging Digest, <11/2/2010. www.packagingdigest.com/.../448926-Bioplastic_industry_defies_economic_crisis.php>. Park, Y. K., “Produção de enzimas industriais de origem animal”, en Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. ——, “Produção de enzimas industriais de origem vegetal”, en Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol. 3, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Paster, M. et al., Industrial bioproducts: today and tomorrow, Columbia, Maryland 2003, <http://webdev.its.iastate.edu/webnews/data/site_biorenew_reading/30/webnewsfilefield_file/Industrial-Bioproducts-2003.pdf>. Pellon, J. R., La ingenieria genética y sus aplicaciones, Zaragoza, Editorial Acribia, 1986. Petrobras, <www.petrobras.com.br>. Plant Biotechnology Institute – National Research Council Canada, The environment: Plants and Microrganisms to control Pollution, septiembre 1998. Portal do Biodiesel, <http://www.biodiesel.gov.br>. Prentis, S., Biotechnology: A New Industrial Revolution, Nueva York, George Braziller, 1984. Programa Nacional de Uso do Biodiesel, <http://www.biodiesel.gov.br>. Ravenstijn, J., The state of the art on bioplastics, 1/2010, <http://beheer.lifetecvision.com/ upload/Report/Summary/f8ee23e0-f446-42fa-b26c-fa689fa8754b.pdf>. Redbio/FAO, “Biotechnology: biofuels”, <http://www.redbio.org/newsredbio.asp?id=231>. Rehm, H. J. y G. Reed, “Microorganisms and Bioremediation”, Biotechnology, vol. 11b, 2ª ed., WILEY-VCH Verlag GmbH, 2000. Disponible en <http://www.wiley-vch.de/ books/biotech/pdf/v11b_gene.pdf>. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Revista Exame, “Uma nova corrida do ouro”, 4/6/2004, <www.cib.org.br>. Revista Minería Chilena, <http://www.editec.cl/mchilena/>. Riese, J., White Biotechnology, McKinsey, Company Press Briefing, 2009. Royal Belgian Academy Council of Applied Science, “Industrial biotechnology and sustainable chemistry”, Bruselas, 1/2004, <http://www.massey.ac.nz/~ychisti/IndBiotech.pdf>. Royal DSM N.V., “Industrial (White) Biotechnology DSM, Position document on industrial biotechnology in Europe and the Netherlands”, <http://www.europabio.org/ positions/DSM-WB.pdf>. Sasson, A., “Industrial and Environmental Biotechnology: achievements, prospects and perceptions”, UNU-IAS Report, 2005. Disponible en <www.ias.unu.edu>. Saviotti P. P. et al., “Biotechnology. A report for the key technologies expert group appointed by the European Commission”, 2005, <ftp://ftp.cordis.lu/pub/foresight/docs/kte_biotechnology.pdf>. Schachter, B., “Slimy business-the biotechnology of biofilms”, Nature Biotechnology, 21 (4), pp. 361-364. 399 Biotecnología Scragg, A., Biotecnologia Medioambiental, Zaragoza, Editorial Acribia, 1999. Sollod, A. y D. Proulx, “Global Contamination, Wildlife Health and Biotechnology”, 1998, <http://biotech.icmb.utexas.edu/pages/wildlife.html>. Sorima Neto, J. et al., “A revolução da cana”, revista Época 24/10/2005, <http://revistaepoca. globo.com/Epoca/0,6993,EPT1057925-3771,00.html>. Stanford Encyclopedia of Philosophy, “Environmental Ethics”, <http://plato.stanford.edu/ entries/ethics-environmental>. Sutherland, I., “A sticky business; microbial polysaccharides: current products and future trends”, Microbiology Today, 29 (5), 2002, pp. 70-71. Teixeira Alves, R., Controle biológico de insetos-praga na agropecuária do Brasil. Portal do Agronegócio, 28/08/2009, <http://www.portaldoagronegocio.com.br/conteudo. php?id=31940>. The Council For Chemical Research, “Technology Vision 2020: The U.S. Chemical Industry”, 2002. Disponible en <http://www.ccrhq.org/vision/>. União da Agroindústria Canavieira de São Paulo, <http://www.unica.com.br>. Universidad Nacional de La Plata, “Biolixiviación y biorremediación”, <http://ar.geocities. com/biolixiviacion>. University of Princeton, Bioremediation, <http://www.princeton.edu/~chm333/2004/ Bioremediation/index.html>. U.S. Department Of Energy, Office of Biological and Environmental Research. <http://www. er.doe.gov/production/ober/ober_top.html>. U.S. Environmental Protection Agency, “A Citizen’s Guide to Bioremediation”. Disponible en <http://www.epa.gov/swertio1/products/citguide/biorem.htm>. ——, <http://www.epa.gov/epahome/educational.htm>. U.S. Geological Survey, “Bioremediation: Nature’s way to a cleaner environment”. Disponible en <http://water.usgs.gov/wid/html/bioremed.html>. Van Der Lelie, D. et al., “Assessing phytoremediation’s progress in the United States and Europe”, ES & T 35, 446-52A, 2001. Van Hemelrijck, J., Biotechnology: based on life science- the invisible revolution, Cordia Opening Plenary, 2005. Disponible en <http://www.europabio.org/documents/ CORDIA2005speech.pdf>. Vazoller, R. F., “Microbiologia e Saneamento ambiental”, <http://www.bdt.org.br/ publicações/padct/bio/cap9/3/rosana.html>. Verstraete, W., “Energy and the entropy business”, Nature, 17, supplement, 1999. Vidali, M., “Bioremediation. An overview”, Pure Appl. Chem., 73 (7), 2001, pp. 1163-1172. Wall, L., Plantas, bacterias, hongos: mi mujer, el cocinero y su amante, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002. Whitfield, J., “Vital signs”, 2001. <http://www.nature.com/nsu/010705/010705-2.html>. Wiseman, A., Principios de biotecnología, Zaragoza, Editorial Acribia, 1986. Zender, A. J. B. y H. Wulff, “Business and the environment”, Nature Biotechnology, vol. 17, supplement, 1999. Disponible en <http://biotech.nature.com>. 400 Bibliografía CAPÍTULOS XII, XIII, XIV Action Bioscience, “Biodiversity”, <http://www.actionbioscience.org/biodiversity>. Action Group on Erosion, Technology and Concentration. “Oligopolio, Inc. Concentración del Poder Corporativo: 2005”, Communiqué, Nº 91, noviembre-diciembre 2005, <www. etcgroup.org>. Adams, W. M. et al., “Biodiversity conservation and the eradication of poverty”, Science, 306, 2004, pp. 1146-1149. Agbios, <http://www.agbios.com>. Agricultural Biotechnology in Europe, <http://www.abeurope.info>. Agrobio – México, <http://www.agrobiomexico.org>. Agrolink, <http://www.agrolink.com.br>. Alcamo, I. E., DNA Technology: The awesome skill, Dubuque, C. Brown Publishers, 1996. Altman, A., “Biotechnology in the 21st century: the challenges ahead”, EJB, 2 (2), 1999. Disponible en <http://www.ejb.org/content/vol2/issue2/full/1/>. Alves Nunes Dode, M. y R. Rumpf, “Produção in vitro de embriões na espécie bovina”, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, Nº 26, 2002. Amancio, M. C., “Legislação de biossegurança no Brasil”, disponible en <http://www.cib. org.br>. Argandoña, G., “Vaccine could save Chile’s salmon industrymillions”, 26/10/2004. Disponible en <http://www.scidev.net>. ARGENBIO, <http://www.argenbio.org>. Asociación Argentina de Productores en Siembra Directa, <http://www.aapresid.com.ar>. Asociación de Semilleros Argentinos, <http://www.asa.org.ar>. Association Française des Biotechnologies Végétales (afbv), <http://www.biotechnologiesvegetales.com>. Associação Brasileira de Sementes e Mudas, <http://www.abrasem.com.br>. Associação Nacional de Biosegurança, <http://www.anbio.org>. Azevedo, V., “Aplicações da Biotecnologia na área animal”. Disponible en <http://www. cib.org.br>. Barros, A. C. S. A., “Produção de sementes na América do Sul”, Revista Seed News, ix, 3, 2005. Bento Farah, S., DNA, Segredos e Mistérios, San Pablo, Sarvier Ed., 1997. Bioceres, <http://www.bioceres.com.ar/>. Bioplanet, <www.bioplanet.net>. Biotech Knowledge Center, <http://www.biotechknowledge.com>. Biotechnology Industry Organization, <http://www.bio.org>. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Bodnar, A., “Risk assessment and mitigation of AquAdvantage salmon”, ISB News Report Special Issue, Agricultural and Environmental Biotechnology, octubre de 2010, <http:// www.aquabounty.com/documents/corporate/Risk_Assessment_Mitigation_of_AAS. PDF>. Borém, A., Escape gênico e transgênicos, Viçosa, 2002. 401 Biotecnología —— (ed.), “Cultivares e genes”, Biotecnologia, Ciência, Desenvolvimento, 32, enero-junio, 2004. ——, Biotecnologia e meioambiente, Viçosa, Editora Folha de Viçosa, 2005. Borlaug, N., “Is there enough food?”, 2000. <http://www.whybiotech.com>. Bradford, K. J., “Methods to maintain genetic purity of seeds stocks”, Agriculture biotechnology in California Series, 8189, University of California, Division of Agriculture and Natural Resources, 2006, <http://anrcatalog.ucdavis.edu>. Braun R. y K. Ammann, “Biodiversity: the impact of biotechnology”, Encyclopedia of Life support systems, Oxford, EOLSS Publishers, 2002. Disponible en <http://www.colby. edu/biology/BI131/Lab/Unesco-Biodiv-Biotech.pdf> Brooklyn Botanical Garden, <http://www.bbg.org>. Burachik, M., “Seguridad de los Organismos Genéticamente Modificados: el caso de la soja GM en la Argentina. Soja y Nutrición”, Serie de Informes Especiales, ILSI Argentina, vol. 1, 2004. ——, “Sistema Regulatorio argentino – Panorama Internacional”, en Biotecnología y mejoramiento vegetal, Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, 2005. Disponible en <http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro/39_IX_2.pdf>. Butzen, S., “Preserving Bt effectiveness by managing insect resistance”, Crop insights, 11(20), 2002. Disponible en <http://www.pioneer.com/usa/agronomy/corn/1120.htm>. Cabinet Office, “Weighing up the costs and benefices of GM crops”, 2003. Disponible en <http://www.strategy.gov.uk>. Campbell, N. A., Biology, 8ª ed., San Francisco, The Benjamin-Cummings Publishing Company, 2008. Canola Council of Canada, <http://www.canola-council.org>. Carpenter, J. E. y L. P. Gianessi, “Agriculturalbiotechnology: updated benefit estimates”, National Center for Food and Agricultural Policy, 2001. Disponible en <http://www. ncfap.org>. Casale, M. G., “Aplicaciones de la soja en la tecnología alimentaria. Soja y Nutrición”, Serie de Informes Especiales, ILSI Argentina, vol. 1, 2004. Casals Cirer, J., “Biotecnología por la senda correcta”, Bioplanet. Disponible en <www. bioplanet.net>. Cavitte, P., “Une histoire de l’agriculture française”, Bulletin de l’Association des Professeurs d’Histoire et de Géographie de l’Enseignement Agricole Public, Hiver 2000-2001. Disponible en <http://www.educagri.fr/pedago/supports/histagri/sommaire.htm>. Ceccatti, J., “Resisting insects: shifting strategies in chemical control”, Endeavour, 28 (1), 2004. Centro Internacional de la Papa, <http://www.cipotato.org>. Centro para Avaliação de Risco Ambiental (cera), <http://www.cera-gmc.org>. Chevassus-au-Louis, N., “La bataille non terminée de terminator”, La Recherche, 327, 2000, pp. 80-81. Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (ctnbio), <http://bch.ctnbio.gov.br>. Conner, A. J. et al., “The release of genetically modified crops into the environment. Part II. Overview of ecological risk assessment”, The Plant Journal, 33, 2003, pp. 19-46. 402 Bibliografía Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología, <http://www. argenbio.org/h/inicio/index.php>. Conselho de Informações sobre Biotecnologia (cib), <http:www.cib.org.br>. Consultative Group on International Agricultural Research (cgiar), <http://www.cgiar.org>. Convention on Biological Diversity, <http://www.cbd.int>. Cook, J. R., “Science-based risk assessment for the approval and use of plants in agricultural and other environments”, en Agricultural biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology, Consultation Group on International Agricultural Research, 1999. Disponible en <http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm>. Corporate Watch, “GM crops industry overview”, 2003. Disponible en <http://www. corporatewatch.org>. Council for Biotechnology Information, “Biotecnología agrícola en México”. Disponible en <http://whybiotech.com/mexico.asp>. ——, “Golden Rice: a background”, 2001. Disponible en <http://www.whybiotech.com>. Cubero, J. I., “Panorâmica de la agricultura a comienzos del siglo XXI”, en La agricultura del siglo XX, Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1993. Derbyshire, S.W. G., “Time to abandon the three Rs”, The Scientist, 20, 2, p. 23. Disponible en <http://www.the-scientist.com/2006/2/1/23/1/>. Dhlamini, Z., “The role of non-GM biotechnology in developing world agriculture”, SciDevNet, 12/2/2006. Disponible en <http://www.scidev.net>. Diamante A. y J. Izquierdo, “Manejo y gestión de la biotecnología agrícola apropiada para pequeños productores. Estudio de caso: Argentina”, Buenos Aires, 2004. Disponible en <http://www.redbio.org>. Diamond, J., “Evolution, consequences and future of plant and animal domestication”, Nature, 418, 2002, pp. 700-707. Díaz, A., “Estudios sobre el sector agroalimentario”. Disponible en <http://www.mecon. gov.ar/>. Dickson, D., “The case for science-based agriculture”, SciDevNet, 8/2/2006. Disponible en <http://www.scidev.net>. Echenique, V. et al. (eds.), Biotecnología y mejoramiento vegetal, Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, 2005. Ellstrand, N. C., “Genetic Engineering and pollen flow”, Agriculture biotechnology in California Series, 8182, University of California, Division of Agriculture and Natural Resources Publication, 2006, <http://anrcatalog.ucdavis.edu>. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, <http://www.embrapa.br>. Environmental Media Services, <http://www.ems.org>. Esquinas-Alcázar, J. T., “La diversidad genética como material básico para el desarrollo agrícola”, en La agricultura del siglo XXI, Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1993. Europabio, <http://www.europabio.org>. Evenson, R. E., “From the green revolution to the gene revolution”, en Economic and social issues in agricultural biotechnology, cab International, 2002. Federation of Animal Science Societies (fass), <http://www.fass.org/index.asp>. 403 Biotecnología Fletcher, G. L. et al., “Transgenic salmon for culture and consumption”. Disponible en <http://www-heb.pac.dfo-mpo.gc.ca/congress/2002/Biochem/fletcher.pdf>. Florigene, “The world’s first molecular breeder”. Disponible en <http://www.florigene.com. au>. Food and Agriculture Organization, “Selected issues in agricultural technology”, en World Agriculture: towards 2015/2030, 2003. Disponible en <http://www.fao.org/DOCREP/ 005/Y4252E/Y4252E00.htm>. ——, World agriculture: towards 2015/2030, Roma, fao, 2003. Disponible en <http://www. fao.org>. Frew, E. et al.,”The politics of plants”, Food Sec., 1, 2009. Fulton, M. y K. Giannakas, “Agricultural biotechnology and industry structure”, AgBioForum, 4 (2), 2001, pp. 137-151. Garcia M. A. y M. A. Altieri, “Transgenic crops: implications for biodiversity and sustainable agricultura”, Bulletin of Science, Technology, Society, 25 (4), 2005. Gay, J. P., “Le maïs”, La Recherche, 18 (187), pp. 456-466. Genetically Engineered Organisms: Public Issues Education Project, <http://www.geo-pie. cornell.edu/educators/educators.html>. Gepts, P., “Where did agriculture start?”, PLB143 - Lecture 10, 2002. Disponible en <http:// agronomy.ucdavis.edu/gepts/pb143/lec10/pb143l10.htm>. GM Watch, <http://gmwatch.org>. GMO Safety, <http://gmo-safety.eu>. GMO-Compass, <http://www.gmo-compass.org/eng/home>. Gould, C., “GM crops are compatible with sustainable agriculture”, SciDevNet, 8/2/2006. Disponible en <http://www.scidev.net>. Greenpeace, <http://www.greenpeace.org>. Groupement National Interprofessionnel des Semences et des Plantes, “Les OGM, une ambition pour l´Europe”, Fiche 4: 6(1), 2003. Disponible en <http://www.gnis.fr>. Hails, R. S., “Assessing the risks associated with new agricultural practices”, Nature, 418, 2002, pp. 685-687. Harlander, S. K., “The evolution of modern agriculture and its future with biotechnology”, Journal of the American College of Nutrition, 21 (3), 161S - 165S, 2002. Hernández-Cuevas, C., “Biotecnología y emprendedorazgo”, Bioplanet, <www.bioplanet. net>. Illinois Farm Bureau, <http://www.ilfb.org>. Institut National de la Recherche Agricole, <http://www.inra.org.fr>. Instituto de Biotecnología de las Plantas, <www.cuba.cu/ciencia/ibp/index.html>. Instituto de Defesa do Consumidor, <http://www.idec.org.br>. Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, <http://www.mamiraua.org.br>. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, <http://www.inta.gov.ar>. International Forum on Globalization, “Fast facts on the corporate consolidation of industrial agriculture”. Disponible en <http://www.ifg.org>. International Life Sciences Institute - Argentina, <http://argentina.ilsi.org/>. 404 Bibliografía International Life Sciences Institute – Brasil, <http://brasil.ilsi.org/>. Izquierdo, J. y G. de la Riva, “Plant biotechnology and Food security in Latin America and the Caribbean”, Electronic Journal of Biotechnology, 3 (1), 2000. James, C., “Global Status of Commercialized Transgenic Crops: 2005”, ISAAA Briefs, Nº 34, Ithaca, ISAAA, 2005. Disponible en <http://www. isaaa.org>. Kannenberg, L. W., “Corn breeding in the 20th century”, 1999. Disponible en <http:// www.ontariocorn.org>. Kesan, J. P. y A. A. Gallo, “Property rights and incentives to invest in seed varieties: governmental regulations in Argentina”, AgBioForum, 8 (2 y 3), 2005, pp. 118-126. Kourilsky, P. y G. VINEY, Le principe de précaution, París, Éditions Odile Jacob, 2000. Latour, B., “Principe de precaution”, <http://www.bruno-latour.fr/presse/presse_art/028TECREV-BEBEAR-4.pdf>. Le Buanec, B., “A evolução da indústria sementeira durante os últimos 40 anos”, Revista SEED News, 12 (4), 2008. Lemaux, P., “Agricultural Biotechnology: its past and future”, Asilomar 25th Anniversary Meeting, 2000. Disponible en <http://ucbiotech.org/ resources/biotech/talks/pipeline/asilomar.html>. ——, “How does Biotechnology differ from classical Genetic manipulation?”. Disponible en <http://ucbiotech.org/resources/biotech/slides/02genetics/genetics.html>. Lemaux, P., “Genetically Engineered Plants and Foods: A Scientist’s Analysis of the Issues (Part I)”, Ann. Rev. Plant Biol., 59, 2008, pp. 771-812. ——, “Genetically Engineered Plants and Foods: A Scientist’s Analysis of the Issues (Part II)”, Ann. Rev. Plant Biol., 60, 2009, pp. 511-559. Lewcock, A., “Down on the biopharm”, 2007, <http://www.in-pharmacologist.com/content/view/print/121943>. < http://www.in-pharmatechnologist.com/Industry-Drivers/ Down-on-the-biopharm>. Macedo Oda, L., “Biossegurança no Brasil segue padrões científicos internacionais”, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 18, 2001, pp. 4-8, <www.biotecnologia.com.br/ revista/bio18/18_mat_1.pdf>. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Mantell, S. H. et al., Princípios de biotecnologia em plantas, Sociedade Brasileira de Genética, 1994. Martínez-Ghersa, M. A. y C. Ghersa, “Consecuencias de los recientes cambios agrícolas”, Ciencia Hoy, 15 (87), 2005. Mayr, E., Populações, espécies e evolução, San Pablo, Companhia Editora Nacional, 1977. McCalla, A. F. y L. R. Brown, “Feeding the developing world in the next millennium: a question of science?”, en Agricultural biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology, Consultation Group on International Agricultural Research, 1999. <http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm>. Mc Hughen, A., “Genetic Engineering and testing methodologies”, Agriculture biotechnology in California Series, 8190, University of California, Division of Agriculture and Natural Resources, 2006, <http://anrcatalog.ucdavis.edu>. 405 Biotecnología Mendonça-Hagler, L. C. S., “Biodiversidade e Biossegurança”, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 18, 2001, pp. 16-22. Mira, C., “Buscan inversores para un proyecto de Biotecnología”, Rosarionet, 15/8/2005. Disponible en <http://www.rosarionet.com.ar/rnet/locales/notas.vsp?nid=21898>. Mississippi State University, “Lessons on agribusiness in a global environment”, 1998. Disponible en <http://www.ais.msstate.edu/age/lessons.html>. Monsanto, <http://www.monsanto.com>. National Sustainable Agriculture Information Service (ncat), “Transgenic crops”, <http:// www.attra.ncat.org>. Oda, R., “Biodiversidade: a biotecnologia é prejudicial?”. Disponible en <http://www. anbiojovem.org.br/biosseg05.htm>. —— y V. Da Silva Faustino, “Criterios para la evaluación de riesgo de los OVGMs”, International Journal of Biosafety and Biosecurity, 1/10/2010, <http://www.seer.ufu.br/ index.php/intbiosafetybiosecurity/article/view/2268>. Oesterheld, M., “Los cambios de la agricultura argentina y sus consecuencias”, Ciencia Hoy, 15 (87), 2005. Oficina de Biotecnología, Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos, “Biotecnología y bioseguridad agropecuaria en la Argentina”. Disponible en <http:// www.sagpya.mecon.gov.ar/new/0-0/programas/biotecnologia/respuestas.php>. Ogm.org, <http://www.ogm.org>. Paixão, R. L., Experimentação animal: razões e emoções para uma ética, Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública, 2001. Panos Media, “Brief Who decides? GM crops in the developing world”. Disponible en <http://www.panos.org.uk/PDF/reports/gmdebate_brief.pdf>. Patel, R. P. et al., “Protein Production”, Drug Delivery Technology, 7 (4), 2007. Persley, G. J., “Agricultural biotechnology and the poor: Promethean science”, en Agricultural biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology, Consultation Group on International Agricultural Research, 1999. <http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/ contents.htm>. ——, “Agricultural biotechnology: global challenges and emerging science in Agricultural biotechnology: country case studies”, CAB International, 2002. <http://www.agrbiotech.org>. Pew Initiative on Food and Biotechnology, “Feeding the World. A look at biotechnology & world hunger”, 2004. Disponible en <http://www.pewagbiotech.org>. Pierik, R. L. M., Cultivo in vitro de las plantas superiores, Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990. Porceddu, E. y O. A. Tanzarella, “Perspectivas y papel de la mejora genética en la agricultura del siglo xxi”, en La agricultura del siglo XXI, Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1993. Portal de la Acuicultura en Chile, <http://www.aqua.cl/sitios.html>. Ramanyaneyulu, G. V., “GM crops are not the answer to pest control”, SciDevNet, 8/2/2006. Disponible en <http://www.scidev.net>. Raven, P. H., “Transgenes in Mexican maize: desirability or inevitability?”, PNAS 102 (37), 2005, pp. 13003-13004. 406 Bibliografía Rech, E., “A agricultura familiar e a biotecnologia como contribuição para o avanço social e económico”. Disponible en <http://www.cib.org.br>. Red de Cooperación Técnica en Biotecnología Vegetal para América Latina y el Caribe, <http://www.redbio.org>. Reiss, M. J. et al., Improving Nature? The science and ethics of genetic engineering, Cambridge, Cambridge University Press, 1996. Risch, O. A., “O setor de floricultura e plantas ornamentais no Brasil e no mundo”. Disponible en <http://www.floresta.ufpbr.br~paisagem/plantas/mercado.htm>. Rizzini, C. T. y W. B. Mors, Botânica econômica brasileira, 2ª ed., Río de Janeiro, Ambito Cultural Edições, 1995. Rosset, P. M., “Transgenic crops to address third worlds hunger? Critical analysis”, Bulletin of Science, Technology and Society, 25 (4), 2005. Rubinstein, C., “Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de los organismos genéticamente modificados”, en Biotecnología y mejoramiento vegetal, Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, 2005. Disponible en <http://www.argenbio. org/h/biblioteca/libro/38_IX_1.pdf>. Rural Advancement Fund International, “¿De dónde vienen las semillas...Y a dónde van?”, en Más allá de la revolución verde, Barcelona, Editora Lerna, 1987. Sasson, A., Biotechnologies and development, París, Unesco, 1988. ——, Food and Nutrition Biotechnology: achievements, prospects and perceptions, UNU-IAS Report, 2005. Disponible en <www.ias.unu.edu>. Satorre, E. H., “Cambios tecnológicos en la agricultura argentina actual”, Ciencia Hoy, 15 (87), 2005. Schifino-Wittmann, M. T. et al., “Poliploidia e seu impacto na origem e evolução das plantas silvestres e cultivadas”, R. Bras. Agrociência, 10 (2), 2004. Scidevnet, “Dossier: Biodiversity”, <http://www.scidev.net>. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos, Ministerio de Economía y producción, “Plan Estratégico 2005-2015 para el Desarrollo de la Biotecnología Agropecuaria”, Buenos Aires, 2004. Disponible en <http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/0-0/programas/ biotecnologia/pdf/PE.pdf>. Seednews, <http://www.seednews.inf.br/portugues/arquivo.shtml>. Seed World, <http://www.seedworld.com>. Sequeira de Oliveira Pereira, M., “Transgênese animal”, encarte, Biotecnologia, Ciência e desenvolvimento. Disponible en <http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio04/4_hp_16.asp>. Serageldin, I., “The challenge of poverty in the 21stcentury: the role of science”, en Agricultural biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology, Consultation Group on International Agricultural Research, 1999. Disponible en <http://www.cgiar. org/biotech/rep0100/contents.htm>. —— et al., Promethean Science: Agricultural biotechnology, the environment and the poor, Consultative Group on International Agriculture Science, 2000. Disponible en <http:// www.cgiar.org>. Site Interministeriel sur les OGM, <http://www.ogm.gouv.fr>. 407 Biotecnología Snow, A. A., “Transgenic crops- why gene flow matters”, Nature Biotechnology, 20, 2002. Sommer, S., ¿Por qué las vacas se volvieron locas?, Buenos Aires, Editora Biblos, 2001. Source d’information sur les Organismes Génétiquement Modifiés, <http://www.ogm.gouv.qc.ca>. Straughan, R. et al., Ethics, morality and crop biotechnology, Biotechnology and Biological Sciences Research Council, 1996. Swaminathan, M. S., “Genetic Engineering and Food Security: Ecological and Livelihood Issues”, en Agricultural biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology, Consultation Group on International Agricultural Research, 1999. Disponible en <http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm>. Tamayo, G. et al., “Biodiversity for bioindustries in biotechnology and plant genetic resources: conservation and use”, Biotechnology in Agriculture Series, Nº 19, 1997. Disponible en <http://www.agbiotechnet.com/books/available.asp>. Teichert Peske, S. y M. A. A. Tillmann, “Limites de Tolerância para Sementes Adventícias”, Seeds news, año XIII, (5), 2009. The Convention on Biological Diversity, <http://www.biodiv.org/default.shtml>. The Glyphosate, Weeds and Crops Web Site, <http://www.glyphosateweedscrops.org>. The International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, <http://www. isaaa.org/>. The World Fish Center, <http://www.worldfishcenter.org>. Trigo, E., “Consecuencias económicas de la transformación agrícola”, Ciencia Hoy, 15 (87), 2005. —— et al., Los transgénicos en la agricultura Argentina, Buenos Aires, Libros Del Zorzal, 2002. Val Giddings, L. y G. Jaffe, “Codex alimentarius and the Biosafety protocol – Complement or conflit?”, 23/9/2004. Disponible en <http://www.checkbiotech.org>. Van Eenennaam, A. L., “Genetic engineering and animal feed”, Genetic Engineering Fact Sheet 6, 8183, University of California, Division of Agriculture and Natural Resources, <http://anrcatalog.ucdavis.edu>. ——, “What is the future of animal biotechnology”, California Agriculture 60 (3), 2006. ——, “Marker-assisted selection in beef cattle”, <http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech>. Vitagliano, J. C. y F. A. Villalpando, “Análisis de la biotecnología en la Argentina”, Foros nacionales de Competitividad Iindustrial de las Cadenas Productivas, Secretaría de Industria, Comercio y PyME, Ministerio de Economía y Producción, 2003. <http://www.industria. gov.ar/foros/base_bio/documentos/coordinacion/analisis1.PDF>. Wilson, E. O., Naturalista, Río de Janeiro, Editora Nova Fronteira, 1997. Winkler, F., “Acuicultura, mejoramiento genético y biotecnología”, Bioplanet. Disponible en <www.bioplanet.net>. Wood, L., “Total animal healthcare market estimated at $ 23 billion”, 7/10/2004, <http:// www.checkbiotech.org>. World Resources Institute, “Agriculture and genetic diversity”, <http://www.wri.org/biodiv/ agrigene.html>. Wurman Gotfrit, C. et al., “La acuicultura comercial chilena: desafíos, oportunidades y metas hasta el 2020”. Disponible en <http://www.aqua.cl/revistas/n58/tit_1_esp.html>. 408 Bibliografía CAPÍTULOS XV, XVI Access Excellence, The National Health Museum, “About Biotech: Biotech applied”. Disponible en <http://www.accessexcellence.org>. Adam, D., “GM cropped”, Nature Science Update, 1/4/2000, <http://www.nature.com/nsu/ nsu_pf/000330/000330-6.html>. Aquarone, E., “Generalidades sobre bebidas alcohólicas”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. —— et al. (coords.), Biotecnologia Industrial. Biotecnologia na produção de alimentos. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Associação Nacional de Biossegurança, <http://www.anbio.org.br>. Auer, C. A., “Tracking genes from seed to supermarket: techniques and trends”, Trends in Plant Science, Biomednet, 2003. Avery, D. T., “FDA tests show genetically altered corn hasn´t triggered allergies”, Dayton Daily News, 18/6/2001. Beever, D. E. y C. F. Kemp, “Safety Issues Associated with the DNA in Animal Feed Derived from Genetically Modified Crops: A Review of Scientific and Regulatory Procedures”, Nutrition Abstracts and Reviews, Series B: Livestock Feeds and Feeding, 70 (3), 2000, pp. 1-8. Disponible en <http://www.biotech-info.net/BeeverKemp1.pdf>. Berger, R. G., “Fermented foods: Colours/flavours derived by fermentation”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000. Disponible en <http://www. academicpress.com/companions/0122270703/>. Bioplanet, <www.bioplanet.net>. Biotechnology Industry Organization, <http://www.bio.org>. Biotecnologia: Ensino e Divulgação, <http://www.bteduc.bio.br>. Bisson, L. F. et al., “The present and future of the international wine industry”, Nature, 418, 2002, pp. 696-699. Bosch, X., “Genetic secrets of a good wine”, The Scientist, 5 (1), 2004. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/2004/5/>. Brookes G. y P. Barfoot, “GM crops: The global economic and environmental impact; the first nine years 1996-2004”, AgBioForum, 8 (2 y 3), 2005, pp. 187-196. Campbell-Platt, G., “Fermented foods: origins and applications”, Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000. Disponible en <http://www.academicpress. com/companions/0122270703/>. Castro, J. de, Géographie de la faim, Paris, Editions du Seuil, 1964. Century Wine, <http://www.centurywine.8m.com/picture.html>. Chaplin, M., “Enzyme technology”, 2003. Disponible en <http://www.lsbu.ac.uk/biology/ enztech/index.html>. Chassy, B. M., “Food safety evaluation of crops produced through Biotechnology”, Journal of the American College of Nutrition, 21 (3), 2002. Checkbiotech, <http://www.checkbiotech.org>. Cohen, J. I., “Poorer nations turn to publicly developed GM crops”, Nature Biotechnology, 23 (1), 2005, pp. 27-33. 409 Biotecnología Conselho de Informações sobre Biotecnología, <http://www.cib.org.br>. Constable, A. et al., “Histórico de utilização segura aplicado à avaliação de segurança de novos alimentos ou de alimentos derivados de organismos geneticamente modificados”, ILSI, 2008. Díaz, A., Biotecnología en industrias de alimentos, Buenos Aires, CEPAL-ONU, 2003. Duval-Iflah, Y., “Y a-t’il des risques liés à la consommation de produits frais contenant des bactéries transgéniques?”, en Les OGM à l´INRA: OGM et alimentation, 1998. Disponible en <http://www.inra.gov.fr>. Esteves Vieira, L. G., “Organismos geneticamente modificados: uma tecnologia controversa”, Ciência Hoje, 34 (203), 2004, pp. 28-32. European Federation of Biotechnology, “Allergies from GM food”, Task Group on Public Perceptions of Biotechnology, 2000. Disponible en <http://www.efb-central.org/>. European Food Information Council, <http://www.eufic.org>. Food and Agriculture Organization, “Food Processing, Summary Document”. Disponible en <http://www.fao.org/biotech/logs/C11/summary.htm>. Food Standards Agency, “Genetic modification and food”, <http://www.food.gov.uk>. Gastone Venturini Filho, W. y M. Pascoli Cereda, “Cerveja”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Global Knowledge Center on Crop Biotechnology, “São alimentos derivados de cultivos transgênicos seguros?”. Disponible en <http://www.isaaa.org>. GMO-Compass, <http://www.gmo-compass.org>. Grandi, J. G., “Leites fermentados”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Greenberg, D. y M. Graham, “Improving communication about new food technologies”, Issues on Science and Technology, verano 2000. Disponible en <http://www.nap.edu/issues/ 16.4/greenberg.htm>. Greenpeace, <http://www.greenpeace.org>. Hails, R. y J. Kinderlerer, “The GM public debate: context and communication strategies”, Nature Genetics, 4, 2003, pp. 819-825. Harvestplus, <http:// www.harvestplus.org>. Hashizume, T., “Tecnologia do vino”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Hoban, T., “Tacogate: there is barely a kernel of truth”, The Washington Post, 26/11/2000. International Life Sciences Institute (ILSI), <http://www.ilsi.org>. Johansen, E., “Genetic engeneering: modification of bacteria”, en Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000. <http://www.academicpress.com/ companions/0122270703/>. ——, “Challenges when transferring technology from Lactococcus laboratory strains to industrial strains”, Genetics and Molecular Research, 2 (1), 2003, pp. 112-116. Kimbrell, E., “What is Codex Alimentarius?”, AgBioForum, 3 (4), 2000, pp. 197-202. Kiu, W. y L. Kovacs, “Do we need to be concerned about genetically modified grapevine?”, Vineyard and vintage view, 18 (4), 2003. 410 Bibliografía Kouba, M., “Qualité des produits biologiques d´origine animale”, Productions animals, 15, 2002, pp. 161-169. La Planète-Vin, “Le Prodige du Vin”. <http://www.abrege.com/lpv/prodig.htm>. La Recherche, “Le risque alimentaire”, número especial, febrero de 2001. Lajolo, F., “Alimentos transgênicos: riscos e beneficios”, Ciência Hoje, 34 (203), 2004, pp. 36-37. Lajolo, F. M. y M. R. Nuti, Transgênicos: Bases científicas de sua segurança, San Pablo, Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, 2002. Lemaux, P., “Genetically Engineered Plants and Foods: A Scientist’s Analysis of the Issues (Part I)”, Ann. Rev. Plant Biol., 59, 2008, pp. 771-812. Lerayer, A. L. S., “Biotecnologia na indústria de alimentos”. Disponible en <http://www.cib. org.br>. Levanon, Y. y S. M. Ouvinhas Rossetini, “Cacau”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Luco, R. et al., “La acuicultura en Chile”. Disponible en <http://bibliotecnica.upc.es/bib280/ cursmari/parte3.pdf>. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 2006. Mansour M. y J. B. Bennett, “Codex Alimentarius, biotechnology and technical Barriers to trade”, Agbioforum, 3 (4), 2000, pp. 213-218. Marris, E., “Winning the wine war”. Disponible en <http://www.bioedonline.org/news/ news.cfm?art=1655>. Mills, C., “Could genetically modified foods be a new source of allergens?”. Disponible en <http://www.scidevnet>. National Centre For Biotechnology Education, <http://www.nvbe.reading.ac.uk/NCBE/ GMFOOD/issues.html>. Nigam, P., “Single cell protein: mycelial fungi”, en Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000. <http://www.academicpress.com/companions/ 0122270703/>. Novozymes, <http://www.novozymes.com>. Nutti, M. R., “A biofortificação como ferramenta para combate a deficiências em micronutrientes”, Palestra no Workshop Internacional de Biologia Médica, 2005, <www.cprm.gov. br/publique/media/Palestra10.pdf>. Oda, L. M., “Alimentos transgênicos: riscos à saúde”, 2001. Disponible en <http://www.mct. gov.br/ctnbiotec/leila.htm>. “OGM et consommateurs”. Disponible en <http://ww2.creaweb.fr/bv/ogm/risques2.html>. OGM.org, < http://www.ogm.org>. Pascal, G., “Comment évaluer la sécurité dês aliments issus de plantes transgéniques?”, en Les OGM à l’INRA: OGM et alimentation, 1998. Pastore, G. M., “Production and use of enzymes in food processing”, Workshop – Industrial Enzymes for food production: Past, present and future perspectives, Brasilia, 2002. Disponible en <http://www.anbio.org>. 411 Biotecnología Persley, G. J., “New genetics, food and agriculture: Scientific discoveries - Societal dilemmas”, The Doyle Foundation for the International Council of Science, 2003. Disponible en <http://www.doylefoundation.org/icsu/ICSU_2003_20Full_20Report.pdf>. Phillips, P. W. B. y D. Corckindale, “Marketing GM foods: the way forward”, AgBioForum, 5 (3), 2002, pp. 113-121. —— y H. McNeill, “Labelling for GM foods: theory and practice”, en Market Development for genetically modified foods, CAB International, 2002. Plant Biotechnology Institute, “Biotechnology and Developing countries: the potential and the challenge”, PBI Bulletin, 2, 2004. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Ribeiro, E. P., “Queijos”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Roberfroid, M. B., “Prebiotics and probiotics: are they functional foods?”, American Journal of Clinical Nutrition, 71 (6), 2000. Royal Commission on Genetic Modification, “17 popular myths about GM which were busted by the Royal Commission on genetic modification”, 2001. Disponible en <http:// www.checkbiotech.org>. San Diego Center for Molecular Agriculture, “Foods from genetically modified crops”. Disponible en <http://www.sdcma.org>. Sandir, R. et al., “Genetic engeneering: modification of yeasts and moulds”, en Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000. <http://www. academicpress.com/companions/0122270703/>. Sasson, A., Food and Nutrition Biotechnology: achievements, prospects and perceptions, UNUIAS Report, 2005. Disponible en <www.ias.unu.edu>. ——, Nourrir demain les homes, París, Sextant-Unesco, 1986. Sato, S., “Alimentos orientais”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. SciDevNet, <http://www.scidev.net>. Scott, C., “Angola rejects GM food aid”, 2/4/2004. Disponible en <http://www.checkbiotech.org>. Singhal, R. S. y P. R. Kulkarni, “Bread: bread from wheat flour”, en Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, online version, 2000. Disponible en <http://www. academicpress.com/companions/0122270703/>. Site Interministeriel sur les OGM, <http://www.ogm.gouv.fr>. Sybesma, W. et al., “Safe use of genetically modified lactic acid bacteria in food. Bridging the gap between consumers, green groups, and industry”, Electronic Journal of Biotechnology, 9 (4), 2006. The American Dietetic Association, “Biotechnology and the future of food”, J Am Diet Assoc. 95, 1995, pp. 1429-1432. The European Association for Bioindustries, <http://www.europabio.org>. The Pew Initiative on Food and Biotechnology, <http://www. pewagbiotech.org>. Thompson, L., “Are bioengeneered foods safe?”, FDA consumer magazine, enero-febrero 2000. Disponible en <http://www.fda.org>. 412 Bibliografía United States Food and Drug Administration, “Enzyme preparations: chemistry recommendations for food additive and GRAS affirmation petitions”, 1993. Disponible en <http://www.cfsan.fda.gov/~dms/opa-cg7.html>. ——, “Statement of policy: foods derived from new plant varieties”, Federal Register, 57, 29 de mayo de 1992, pp. 22984-23005. Vitti, P., “Pão”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Vittolo, M., “Aplicações das enzimas na tecnologia de alimentos”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Wal, J.-M., “Les aliments transgéniques n´entraînent-ils pas des problèmes d´allergie?”, en Les OGM à l´INRA: OGM et alimentation, 1998. Walker, G. M., “Microbiology of wine-making”, en Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, online version, 2000. Disponible en <http://www.academicpress.com/ companions/0122270703/>. Wine International, <http://www.wineint.com/>. World Health Organization, “20 questions on genetically modified (GM) foods”. Disponible en <http://www.who.int>. ——, “Modern food biotechnology, human health and development: an evidence-based study”, 2005. Disponible en <http://www.who.int>. Zancanaro Jr,. O., “Vinagres”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 4, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. Zinnen, T. M., “Wholesome, Holistic and Holy: Contoversies over Biotechnology and Food”, <http://www.accessesxcellence.org/RC/AB/IE/wholesome.html>. CAPÍTULOS XVII, XVIII, XIX, XX Abbott’s Diagnostic División, <http://www.abbottdiagnostics.com>. Abdulla, S., “Phytotherapy – good science or big business?”, Nature Science Update, 1999. Disponible en <http://www.nature.com/news/1999/990513/full/990513-8>. Access Excellence, The National Health Museum, <http://www.accessexcellence.org>. Action Bioscience, <http://www.actionbioscience.org>. Adam, D., “GM cropped”, Nature Science Update, 01/04/2000, <http://www.nature.com/ nsu/nsu_pf/000330/000330-6.html>. Adams, A., “Cancer immunotherapy inches forward”, The Scientist, 18 (14), 37, 2004. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14841/>. “AIDS: Etiologia, Clinica, Diagnóstico e Tratamento. Testes diagnósticos”. Disponible en <http://www.aids.gov.br/assistencia/etiologia_diagnostico.htm>. Alcamo, I. E., DNA Technology: The awesome skill, Dubuque, C. Brown Publishers, 1996. Aldhous, P., “The bioweapon is in the post”, NewScientist.com, 9/11/2005. Disponible en <http://www.newscientist.com/channel/opinion/mg18825252.900.html>. Alonso, D. F., El desafío del cangrejo, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002. —— y D. Gomez, “ADN y cáncer: del origen de la enfermedad a su tratamiento”, en ADN: 50 años no es nada, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. 413 Biotecnología —— y D. Gomez, Introducción a la Oncología Molecular, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 1998. Alzogaray, R. A., Una tumba para los Romanov, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. Ameh, S. J. et al., “Current phytotherapy- A perspective on the science and regulation of herbal medicine”, Journal of Medicinal Plants Research, 4 (2), 2010, pp. 72-81. American Cancer Society, “Immunotherapy”, <http://www.cancer.org>. Aniló, G. et al., “Las empresas de biotecnología en Argentina”, Comisión Económica para América Latina y el Caribe, Naciones Unidas, Santiago de Chile, 2011. Antler, C., “Antisense RNA”, The Science Creative Quarterly, 2003, <http://www.bioteach. ubc.ca/MolecularBiology/AntisenseRNA>. American Academy Of Pediatrics, Work Group on Cord Blood Banking, “Cord Blood Banking for potential future transplantation: subject review”, Pediatrics, 104:1, 1999, pp. 116-118. American Chemical Society, “The Pharmaceutical Century: ten decades of drug discovery”, 2000. Disponible en <http://www.acs.org>. American Medical Association, “Pharmacogenomics”. Disponible en <http://www.ama-assn. org>. Aniló, G. et al., “Las empresas de biotecnología en Argentina”, Comisión Económica para América Latina y el Caribe, Naciones Unidas, Santiago de Chile, 2011. Antler, C., “Antisense RNA”, The Science Creative Quarterly, 2003, <http://www.bioteach. ubc.ca/MolecularBiology/AntisenseRNA>. Antonarakis, S. E. y S. Beckmann, “Mendelian disorders deserve more attention”, Nature Reviews Genetics, 7, 2006. Applied Biosystems, <http://www.appliedbiosystems.com>. Argibay, P., Medicina regenerativa y Stem Cells. De la terapia celular a la ingeniería de tejidos, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes Editorial, 2005. Association of Reproductive Health Professionals, “Human cloning and genetic modification: The basic science you need to know”. Disponible en <http://www.arhp.org/genetics/>. Aventis Pasteur–Eradication de la poliomyélite. Disponible en <http://www.polio-vaccine.com>. Azevedo, V. y S. Costa Oliveira, “Vacinas de DNA: o paradigma das vacinas gênicas”, Biotecnologia, Ciência e desenvolvimento, 5 (5), 1998. Bajorath, J., “Integration of virtual and high –throughput screening”, Nat Ver Drug Discov. 1(11), 2002, pp. 882, 894. Baker, M., “An overview of the not-so-distant past, and an outlook for the not-so-distant future”, Nature Reports Stem Cells, 2009. Disponible en <http://www.nature.com/stemcells/2009/0910/091022/full/stemcells.2009.132.html>. Bambini, S. y R. Rappuoli, “The use of genomics in microbial vaccine development”, Drug Discovery Today, marzo, 2009. Barrett, J. F., “Can biotech deliver new antibiotics?”, Current Opinion in Microbiology, 8, 2005, pp. 498-503. Bates, C., “Nicotine vaccine tests launched”, <http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/1535852. stm>. 414 Bibliografía Bento Farah, S., DNA, Segredos e Mistérios, San Pablo, Editora Sarvier, 2008. Bergman, K. A. y D. Graff, , “The global stem cell patent landscape: implications for efficient technology transfer and commercial development”, Nature Biotechnology, 25, 2007, pp. 419-424. Bernard, S., “The 5 myths of pharmacogenomics”, 1 de octubre de 2003. Disponible en <http://www.pharmexec.com>. Biermann, C. A. y G. B. Sarinsky, “Xenotransplants”, The American Biology Teacher, (60) 1, 1998, pp. 14-18. Bioethics Research Library, “Human Gene Therapy”, <http://bioethics.georgetown.edu>. Biomérieux, <http://www.biomerieux.com>. Bionet, “A quem pertencem nossos genes?”, <http://www.bionetonline.org>. Bioresearch Online, <http://www.bioresearchonline.com>. Biotechnology Industry Organization, <http://www.bio.org>. Biotecnologia: Ensino e Divulgação, <http://www.bteduc.bio.br>. Bioworld Today, <http://www.bioworld.com>. Borém, A., F.R. dos Santos, Biotecnologia Simplificada, Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 2001. Borojevic, R., “Biotecnologia na área de saúde humana e animal: Bioengenharia e biomimética”, <http://www.mct.gov.br/Temas/biotec/ Tendencias_Radovan_Final_.pdf>. Branca, M., “The new new pharmacogenomics”, Bio-ITWorld, 2002. Disponible en <http:// www.bio-itworld.com/archive/090902/pharma.html>. Breekveldt, J. y J. Jongerden, “Transgenic animals in Pharmaceutical production Biotechnology and Development”, Monitor, 36, 1998, pp. 19-22. Disponible en <http://www. biotech-monitor.nl/3609.htm>. Brickley, P., “The 21st Century war on cancer”, The Scientist, 17 Issue Supplement, 2: S46, 2003. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14132/>. Brinkman, R. R. et al., “Human monogenic disorders- a source of novel drug targets”, Nature Reviews/Genetics, 7 (4), 2006, pp.249-260. British Medical Association, “BMA position on human cloning”. Disponible en <http:// www.bma.org.uk>. Bussiness Week Online “Drugs get smart”, 5/9/2005. Disponible en <http://www. businessweek.com/technology/content/05_36/b39499001_mz001.htm>. ——, “Biotech, finally”, 2/6/2005. Disponible en <http://www.businessweek.com/ technology/content/jun2005/tc2005062_4958_tc024.htm>. Bussiness Comunication Company, “World market for therapeutic and diagnostic imaging antibodies to cross $15.7 billion by 2007”, septiembre 17, 2002. Disponible en <http:// www.bccresearch.com/editors/RC-088V.htm>. ——, “Global market for diagnostic reagents, chemicals, carriers, and other consumables to reach $ 23 billion by 2008”. Disponible en <http://www.bccresearch.com/editors/ RB-185.html>. Campos de Carvalho, A. C., “Células-tronco: a medicina do futuro”. Disponible en <http:// www.educaçãopublica.rj.gov.br/biblioteca/biologi/bio10b.htm>. 415 Biotecnología Cancer Reasearch UK, <http://www.cancerhelp.org>. Cardiff and Vale, “NHS Trust Tissue typing”. Disponible en <http://www.cardiffandvale. wales.nhs.uk>. Case, C., “Discover a new antibiotic. Strategies for success workshop”, 1998. Disponible en <http://smccd.accounts/case/antibiotics>. Castanotto, D. y J. J. Rossi, “The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics”, Nature, 457, 2009, pp. 426-433. Center for Genetis and Society, <http://www.genetics-and-society.org>. Centers for Disease Control and Prevention, <http://www.cdc.org>. Centre For Genetics Education, <http://www.genetics.edu.au>. Centro Informação Biotecnologia, <http://www.cib.org.br>. “CDF Compatibilidade HLA e transplantes”. Disponible en <http://www.fhdf.gov.br>. Cha, A. E., “With U.S. stem cell treatments limited, patients try other countries”, The Washington Post, 6/6/2010. Disponible en <http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/ content/article/2010/06/05/AR2010060502014.html>. Chandler, J. y E. Lagasse, “Cancerous stem cells: deviant stem cells with cancer-causing misbehavior”, Stem Cell Research, Therapy, 1 (13), 2010, <http://www.stemcellres.com/ content/1/2/13>. Chapman, A. R. et al., Stem cell Research and applications. Monitoring the frontiers of biomedical research. American Association for the Advancement of Science, 1999. Chapman, T., “Lab automation and robotics”, Nature, 421, 2003, pp. 661-666. Charrow, J., “Tandem mass spectrometry in newborn screening”, Genetics in Medicine, (2) 4, 2000, pp. 267-269. Cherfas, J., Antibiotics explained, Biotechnology and Biological Sciences Research Council, 1995. Children’s Health System and University of Washington, “GeneTests”, Educational Materials: About Genetic Services, 2003. Chin L. y J. W. Gray, “Translating insights from the cancer genome into clinical practice”, Nature, 452, 2008, pp.553-563. Ciccarelli, F. D., “The (r)evolution of cancer genetics”, BMC Biology, 8 (74), 2010, <http:// www.biomedcentral.com/1741-7007/8/74>. Cité des Sciences de Paris La Villette, “Les médicaments génériques”. Disponible en <www. cite-sciences.fr/actu/2001/03medicaments/html>. Clarke, T., “Malaria vaccine gets a boost”. Disponible en <http://www.nature.com/nsu/nsu_ pf/030519/030519-11.html>. Cochlovius, B. et al., “Therapeutic antibodies”, Modern Drug Discovery, American Chemical Society, octubre 2003. Codner, D. y A. Díaz, Innovación y biotecnología en el sector salud de Argentina, 2011, <http:// ebookbrowse.com/codner-diaz-pdf-d49553754>. Cohen, H., “Gene therapy marches forward”, The Scientist, 16 (20), 2002. College of Biological Sciences, “After 15 million years, sleping beauty awakes”. Disponible en <http://www.cbs.umn.edu/lab_cbs/frontiers1_sleepingbeauty.html>. 416 Bibliografía Comciência, “Os medicamentos anti-AIDS e a quebra de patentes”. Disponible en <http:// www.comciência.br>. Committee on the Biological and Biomedical Applications of Stem Cell Research, Stem cells and the future of regenerative medicine, The National Academies Press, 2002, <http:// books.nap.edu/books/0309076307/html/index.html>. Conselho Regional de Farmácia do Rio de Janeiro, “O terceiro milênio e a história da farmacia”. Disponible en <http://www.crf-rj.org.br/revista/42/12_42.html>. Constans, A., “A Body by science”, The Scientist, (19) 34, 6 de octubre de 2003. ——, “Making Medicine Personal”. Disponible en <http://www.the-scientist.com/yr2002/ sep/1cprofile_020930.html>. Corporate Watch, <http://www.corporatewatch.org.uk>. ——, “Pharmaceutical industry overview: practicing the most stark acts of corporate inhumanity”. Disponible en <http://www.corporatewatch.org/?lid=312>. Council of Agricultural Science and Technology (cast), “Vaccine development using recombinant DNA technology”, CAST Issue paper, 38, 2008. Daar, A. S. et al., “Top ten biotechnologies for improving health in developing countries”, Nature Genetics, 32, 2002, pp. 229-232. Decode Genetics, <http://www.decode.com>. Degos, L., Les Greffes d´Organes, París, Flammarion, 1994. Delude, C. M. y J. Boughman, “Genetic Research: mining for medical treasures”, Breakthroughs in Bioscience, 2002. Disponible en <http://www.faseb.org/opar/break/>. Dennis, C., “Special section on human genetics: the rough guide to the genome”, Drug Discovery @ Nature. Disponible en <http://www.nature.com>. Department of Health and Human Services, “Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions”, junio 2001. Disponible en <http://www.nih.gov/news/stemcell/ scireport.htm>. Desnottes, J. F., “Quels anti-bactériens pour après-demain”, La Recherche, 314, 1998, pp. 70-73. Diamanti-Kandarakis, E. et al., “Erythropoietin Abuse and Erythropoietin Gene Doping”, Sports Med., 35 (10), 2005. Diamond, J., Armas, germes e aço: os destinos das sociedades humanas, 2ª ed., Río de Janeiro, Editora Record, 2001. Diário da Saúde, <http://www.diariodasaude.com.br>. Díaz A. y D. Codner, “Industria farmacéutica y biotecnología y acceso al conocimiento: un desafío para la Argentina”, The Information Society Project at Yale Law School, 2010, <http://ebookbrowse.com/diaz-codner-doc-d39513680>. Dingli D. y J. M. Pacheco, “Stochastic dynamics and the evolution of mutations in stem cells”, BMC Biology, 9 (41), 2011. Dohman, H., “Terapia Celular”, entrevista concedida a Edmilson Silva. Disponible en <http://www.biotecnologia.com.br/bio29/entrevista.asp>. Downward, J., “RNAi and Cancer Research. The path to cure?”, The Biochemist, 2004. Disponible en <http://www.biochemist.org/bio/02605/0012/026050012.pdf>. 417 Biotecnología Downwy, J., “RNAi: The gentle art of shredding genes”, National Institute for Medical Research, Mill Hill Essays. Disponible en <http://www.nimr.mrc.ac.uk/millhillessays/ 2003/rnai/>. Dufour, V., “DNA vaccines: new applications for veterinary medicine”, Veterinary Sciences Tomorrow, 2, 2001. Economist Intelligence Unit, <http://www.eiu.com/public>. European Diagnostic Manufacturers Association, <http://www.edma-ivd.be>. European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations, <http://www.efpia.org>. European Nanotechnology Gateway, <http://www.nanoforum.org>. Eisenstein, M., “Gene transfer: it’s all in the delivery”, Nature Methods. <http://www.nature.com>. Eloit, M., “Vaccins traditionnels et vaccins recombinants”, INRA, Productions animals, 11, 1998, pp. 5-13. ELSI (Ethical, legal and social Implications Program), <http://www.nhgri.nih.gov>. Emanuelli, G. y G. Ripoll, “Bases moleculares del cáncer: nuevas estrategias antitumorales”, en Serie Digital, Ciencia y Tecnología Nº 3, Universidad Nacional de Quilmes, 2005, <http:// www.unq.edu.ar/catalogo/213-serie-digital-03-/-programa-de-becas-parajóvenesdestacados-del-polimodal-i.php>. Epstein, A., “De cómo tratar una enfermedad grave utilizando vectores virales, sin necesariamente matar a los pacientes en el intento”, en ADN: 50 años no es nada, Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004. Extracta, “Moléculas Naturais”, <http://www.extracta.com.br>. Federation of American Societies for Experimental Biology, “Breakthroughs in bioscience”, 2003. Disponible en <http://www.faseb.org>. Ferro Bricks, L., “Vacina contra a poliomielite: um novo paradigma”, Rev. paul. pediatr., 25 (2), 2007. Fiercebiotech, <http://www.fiercebiotech.com>. Fiercedrugdelivery, <http://www.drugdelivery.com>. Fiercepharma Manufacturing, <http://www.fiercepharmamanufacturing.com>. Fiercepharma, <http://www.fiercepharma.com>. Fiercevaccines, <http://www.fiercevaccines.com>. Fischer, A. y M. Cavazzana-Calvo, “Whither Gene Therapy?”, The Scientist, 20 (2), 2006. Fisher Wilson, J., “21st century antibiotics”, The Scientist, 16 (5), 2002. Fitzgerald, G. A., “Anticipating change in drug development: the emerging era of translational medicine and therapeutics”, Nature Reviews/Drug Discovery, 4, 2005. Flight, C., “Smallpox: eradicating the scourge”. Disponible en <http://www.bbc.co.uk/history>. Flower, D. R., “Vaccines in silico: the growth and power of bioinformatics”, The Biochemist, (8), 2004, pp. 17-20. Fogarty, M., “The reality of targeted therapies”, The Scientist, 16 (20), 14/10/2002. Fraser, C. M. y M. R. Dando, “Genomics and future biological weapons: the need for preventive action by the biomedical community”, Nature online, 2001. Disponible en <http://genetics.nature.com>. Frederickson, R. M., “A gene therapy primer”. Disponible en <http://www.bio.com>. 418 Bibliografía Fundação Ataulfo De Paiva, <http://www.bcgfap.com.br>. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de San Pablo, <http://www.fapesp.org.br>. Gallagher, R., “Vaccines are back”, The Scientist, 19 (22), 2005, p. 6. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/article/display/15888/>. Gallagher, J., “Acute myeloid leukaemia genes’ role discovered”, BBC news, 27/03/2011, <http://www.bbc.com.uk/news/healthy-12860969?print=true>. Garmory, H. S. et al., “DNA vaccines: improving expression of antigens”, Genetic vaccines and Therapy, 1 (2, 2003. Garwin, W. et al., “Issues in human genetics” (Unit 4), European Initiative for Biotechnology Education. Disponible en <http://www.eibe.info/>. Geldenhuys, W. et al., “Optimizing the use of open-source software applications in drug discovery”, Drug Discovery Today, 11 (3/4), 2006. Genesica, <http://www.genesica.com.ar>. Genetic Engineering, “Biotechnology News”, <http://www.genengnews.com>. Genetic Interest Group, “Genetic predisposition to common diseases”. Disponible en <http://www.gig.org.uk/education4.htm>. Genetic Science Learning Center, <http://gslc.genetics.utah.edu>. Genetics Home Reference, <http://www.ghr.nlm.nih.gov>. Genewatch UK, “Regulating Human Genetic Tests: Ten Key Questions”, abril 2003. Disponible en <http://www.genewatch.org>. Gögel, S. et al., “Progress and prospects: stem cells and neurological diseases”, Gene Therapy, 18, 2011. Gomez, D., “Avance en la investigación oncológica”. Disponible en <http://www.perspectivasur. com/nota3.htm>. ——, “Estrategias biotecnológicas para desafiar el cáncer”, entrevista en “Innovación en el campo de la Biotecnología”, Informe UNQ, octubre 2004. Disponible en <http:// www.unq.edu.ar/servlet/ShowAttach?idAttach=4402>. —— y D. F. Alonso, “Herramientas moleculares aplicadas al diagnóstico del cáncer”, en ADN: 50 años no es nada. Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004. Goodwin, W. et al., “DNA profiling: the forensic magic bullet”, The Biochemical Society / Golden Jubilee, The Biochemist, (4), 2003, pp. 12-14. Graham, S., “Synthetic peptide may succeed where antibiotics have met with resistance”, Scientific American.com, julio 26, 2001. Disponible en <http://www.sciam.com>. Gray, N., “Untying the Gordian knot”, Pharmaceutical Executive, mayo 2005. Disponible en <http://www.pharmexec.com>. Grey, S., “Genetic Engineering & Xenotransplantation”, 2000. Disponible en <http://www. actionbioscience.org/biotech/grey.html>. Grimm, D. y A. Kay, “Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time?”, J. Clin. Invest., 117 (12), 2007, pp. 3633-3641. Grupo Empresas Farmaceuticas SIDUS, <http//www.sidus.com.ar>. Guido, R. V. C. et al., “Planejamento de fármacos, biotecnologia e química medicinal: aplicações em doenças infecciosas”, Estudos Avançados, 24 (70), 2010, pp. 81-98. 419 Biotecnología Guimarães Pimenta, C., “O ambiente institucional da Biotecnologia voltada para a saúde humana no Brasil”, Dissertação de mestrado, Brasilia, Universidade de Brasília, 2008, <http://www.unbcds.pro.br/publicacoes/CleilaGuimaraes.pdf>. Gwynne, P. y G. Heebner, “Genomic revolution”, Science, enero 26, 2001. Disponible en <http://www.sciencemag.org/feature/e-market/benchtop/fungen.shl>. Hajeri, P. et al., “siRNA: their potential as therapeutic agents -Part II. Methods of delivery”, Drug Discovery Today, 14, 2009, pp. 17-18. <http://www.drugdiscoverytoday.com>. Hardiman, G., “ Applications of microarrays and biochips in Pharmacogenomics”, Methods in Molecular Biology, 448, Humana Press, 2008. Harrell, E., “The desperate need for new antibiotics”, Time.com, 2009, <http://www.time. com/time/health/article/0,8599,1926853,00.html>. Harvard Stem Cell Institute, Stembook, <http://www.stembook.org>. Health A to Z, “Tissue typing”. Disponible en <http://www.healthatoz.com/healthatoz/Atoz/ ency/tissue_typing.html>. Henderson, J. M., “Bioterrrorism: are we prepared?”. Disponible en <http://www. actionbioscience.org>. Hirchler, B., “World’s top-selling drugs in 2014 vs. 2010”, Reuters, 2010, <http://www.reuters.com/article/2010/04/13/roche-avastin-drugs-idUSLDE63C0BC20100413>. Hiss, H., “Produção de vacinas”, en Biotecnologia Industrial. Vol. 3: Processos fermentativos e enzimáticos, San Pablo, Editora Edgar Blucher, 2001. History of Biowarfare, <http://www.pbs.org/wgbh/nova/bioterror/hist_nf.html>. History of Vacines, <http://history of vacines.org>. Hoffman, A., “RNA interference therapies – A risky business?”. Disponible en <http://www. beremans.com/pdf/RNA_interference_ therapies_a_RISCy_business.pdf>. Holland, C. A. y F. L. Kiechle, “Point-of-care molecular diagnostic systems – past, present and future”, Current Opinion in Microbiology, 8, 2005, pp. 504-509. Hollon, T., “The biodefenders”, Signals Magazine. Disponible en <http://www.signalsmag. com>. ——, “The current status of cancer treatment”, The Scientist, 17 Issue supplement 2, S34, 2003. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14129/>. Homedes, N., “¿Se puede hablar de políticas de genéricos en América Latina?, RESPYN, 5 (1), 2004. Disponible en <http://www.uanl.mx/publicaciones/respyn/v/1/editorial/>. Homma, A., “História da Medicina: vacinas e soros nacionais”, Revista Ser Médico, 20, julio 2002, CREMESP. Hornstein, E. y N. Shomron, “Canalization of development by microRNAs”, Nature Genetics, 38, S20-4, 2006. Houdebine, L. M., “La production de médicaments par les OGM”, Conférence donnée à Agropolis-Museum, 4/10/2001. Human Genome Project Information, “Pharmacogenomics”. Disponible en <http://www. ornl.gov>. Human Genome Resources, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/>. Humphries, C., A Stem-Cell Therapy for Blindness, <http://www.technologyreview.com>. 420 Bibliografía International Diabetes Federation, <http://www.idf.org>. Immunecentral, <http://www.immunecentral.com>. Immunology Course Outline, <http://pleiad.umdnj.edu/pathology_course/webpath/ immunol/immunidx.htm>. Industrie Canada, Direction Générale des Sciences de la Vie, “Tests génétiques”. Disponible en <http://strategis.ic.gc.ca/SSGF/tc00024f.html>. Industrie Canada, Direction Générale des Sciences de la Vie, “L’ industrie biopharmaceutique: vue d’ensemble, perspectives et défis concurrentiels”. Disponible en <http:// strategis.ic.gc.ca/SSGF/bo01873f.html>. Information on Clinical Trials and Human Research, <http://www.clinicaltrials.gov>. Institut National de la Recherche Agronomique, “Les applications de la biotechnologie”, 2003. Disponible en <http://www.inapg.inra.fr>. Instituto Butantan, <http://www.butantan.gov.br>. Instituto de Tecnologia de Parana, <http://www.tecpar.br>. Instituto de Tecnologia em Imunonobiológicos / Biomanguinhos, <http://www.bio. fiocruz.br>. Instituto do Milênio em Bioengenharia Tecidual, <http://www.imbt.org.br>. Instituto Leloir, <http://www.leloir.org.ar>. Instituto Nacional de Biodiversidad, <http://www.inbio.com>. International Hapmap Project, <http://www.hapmap.org>. Jackson, P. D. y J. J. Harrington, “High-throughput target discovery using cell-based genetics”, Drug Discovery Today, 10 (1), 2005, pp. 53-60. Kansaon, M., “Transplantes e respostas imunes”. Disponible en <http://www.infomed.hpg2. ig.com.br/transplante.html>. Kellam, P., “Attacking pathogens through their hosts”, Genome Biology, 7, 2006. Kfoury, C., “Therapeutic cloning: promises and issues”, McGill Journal of Medicine, 10 (2), 2007, pp. 112-120. Kiatpongsan, S. y D. Sipp, “Monitoring and Regulating Offshore Stem CellClinics”, Science, 20 (23), 2009, pp. 1564-1565. Kidshealth, “An introduction to genetics and genetic testing”, <http://www.kidshealth.org>. Kimball’s Biology Pages, <http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages>. Kolata, G., “Add Patience to a Leap of Faith to Discover Cancer Signatures”, The New York Times, 18/07/2011. Disponible en <http://www.newyorktimes.com>. Krützfeldt, J. et al., “Strategies to determine the biological function of microRNAs”, Nature Genetics, 38, 2006. Kuschel, M., Lab-on-a-chip technology — Applications for Life Sciences, Agilent Technologies, <http://www.chem.agilent.com/Library/articlereprints/Public/59883035.pdf>. La Recherche (Dossier), “Les xénogreffes ont-elles um avenir?”, La Recherche, 320, 1999, pp. 57-68. ——, “Thérapie génique: une nouvelle frontière pour la recherche médicale”, La Recherche, 315, 1998, pp. 51-66. La Villette/Cité des Sciences et de L’ Industrie, <http://www.cite-sciences.fr>. 421 Biotecnología Lab Tests Online, <http://www.labtestsonline>. Lander, A. D.,” The ‘stem cell’ concept: is it holding us back?”, Journal of Biology, 8 (8), 2009. ——“The individuality of stem cells”, BMC Biology, 9(40), 2011. Lanza, R. y N. Rosenthal, “The Stem cell challenge”, Scientific American, 2004. Disponible en <http://www.sciam.com>. Lawson, M. y A. L. Lawson, “Investigating the antibiotic resistance problem”, The American Biology Teacher, (60) 6, 1998, pp. 412-417. Leader, B. et al., “Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification”, Nature Reviews / Drug Discovery, 7, 2008, pp. 21-39. Leclerc, C., “Des vaccins d’un nouveau type à l´assaut du cancer”, La Recherche, 364, 2003, pp. 38-44. Lema, M., Guerra biológica y bioterrorismo, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002. Lemonick, M. D. y A. Park, “Vaccines stage a comeback”, Time, 21/1/2002 y 27/1/2002. Disponible en <http://www.time.com/time/covers/1101020121/vaccine.html>. Lesney, M., “Gene therapy”, Modern Drug Discovery, enero 2003, pp. 23-27. Levine, M. M., “Immunogenicity and efficacy of oral vaccines in developing countries: lessons from a live cholera vaccine”, BMC Biology, 8, 2010. Levitt, M., “The ethics and impact on behaviour of knowledge about one’s own genome”, British Medicine Journal, 319, 1999. Lewis, C., “Home diagnostic tests: the ultimate house call?”. Disponible en <http://www. fda.gov>. Lewis, R., “Stem cells… An emerging portrait”, The Scientist, 19 (13), 2005, <www.thescientist.com/article/display/15592/>. ——, “Vaccines: victims of their own success?”, The Scientist, 18 (14), 2004. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14828/>. ——, “DNA expression profiling: a new lens on cancer”, The Scientist, 17 Issue supplement 2, S22, 2003. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14125/>. ——, “Genetic testing timeline”, The Scientist, octubre 20, 2003. ——, “Porcine possibilities”, The Scientist, 14 (20), octubre 16, 2000. ——, Human genetics: Concepts and applications, 4ª ed., Nueva York, The Mc Graw Hill Higher Education, 2001. Linden, R., “Terapia gênica: o que é, o que não é e o que será”, Estudos Avançados 24 (70), 2010. Little, S., “Personalized medicine: seven keys to success”, The Scientist, 20 (1). Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/18849/>. Liu, M. A. y J. B.Ulmer, “Plasmid DNA technology”, The Biochemist, 4, 2003, pp. 21-24. Lombardino, J. G. y J. A. Lowe III, “The role of the medicinal chemist in drug discovery – then and now”, Nature Reviews / Drug Discovery, 3 (10), pp. 853-862. López, M. et al., “Microarrays y biochips de DNA”, Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica, 2002, <http://www.gen-es.org/12_publicaciones/ docs/pub_67_d.pdf>. Lucentini, J., “Antibiotics arms race heats up”, The Scientist, 17 (29), 2003. 422 Bibliografía Lyall, S., “A country unveils its gene pool and debate flares”, febrero 16, 1999. Disponible en <http://www.nytimes.com>. Lynch, M., “God’s signature: DNA profiling, the new gold standard in forensic science”, Endeavour, 27 (2), 2003, pp. 93-97. Maggon, K., “Rise of Biologicals”. Disponible en <http://www.expresspharmapulse. com/20040205/editorial02.shtml>. ——, “Biotech segment: moving ahead of pharma industry”, 2005. Disponible en <http:// www.expresspharmapulse.com/20050428/edit02.shtml>. Maher, B. A., “Vaccines on trial: HIV”, The Scientist, 18 (11), 2004. Disponible en <www. the-scientist.com/article/display/14734/>. Malajovich, M. A., Biotecnologia, Río de Janeiro, Editora Axcel Books do Brasil, 2004. ——, Biotecnología, Bernal, Universidad Nacional de Quilmes Editorial, 2006. Mancinelli, L. et al., “Pharmacogenomics: the promise of personalized medicine”, AAPS Pharmsci, 2 (1), 2000. Disponible en <http://www.pharmsci.org/ScientificJournals/pharmsci/ journal/4.html>. Marshall S. y G. Arenas, “Antimicrobial peptides: a natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology”, Electronic Journal of Biotechnology, 6 (2), 2003. Martins Menck, C. F., “A nova grande promessa da inovação em fármacos: RNA interferência indo do laboratório para a clínica”, Estudos Avançados 24 (70), 2010. Marx, G., “Cuba cutting ‘world class’ trail in biotechnology research”, 19/12/2005. Disponible en <http://www.checkbiotech.org>. McCook, A., “Hwang faked results, says panel”, The scientist news. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/news/20051223/02/>. McMichael, A. J., “Paleoclimate and bubonic plague: a forewarning of future risk?”, BMC Biology, 2010, 8: 108. Medical Research Council, “Stem cell therapy”, < http://www.mrc.ac.uk>. Medline Plus, <http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/medlineplus.html>. Meeusen, E. N. T. et al., “Current status of veterinary vaccines”, Clinical Microbiology Reviews 20 (3), 2007. Menck, C., “A nova grande promessa da inovação em fármacos: RNA interferência saindo do laboratório para a clínica”, Estudos Avançados 24 (70), 2010. Merck, <http://www.merck.com>. Miller, Stacy K., “Therapeutic Mabs: saving lives and making millions”, The Scientist, 19 (3), 2004. Disponible en <http://www.the-scientist.com/2005/02/14/17>. Minger, S., “Stem cell research-Ethics and geography”, The Biochemist, 28 (1), 2006. Mitra, J., “Pharmaceutical industries: do they prefer treatment to cure?”, The Biochemist, 6, 2005. MIT, Technology Review, <http://www.technologyreview.com>. Moir, D. T. et al., “Genomics and antimicrobial drug discovery”, Genomics and antimicrobial drug Discovery, 43 (3), 1999, pp. 439-446. Molecular Therapy Organization, <http://www.moleculartherapy.org>. 423 Biotecnología Moreaux, C., “Autour des biotechnologies: des enjeux sociaux, économique, éthiques”, Pharmaceutiques, 67, 1999. Moreira-Filho, C. A. y S. Verjovski-Almeida, “Genoma Clínico”, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 162-167, encarte especial. Morel, C. M., “Neglected diseases: under-funded research and inadequate health interventions”, EMBO reports, vol. 4, special issue, 13 de noviembre 2003. Muotri, A. R., “Células-tronco pluripotentes e doenças neurológicas”, Estudos Avançados, 24 (70), 2010. National Cancer Institute, “Understanding cancer series”, <http://www.cancer.gov/cancertopics/ understandingcancer>. National Center for Biotechnology Information, “Pharmacogenomics factsheet”. Disponible en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html>. National Center for Human Genome Research, <http://www.nchgr.nih.gov>. National Health System, “Genetics”. Disponible en <http://www.nhsdirect.nhs.uk>. National Institute for General Medical Sciences, “Medicines by design: The Biological Revolution in Pharmacology”, 1997, 2003. Disponible en <http://www.nigms.nih.gov>. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, “Understanding vaccines”, 2003. Disponible en <http://www.niaid.nih.gov>. National Institute of Drug Abuse, “Nicotine vaccine shows promise for combating tobacco addiction”, 1999. Disponible en <http://www.drugabuse.gov/MedAdv/99/NR-1217. html>. National Institute of Health, “Stem cells information”, 2005. Disponible en <http:// stemcells.nih.gov/info/basics/>. National Marrow Donor Program, <http://www.marrow.org/PATIENT/match_process.html>. Nature, <http://www.nature.com>. Nature Genome Gateway, <http://www.nature.com/genomics/links/>. Nature Reviews, “RNAi collection”, 2003. Disponible en <http://www.nature.com>. New Scientist, <http://www.newscientist.com>. Norrgard, K., “Gene Therapy”, Nature Education, 1 (1), 2008, <http://www.nature.com/ scitable/topicpage/gene-therapy-760>. Novo Nordisk, <http://www.novonordisk.com>. Nuffield Council on Bioethics, <http://www.nuffieldbioethics.org>. O’Connor, T. P. y R. G. Crystal, “Genetic medicines: treatment strategies for hereditary disorders”, Nature Genetics Reviews, 7, 2006. Office International Des Epizooties (OIE), <http://www.oie.int>. Ogihara, N., “Drawing out Drugs”, Modern Drug Discovery, septiembre 2003. Okita, K. y S. Yamanaka, “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells”, PLoS ONE, 6 (7), 2011. Oliveira, W., “A pele multiplicada e guardada em um banco”, 2002. Disponible en <http:// galileu.globo.com/edic/91/saude1.htm>. Oliveira Diniz, M. y L. C. Souza Ferreira, “Biotecnologia aplicada ao desenvolvimento de vacinas”, Estudos Avançados 24 (70), 2010. 424 Bibliografía Online Mendelian Inheritance in Man, McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, Johns Hopkins University-Baltimore, and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 2000. <http://www.ncbi.nlm.nih/gov/omim>. Optimal Rapid Malaria Test, <http://www.malariatest.com>. Organisation for Economic Co-Operation and Development, “Tests génétiques: espoirs et enjeux”. Disponible en <http://www.oecd.org/document/12/ 0,2340,en_2649_201185_ 2013644_119690_1_1_1,00.html>. Paes de Carvalho, “A Extracta pesquisa 30 mil compostos naturais brasileiros”, revista Brasil Sempre, <www.insightnet.com.br/brasilsempre>. Pagon, R., “A Genetic testing: the clinical interface of the Human Genome Project. An approach for biology teachers”. Disponible en <http://www.genetests.org>. Pak, J. W., “Immunotherapy Cancer Treatment”. Disponible en <http://www. cancersupportivecare.com/immunotherapy.htm>. Palese, P., “Influenza: old and new threats”, Nature Medicine, 10 (12), 2004. Pallarito, K., “Fueling the fires of RNA interference”, The Scientist, 18 (17), 2004. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/14924/>. Pan, R., “Caenorhabditiselegans: The Heavyweight Champ of Gene Knockout Technology”, Bioteach Journal, 2, 2004. Parmiani, G. et al., “Universal and Stemness-Related Tumor Antigens: Potential Use in Cancer Immunotherapy”, Clin.Cancer Res., 13, 2007. Parry, J., “Froms SARS to avian flu: vaccines on the scene”, The Scientist, 19 (5), 2005. Disponible en <http://www.the-scientist.com/article/display/15315/>. Pavlou, A. K. y J. M. Reichert, “Recombinant protein therapeutics – success rates, market trends and values to 2010”, Nature Biotechnology News, 6/12/2004. Disponible en <http://www.nature.com/news/2004/041206/pf/nbt1204-1513_pf.html>. Payne, D. y A. Tomasz, “Antimicrobials. The challenge of antibiotic resistant bacterial pathogens: the medical need, the market and the prospects for new antimicrobial agents”, Current Opinion in Microbiology, 7, 2004, pp. 435-438. Pecorino, L., “Stem cells for cell-based therapies”. Disponible en <http://actionbioscience. org/biotech/pecorino2.html>. Pelczar, M. J. et al., Microbiologia: conceitos e aplicações. Vol. 2, 2ª ed., San Pablo, Makron Books, 1996. Pena, S. D., “A vida na era pós-genômica”, entrevista, Jornal da ANBio, 1, Río de Janeiro, 2002. Penchaszadeh, V. B., “Del genoma a la salud”, en ADN: 50 años no es nada, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. Pfizer, <http://www.pfizer.com>. Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, <http://www.phrma.org>. Pharmacorama, <http://www.pharmacorama.com>. Philips, T., “Genetically modified organisms (GMOs): transgenic crops and recombinant DNA technology”, Nature Education, 1 (1), 2008. Pincock, S., “Gene doping at Torino?”,  The Scientist, 2006, <http://www.the-scientist.com/ news/display/23101/>. 425 Biotecnología Pitossi, F. y O. Podhajcer, “Terapia génica”, en ADN: 50 años no es nada, Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004. Pittsburg Tissue Engineering Initiative, <http://www.ptei.org>. Playfair, J., Infection and Immunity, Londres, Oxford University Press, 1995. Polak, J. y L. Hench, “Gene Therapy Progress and Prospects in Tissue Engineering”, Gene Therapy, 12 (24), 2005, pp. 1725-1733. Polio Eradication, <http://www.polioeradication.org>. Politi, P. M., “Vacunas en la terapia del cáncer”, 3/2005. Disponible en <http://www. cancerteam.com.ar/poli150.html>. Pollack, A., “Europe rejects genetically engineered drug”, 25/2/2006. Disponible en <http:// www.checkbiotech.org>. ——, “Drugmakers’ Fever for the Power of RNA Interference Has Cooled”, The New York Times, 2011. Disponible en <http://www.nytimes.com/2011/02/08/science/08rna. html?pagewanted=all>. Preston, R., “The demon in the freezer”, The New Yorker, julio 12, 1999, pp. 44-61. ——, “The bioweaponeers”, The New Yorker, marzo 9 1998, pp. 52-65. Projan, S. J., “Why is big Pharma getting out of antibacterial drug Discovery?”, Current opinion in Microbiology, 6, 2003, pp. 1-4. Public Broadcasting Services, “History of biowarfare”. Disponible en <http://www.pbs.org/ wgbh/nova/bioterror/hist_nf.html>. ——, “Making vaccines”. Disponible en <http://www.pbs.org/wgbh/nova/bioterror/vaccines. html/>. PRWEB Press Releases, <http://www.prweb.com>. Rabinovitch, L., “Saúde pública: situação atual e necessidade de pesquisa de controle biológico de vetores de importância para a saúde pública”. Disponible en <http://www. biotecnologia.com.br/bio01/1hp_14.asp>. Ramachandra, R., “Vaccines: the path to immunity”, Evolutions, 13 (1), 2009. Randerson, J., “Scientists raise spectre of gene-modified athletes”, New Scientist, 2001. Disponible en <http://www.newscientist.com>. Raskin, I. et al., Trends in Biotechnology, 20, 12, pp. 522-531. Raw, I., “Entrevista”. Disponible en <http://www.drauziovarella.com.br>. Reichert, J. y A. Pavlou, “Monoclonal antibodies market”, Nature Reviews/ Drug discovery, 3, 2004. Reinach, F., “O dilema das vacinas transgênicas”, O Estado de São Paulo, 30/11/2005. Revista Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, <http://www.biotecnologia.com.br>. Revista Capital, “Bienvenidos al Bio-Boom. Reportajes y entrevistas”, Revista Capital, 282, 13 a 26 de agosto, 2010. Revista Riopharma, <http://www.crf-rj.org.br/revista/index.htm>. Rezaie, R. et al., “Brazilian health biotech—fostering crosstalk between public and private sectors, Nature Biotechnology, 26 (6), 2008. Ribeiro, E. y M. Ricci, “Insulina, classificação”. Disponible en <http://www.hu.usp.br/ farmacia/BOLETIM_4_1999.htm>. 426 Bibliografía Riley, D. E., “DNA testing: An introduction for non-scientists / an illustrated explanation”. Disponible en <http://www.scientific.org/tutorials/articles/riley/riley.html>. Rios, S., “Crearon una piel artificial que libera proteínas terapéuticas”. Disponible en <http:// wwwprodiversitas.bioetica.org/prensa39.htm>. Roberts, P., “Gene therapy’s fall and rise (again)”, The Scientist, 18 (18), 2004. Disponible en <www.the-scientist.com/article/display/14947/>. Robey, R., “Stem cell trial to treat blindness launched in US”, Bio News, 20/06/2011, <http://www.bionews.org.uk/page_97335.asp>. Robinson, R., “RNAi Therapeutics: How Likely, How Soon?”, PLoS Biol 2 (1), 2004. Rocha, K. B. et al., “Novas drogas e patentes”, 2/2003. Disponible en <http://www.abifarma. com.br>. Roche Diagnostics – Roche Molecular Diagnostics, “PCR applications”. Disponible en <http://www.roche-diagnostics.com/ba_rmd/pcr_applications.html>. Roche Molecular Biochemicals, “PCR Application manual”. Disponible en <http://www. roche-applied-science.com>. Roslin, Institute, <http://www.roslin.ac.uk>. Rubin, L. y K. M. Haston, “Stem cell biology and drug discovery”, BMC Biology  9 (42), 2011. Ruffié, J., Naissance de la médecine prédictive, París, Editions Odile Jacob, 1993. Rumsey, D. H. y D. J. Ciesielski, “New protocols in serologic testing: a review of techniques to meet today´s challenges”, Immunohematology, 16, 2000. Samson, C., “Systems biology in the pharmaceutical industry”, The Biochemist, 6/2005. Sandel, M. J., “Embryo ethics. The moral logic of stem-cell research”, N.Engl.J.Med 351(3):207, 2004. Disponible en <http://www.nejm.org>. Sanger Institute, “El projecto HapMap”. Disponible en <http://www.sanger.ac.uk/Users/ mdc/hapmapes.html>. Sasson, A., Medical Biotechnology: achievements, prospects and perceptions, Tokyo, United Nations University Press, 2005. Scanlon, K. J., “Anti-Genes siRNA, Ribozymes and Antisense”, Current Pharmaceutical Biotechnology, 5 (5), 2004. Schatzmayr, H. G., “Vacinas no limiar do século”. Disponible en <http://www.biotecnologia. com.br/bio02/hp_14.asp>. Schmid, P., “New anti-infective drugs”. Disponible en <http://agriculture.de/acms1/cong6/ ws5bdrugs.htm>. Schmidt, C. W., “Therapeutic interference”, Modern Drug Discovery, julio 2003, pp. 37-42. Schipani, V., “Normal today, cancer tomorrow”, The Scientist, 06/01/2011. Disponible en <http://www.the-scientist.com/news/print/57907>. Science & Decision, “L´industrie des biotechnologies: biotechnologies et diagnostic medical”. Disponible en <http://www.science-decision.net>. Science News Focus, “Polio: the final assault?”, Science, 303 (3), 2004, pp. 1960-1971. <http://www.sciencemag.org>. 427 Biotecnología Scitable by Nature Education, < www.nature.com/scitable>. Scott, A., “The human genome on a chip”. Disponible en <http://www.biomedcentral.com/ news/20031003/07>. Scott, C., “Angola rejects GM food aid”, 2/04/2004, <http://www. checkbiotech.org>. Scudellari, M., “The iPSC-ESC gap-Human cells reprogrammed into multipotent stem cells display fundamental differences from true embryonic stem cells”, The Scientist, 02/02/2011. Disponible en <http://www.the-scientist.com/news/print/57971/>. Sellers, L. J., “The push for generics”, Pharmaceutical Executive, octubre 2002. ——, “The year 2001 will stand out in any historical accounting”, Pharmaceutical Executive, mayo 2002. Shine, B., “Nicotine vaccines moves toward clinical trials”. Disponible en <http://www. drugabuse.gov/NIDA_Notes/NNVol15N5/Vaccine.html>. Shone, C., “Protection against covert releases: preparing for the worst”, The Biochemist, 4, 2004, pp. 23-25. Simon, E., “Human gene therapy: genes without frontiers?”, The American Biology Teacher, 64(4), 2002, pp. 264-270. Singer, E., “Investing in Banks of Stem Cells”, Technology Review, 18/06/2010. Disponible en <www.technologyreview.com/biomedicine/25632>. ——, “Cell Transplants for Macular Degeneration”, Technology Review, 23/06/2010. Disponible en <http://www.technologyreview.com/biomedicine/25647/>. ——, “Making Genomics Routine in Cancer Care”, Technology Review, 08/07/2010. Disponible en <www.technologyreview.in/biomedicine/37993/?mod=more>. ——, “Patients Facing Blindness to Test Therapy with Stem Cells”, Technology Review, 03/05/2011. Disponible en <www.technologyreview.com/biomedicine/27040>. Sipp, D., “Why unproven, risky medical practices elude legal restrictions”, Nature Reports Stem Cells, <http://www.nature.com/stemcells/index.html>. Smith, A., “Screening for drug”, Discovery Nature, 2002, pp. 118453-118459. Smith, R. y R. C. Renaud, “Vaccines of the future”, Nature, 2, pp. 767-768. Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD),<http://www.diabetes.org.br>. Solère, B., Immunologie, París, Presses Universitaires de France, 1997. Somia, N. y I. Verma, “Gene Therapy: Trials and tribulations”, Nature Reviews Genetics, 1, 2000, pp. 91-99, <http://www.nature.com>, <http://www.nature.com/nrg/journal/v1/ n2/full/nrg1100_091a.html>. Sommer, S. Genética, clonación y bioética. Buenos Aires, Editora Biblos, 1998. ——, De la cigueña a la probeta, Buenos Aires, Editora Planeta, 1994. Spar, D., “The business of stem cells”, N.Engl.J.Med 351(3):211-213, 2004. Disponible en <http://www.nejm.org>. Stangle-Castor, N., “The past, present and future of genetic testing for disease”, 2000. Disponible en <http://www.office.com>. Steenhuysen, J., “Banking stem cells could save Japan nuclear workers”, Reuters, 15/4/2011. Disponible en <http://www.msnbc.msn.com/id/42599855/ns/42777244>. Stix, G., “What clones?”. Disponible en <http://www.sciam.com 24/12/2001>. 428 Bibliografía Stratton, M. et al., “The cancer genome”, Nature, 458, 2009, pp. 724-729. Disponible en <www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07943.html>. Strausberg, R. et al., “Oncogenomics and the development of new cancer therapies”, Nature 429, 2004, pp. 469-474. Disponible en, <http://www.nature.com/nature/journal/v429/ n6990/full/nature02627.html>. Strokes, T., “Human experiment guidelines reviewed”, The Scientist News, 13/01/2006. Disponible en <http://www.the-scientist.com/news/display/22946/>. Suavinho Ferro, E., “Biotecnologia translacional: hemopressina e outros peptídeos intracelulares”, Estudos avançados, 24 (70), 2010. Suradhat, S., “Biotechnology in veterinary vaccine development”, <http://www.micro.vet. chula.ac.th/.../51-biotechnology-in-veterinary-vaccine-development>, <http://www. micro.vet.chula.ac.th/index.php/doc/doc_download/51-biotechnology-in-veterinaryvaccine-development>. Technology Review, <http://www.technologyreview.com/>. Teixeira, D., “Segundo Movimento”, 19/11/2003. Disponible en <http://www.terra.com.br/ istoedinheiro?/325/negocios/325_segundo>. Temple, L. et al., “Defining disease in the genomic era”, Science, 293, 2001, pp. 807-808. The Biochemical Society, “Gene Therapy”, The Biochemist, 30 (3), 2008. The City of New York, Department of Health, Tuberculosis Control Program, “Diagnosis: rapid diagnostic tests for tuberculosis”. Disponible en <http://www.nyc.gov/health>. The Global Alliance for Vaccines and Immunization, <http://www.vaccinealliance.org>. The Institute for Genomic Research, <http://www.tigr.org>. The International Development Research Centre, “Assessing the benefits of bioprospecting in Latin America”. Disponible en <http://web.idrc.ca>. The International Hap Map Consortium, “A haplotype map of the human genome”, Nature, 437 (27), 2005, pp. 1299-1320. The Internet Pathology Laboratory for Medical Education, “Immunology Course Outline”, Florida State University College of Medicine. Disponible en <http://www.bibl.liu.se/etj2/ webpath/immunol/immunidx.htm>. The National Institutes of Health, <http://www.nih.gov>. The Scientist, <http://www.the-scientist.com>. The Scientist, <http://www.the-scientist.com>. The Tissue Engineering Show, <http://ptei-brains.cfa.cmu.edu/grad/index.php>. The Wellcome Trust, <http://www.wellcome.ac.uk>. The Wellcome Trust Sanger Institute, <http://www.sanger.ac.uk>. The Whitaker Foundation, “Tissue engineering”, Annual report, 1995. Disponible en <http://www.whitaker.org/95_annual_report/tissue 95.html>. Thomas, C. et al., “Progress and Problems with the use of viral vectors for gene therapy”, Nature Reviews Genetics, 4, 2003. Thomson, C. J. et al., “Antibacterial research and development in the 21st century – an industrial perspective of the challenges”, Current Opinion in Microbiology, 7, 2004, pp. 445-450. 429 Biotecnología Trejo Estrada, S. R. et al., “Situación de la Biotecnología en el mundo”, Resumen Ejecutivo, parte 1. Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada – IPN Unidad Tlaxcala, México. Disponible en <http://www.economia.gob.mx/swb/es/economia/ Biotecnologia>. —— y C. Ramírez López, “Situación de la Biotecnología en México y su factibilidad de desarrollo”, Resumen Ejecutivo, parte 2. Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada – IPN Unidad Tlaxcala, México. Disponible en <http://www.economia.gob. mx/swb/es/economia/Biotecnologia>. Tulp, M. y L. Bohlin, “Unconventional natural sources for future drug discovery”, Drug Discovery Today, 9 (10), 2004. Disponible en <http://www.drugdiscoverytoday.com>. Tyer, D., “Sanofi to research new types of antibiotics”, Inpharm news, 07/06/2011, <http:// www.inpharm.com/news/161747/sanofi-rib-x-pharmaceuticals-antibiotics-research>. UK Biochemistry Society, “Biological Welfare”, The Biochemist, vol. 26, Nº 2, abril 2004. UK Vaccine Industry Group, <http://www.uvig.org/faqsheets/index.asp>. Unicef, Communiqué de presse: “L´Unicef affirme que l´approvisionnement em vaccins de l´enfance est menacé”. Disponible en <http://www.unicef.org/french/newsline/pr/2002/ 02pr15capetownfr.htm>. University of Rochester, “New ‘DNA chip’ rapidly detects, identifies dangerous pathogens”, Press releases. Disponible en <http://www.rochester.edu>. University of Wisconsin-Madison, “Embryonic stem cells”. Disponible en <http://www. news.wisc.edu/packages/stemcells/index.html>. US Food and Drug Administration, “Cellular and gene therapy”. Disponible en <http:// www.fda.gov>. Vaishnaw, A. et al., “A status report on RNAi therapeutics”, Silence, 1 (14), 2010. Vasileva A. y R. Jessberger, “Precise hit: Adeno-Associated virus in gene targeting”, Nature Reviews Microbiology, 3, 2005, pp. 837-847. Veiga Junior, V. F. et al., “Plantas medicinais: cura segura?”, Quim.Nova, 28 (3), 2005, pp. 519-528. Veiga Pereira, L., Clonagem: Fatos & Mitos, San Pablo, Editora Moderna, 2002. Voelter-Mahlknecht, S. y U. Mahlknecht, “Darwinism and pharmacogenomics: from ‘one treatment fits all’ to ‘selection of the richest’”. Disponible en <http://mendel.ugr.es/ genysoc/pdfs/pharmacogenomic.pdf>. Veritas Medicine, “Diabetes current tratment: overview”. Disponible en <http://www. veritasmedicine.com>. Veterinária Atual, <http://www.veterinaria-atual.pt/homepage.aspx?menuid=1>. Vezina, K., “First Fully Synthetic Organ Transplant Saves Cancer Patient”, Technology Reviews 8/7/2011. Disponible en <http://www.technologyreview.com/biomedicine/38003/>. Wade, N., “Stem Cells May Be Key to Cancer”, The New York Times, 21/02/2006, <www. nytimes.com/2006/02/21/health/21canc.html>. Walker, M., “Is modifying genes playing God?”, 18/3/2004. Disponible en <http://www. checkbiotech.org>. Wallis, G., The genetic basis of human disease, Manchester, The Biochemical Society, 1999. 430 Bibliografía Warner, S., “The return of vaccines”, The Scientist, 19 (22), 2005. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/article/display/15883/>. ——, “The tribulations of clinical trials”, The Scientist, 18 (8), 2004. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/yr2004/apr/feature_040426.html>. Wasi, S., “RNA interference: the next genetics revolution? Understanding the RNAissance”, Nature, mayo 2003. Waters, R., “Stem Cells From Own Eyes Restore Vision to Blinded Patients, Study Shows”, Bloomerg, 18/06/2010. Disponible en <http://www.bloomberg.com/news/2010-06-18/ blinded-patients-gain-sight-with-stem-cells-implanted-from-their-own-eyes.html>. Weiner, D. B. y R. C. Kennedy, “Genetic Vaccines”, Scientific American, 0799 issue. Welham, M. J., “Embryonic stem cells - Past, present and future”, The Biochemist, 28 (1), 2006. Weston, D., <http://www.biohouston.org/uploads/dweston72403.pdf>. Willis, R. C., “What is phase zero?”, The Scientist, 19 (20), 2005. Disponible en <http:// www.the-scientist.com/article/display/15806/>. Whitehead, K. et al., “Knocking down barriers: advances in siRNA delivery”, Nature Reviews Drug Discovery, 8, 2009, pp. 129-138. Willerth, S. M. y S. E. Sakiyama-Elbert, “Combining stem cells and biometrial scaffolds for constructing tissues and cell delivery”, Stembook, 2008. Disponible en <http://www. stembook.org/node/450>. Williams, S., “Young again - Niche cells can reverse the aging of stem cells”, HHMI Bulletin, 2010. Winkler, K. E., “Killing the messenger”, Nature reviews /Drug Discovery, 3, 2004, pp. 823-824. Wong, D. J. y H. Y. Chang, “Skin tissue engineering”, Stembook, 2009, <http://www.stembook.org/node/582>. World Health Organisation, “Vaccines, immunization and biologicals: the history of vaccination”. Disponible en <http://www.who.int/vaccines-diseases/history/history.shtml>. ——, “Consultation on priority public health interventions before and during an influenza pandemic; Working group four; better vaccines, better access”. Disponible en <http://www. who.int/entity/csr/disease/ avian_influenza/Better_vaccines_better_access.pdf>. ——, “Genomics and World Health. Report of the Advisory Committee on Health Research, 2002”. Disponible en <whqlibdoc.who.int/hq/2002/a74580.pdf>. Wulfkuhle, J. et al., “Proteomic applications for the early detection of cancer”, Nature Reviews, 3, 2003, pp. 267-275. Yarranton, G., “The Dawn of molecular medicine”, MRC news, 76, invierno 1997. Yee, J., “Turning Somatic Cells into Pluripotencial Stem Cells”, Nature Education, 3 (9), 2010, p.25. Zatz, M., “Contribuições da Biologia Molecular para a compreensão e prevenção dos problemas genéticos”, Ciência e Saúde Coletiva, 7, San Pablo, 2002. ——, “O que é célula-tronco?”, Notícias, 2001. Disponible en <http://anbio.org.br/noticias/ celula-tronco>. Zielinska, E., “Building a better mouse”, The Scientist 24 (4), 2010, p. 34. Zilli, A., “Terapia Génica”. Disponible en <http://www.cib.org.br>. 431 Índice temático A Abbott, 323, 342, 349, 358, 368 Accord, 240 Aceitunas, 60, 61, 271 Acetobacter, 114, 175 Acetona, 31, 33, 34, 60, 61, 71, 107, 109, 171, 172, 175, 176 Ácido acético, 45, 61, 109, 175, 176, 274, 282 Ácido ascórbico, véase también vitamina C, 125, 178 Ácido cítrico, 34, 64, 72, 107, 175, 282 Ácido glutámico, 61, 176, 177 Ácido láctico, 34, 61, 70, 109, 110, 111, 176, 180, 272, 274, 279, 282 Ácidos grasos, 60, 109, 110, 174, 244, 264, 291 Ácidos nucleicos, 41, 45, 77, 89, 90, 91, 93, 109, 135, 149, 196, 255, 281, 324, 326, 327, 328 Acuicultura, 63, 263, 266 Adenosina deaminasa (ADA), 36, 373 Adenovirus, 66, 163, 374 Aditivos, 31, 60, 63, 107, 115, 129, 174, 177, 272, 273, 282, 286, 289, 297, 298 ADN, ácido desoxirribonucleico, 89 ADN, como agente biológico, 103 ADN, tecnología del, 135, 149, 150, 152, 158, 210, 235, 278, 285, 306, 307, 351, 353, ADN basura, 100 ADN exógeno o foráneo, 129, 152, 156, 158, 160, 161, 163, 165, 166, 300 ADN polimerasa, 79, 142, 143, 145 ADN recombinante, véase también ingeniería genética, 35, 36, 149, 150, 152, 157, 158, 235, 278, 285, 306, 307, 351, 353 ADNc, 142, 147, 154, 155, 156, 157, 328, 329 Aequorea victoria, 159 Aflatoxina, 64 Agaricus, 65 Agarosa, 77, 125, 136 Agenda 21, 193 Agrobacterium tumefaciens, 71, 160, 162, 236 Agronegocio, 223, 245 Agroquímicos, 197, 198, 234, 241, 246, 247, 258 Aguas residuales, 31, 200, 202 Alcaligenes eutropus, 180 Alcaloides, 55, 111, 128, 234, 345 Alemania, 102, 167, 171, 182, 187, 228, 248, 372, 375 Alérgenos, 244, 295, 326 Alfalfa, 226, 245, 252, 255, 266 Algas, 32, 57, 58, 59, 62, 63, 67, 72, 177, 181, 196, 216, 264, 281 Algas, como agentes biológicos, 63 Algodón, 70, 198, 214, 215, 216, 219, 220, 226, 252, 254 Algodón transgénico, 219, 229, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 245, 248, 254, 289 Alimentos, 209, 214, 216, 217, 218, 223 Alimentos fermentados, 271 Alimentos transgénicos, 289, 291, 292, 294, 295, 297, 298, 358 Alimentos, conservación de, 289 Alimentos, industria de, 129, 175, 176, 178, 194, 282, 285, 286 Alimentos, producción de, 107, 114, 157, 198, 214, 217, 223, 248, 262, 263 Allergan, 358 Alzheimer, enfermedad de, 313, 338, 362, 382 433 Biotecnología Amigos de la Tierra (Friends of Earth), 292 Amilasas, 80, 179, 253, 272, 284, 286 Aminoácidos, codificación de, 91, 93 Aminoácidos, complementos de, 63 Aminoácidos, en las proteínas, 74, 75, 76, 77, 351 Aminoácidos, en los alimentos, 244, 263, 281, 282, 295 Aminoácidos, producción de, 35, 60, 61, 177 Amoeba, ameba, 41, 62 Anemia falciforme, 165, 336, 337 Animales “élite”, 259, 261 Animales genéticamente modificados o transgénicos, 163, 164, 165, 166, 255, 259, 261, 262, 264, 267 285 Antibióticos, 27, 31, 60, 61, 63, 64, 150, 159, 160, 161, 164, 253, 265, 282, 285, 293, 346 Antibióticos, como medicamentos, 346, 347, 348, 350 Antibióticos, en alimentos y raciones, 253, 282, 285, 293, 294 Antibióticos, en los medios de cultivo, 132 Antibióticos, producción de, 107, 111 Anticarsia gemmatalis, 197 Anticoagulantes, sustancias, 355, 357, 359 Anticuerpos, 82 Anticuerpos, como agentes biológicos, 88 Anticuerpos monoclonales, 28, 35, 85, 86, 87, 132, 268, 325, 354, 356, 366, 368 Anticuerpos policlonales, 84, 85, 86 Antígeno, 32, 82, 83, 84, 86, 87, 265, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 311, 312, 319, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 354, 366, 367, 370, 371, 378, 379 Antioxidantes, sustancias, 282, 290 Antitumorales, sustancias, 63, 70, 128, 176, 222, 344 Antivirales, sustancias, 63, 176, 318, 319, 321, 349, 364 Ántrax, 33, 59, 231, 268, 301, 321, 364 Apoptosis, 131, 134, 367, 372 Arabidopsis thaliana, 37 Arber, Werner, 136 Argentina, 19, 20, 30, 102, 120, 166, 167, 187, 189, 203, 221, 234, 246, 248, 249, 252, 259, 262, 266, 267, 276, 298, 312, 319, 330, 331, 334, 346, 353, 357, 365, 380, 385 ARN o ácido ribonucleico, 89 ARNi o ARN interferente, 376, 377 ARNm o ARN mensajero, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 140, 142, 147, 153, 154, 156, 158, 259, 329, 352, 376, 377 ARN-polimerasa, 94, 95, 96 ARNr o ARN ribosómico, 146, 150 ARNt o ARN de transferencia, 93, 94, 97, 98, 140, 146 Aromas, 128, 274, 281, 282 Arquibacterias, 60, 61, 70 Arrays o matrices, 146, 207, 259, 276, 296, 324, 326, 329, 363 Arroz, 37, 174, 198, 202, 213, 214, 215, 216, 222, 226, 239, 242, 244, 245, 246, 255, 284, 289, 296 Arroz dorado, 28, 244, 245, 284, 291 Artritis, 101, 259, 263, 268, 269, 335, 354, 356, 357, 361, 362, 366, 368, 381 Asepsia, 117, 119, 133 Asilomar, conferencia de, 28, 35, 152 Aspartamo, 282 Aspergillus, 64, 72, 155, 175, 179, 255, 279 Aspirina, 222, 342, 343, 344 ATT (a-1-antitripsina), 267 Augmentin, 349 Australia, 167, 239, 252, 276, 363 Autofecundación, 129, 242 Auxinas, 124, 125 Aventis, 342, 352 Avicultura, 63 Azotobacter, 196 B Bacillus, 60 Bacillus cereus, 68 Bacillus subtilis, 68, 155, 179 Bacillus thuringiensis, 34, 70, 197, 199, 220, 241, 294 BAC o bacterial artificial chromosomes, 153 434 Índice temático Bacterias, 57, 59 Bacterias, como agentes biológicos, 61 Bacterias lácticas, 70, 276, 279, 281 Bacterias malolácticas, 286 Bacterias metanogénicas, 70, 188 Bacteriófagos, 65, 135, 156, 281 Baculovirus, 67, 163, 197 Bagazo, 114, 182, 184, 185, 190 Bagó, 266 Banana, 37, 121, 130, 214, 215, 216, 218, 226, 227, 245, 293, 311 Bancos de datos, 100, 101, 144, 153, 321, 345, 357 Bancos de germoplasma, 227, 228, 284 Banting, F., 351 Barnard, Ch., 378 Basta, 240 Batata, 121, 124, 198, 216, 226, 229, 244, 248, 284, 290 Bayer, 240, 342 BCG, 305, 314, 370 Bélgica, 292 Bibliotecas de genes, 153 Bifenilos policlorados, PCB, 198, 204 Bifidobacterium bifidum, 279 Bill & Melinda Gates Foundation, 312 BIO (Biotechnology Industry Organization), 29 Bioceres, 239 Biocombustibles, 30, 175, 181, 182, 190, 191, 203, 220 Biodiesel, 181, 189, 190, 191 Biodigestión, 186, 187, 199, 200, 201, 202 Biodigestor, véase también fermentador y biorreactor, 34, 186, 187, 188, 201, 202, 205 Biodiversidad, 129, 178, 182, 210, 213, 214, 218, 219, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 258, 276, 344, 345, 346 Biofertilizantes, industria de, 31, 120, 198 Biogás, véase también metano, 31, 175, 181, 185, 186, 187, 188, 189, 199, 200, 201, 202 Biogénesis, 266 Bioinformática, 101, 103, 363 Biolística, 160, 162, 236, 308 Biolixiviación, 60, 208, 209 BioManguinhos, 313, 314 Biomasa, 31, 35, 63, 64, 107, 111, 120, 173, 181, 190, 202, 204, 209, 253 Biomimética, 380 Biopesticidas, 61, 198 Biopulping, 195 Biorreactor, 72, 107, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 127, 128, 133, 177, 182, 186, 199, 251, 267, 284 371, 347 354 Biorremediación, 31, 35, 60, 61, 203, 204, 205, 206 BiosChile, 266 Bioseguridad, 17, 36, 68, 69, 173, 229, 250, 285, 286, 296 Biosensores, 209, 210 Biosidus, 166, 167, 259, 267, 357, 362 Biosteel, 263 Biosystems Applied, 144, 324 Biotecnología, 27 Biotecnología moderna, 28, 120, 149, 152, 173, 179, 297 Biotecnología tradicional, 27, 28, 199 Bioterrorismo, 69, 268, 321, 322, 366 Blockbusters, 363, 366 Bloqueo de la producción de polen, 233 Bolivia, 30, 248 Borrelia burgdorferi, 60 Bos indicus, 102 Bosch, H., 224 Bosques, véase florestas, 194, 215, 218, 219, 222, 223, 227 Botox, 358 Boveri, 50 Boyer, H., 28, 35, 149, 150 Bradirhizobium, 196 Brasil, 20, 23, 24, 25, 30, 35, 37, 67, 102, 103, 120, 171, 180, 181, 182, 183, 184, 187, 189, 190, 191, 194, 196, 205, 208, 220, 221, 223, 225, 227, 228, 234, 240, 243, 246, 248, 249, 252, 253, 261, 262, 265, 266, 267, 276, 285, 299, 312, 313, 314, 315, 319, 331, 333, 334, 345, 352, 357, 359, 364, 365, 380, 385 Brassica napus, 244 435 Biotecnología Bristol-Myers Squibb, 129 Bromelina, 179 BSE, encefalopatía espongiforme bovina o enfermedad de la vaca loca, 81, 252, 253, 254, 291, 320 Büchner, 33 Butanol, 31, 33, 34, 60, 61, 71, 107, 109, 171, 172, 175, 176 C Cabras, 165, 258, 261, 267, 268, 279, 354 Caenorrabditis elegans, 37, 100, 377 Calgene, 290 Callos, cultivo de, 35, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 161 Camarón, 258, 263, 264, 290 Cambio de escala, 118, 119 Camembert, 64, 72, 281 Canadá, 172, 181, 182, 183, 189 190, 219, 232, 242, 246 263, 264, 276, 360 Cáncer, 36, 48, 67, 85, 101, 103, 165, 203, 255, 268, 277, 313, 320, 326, 328, 329, 331, 335, 338, 339, 355, 356, 362, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 378, 379 Candida albicans, 64 Candida utilis, 253 Canola, 174, 180, 189, 216, 219, 220, 234, 239, 240, 242, 244, 248, 252, 254, 255, 289, 290, 296, 297 Caña de azúcar, 103, 124, 130, 174, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 190, 191, 197, 214, 215, 216, 220, 226, 227, 235 Cáñamo, 71, 220, 226 Carbohidratos, 41, 109, 171, 195 Cargill, 244, 291 Cariotipo, 54, 55, 131, 133, 326 Carpa, 263, 264 Carrefour, 292 Cartagena, Protocolos de, 229, 230, 264 “Casete” de expresión, 157, 264, 308 Catalasa, 179 Catálisis enzimática, 78, 177 Caucho, 171, 172, 176, 214, 215, 220, 226, 227, 345 CDC, Center for Disease Control and Prevention (Centro para el Control y Prevención de Enfermedades), 316 Cebada, 32, 179, 213, 216, 226, 277, 278 Celera, 37, 100, 144 Células, 41 Células, como agentes biológicos, 54, 55 Células, como unidad estructural y funcional, 41, 42, 43 Células, técnicas de estudio, 45 Células animales, cultivo de, 55, 67, 107, 131, 132, 134, 165, 267, 379 Células eucariontes, 37, 41, 43, 45, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 71, 72, 73, 89, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 110, 156, 158, 353 Células madre, 37, 46, 47, 132, 164, 166, 374, 375, 380, 381, 382, 383, 384 Células procariontes, 41, 42, 45, 48, 57, 58, 62, 71, 89, 94, 95, 98, 99, 110, 156, 353 Células vegetales, cultivo de, 35, 125, 128, 130, 159, 160, 282 Celulasas, 79, 80, 179, 190, 253, 272, 274 Centro Biotecnológico César Milstein, 319 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, 359 Centros de origen y diversidad, 225, 228 Cerdos, 187, 197, 254, 258, 261, 262, 263, 265, 318, 351, 379 Cerveza, 31, 32, 64, 72, 80, 81, 107, 150, 277, 278, 285 Cetus, 35, 144 CGIAR, Consultative Group on International Agricultural Research, 228 Chagas, enfermedad de, 102, 103, 330, 331, 381 Chain, E., 34, 346, 347 Chakrabarty, 35, 207 Chile, 30, 62, 102, 120, 187, 194, 205, 208, 209, 248, 263, 264, 266, 276, 312, 331, 385 China, 30, 34, 124, 182, 187, 213, 214, 220, 226, 228, 234, 242, 244, 246, 264, 312, 314, 318, 320, 321, 374 Chlamydia trachomatis, 35 436 Índice temático Chlorella, 72 Chromobacterium violaceum, 103 CIAT, Centro Internacional de Agricultura Tropical, 228 CIMMYT, Centro Internacional para el Mejoramiento del Maíz y el Trigo, 228 Cipro, 349, 364 Citomegalovirus, 377 Citoquinas, 74, 132, 369 Clavel, 124, 220, 221 Cline, M., 372 Clonación, 149, 166, 167, 259, 261, 269, 383 Clonación terapéutica, 383 Clostridium, 60, 71, 171 CODELCO, Corporación Nacional del Cobre, 208, 209 Codex Alimentarius, 287 Código genético, 34, 91, 92, 149 Cohen, S., 28, 35, 149, 150, 151 Colecta de ovocitos o de embriones, 257 Cólera, 33, 231, 305 Collins, P., 37 Colombia, 30, 120, 220, 221, 228, 248, 266, 331 Colorantes, 45, 65, 128, 129, 176, 219, 282, 297, 329 Colza, 216, 220, 226, 235, 244 Compost, 186, 188, 199, 200 Compostaje, 199, 200 Confédération Paysanne, 292 Contaminantes del ambiente, 194, 195 198 Control biológico, 55, 64, 197, 198 Control de bioprocesos, 107, 114, 120, 165, 178 Coqueluche o tos convulsa, 301, 306, 314 Corea, 242 Corea de Huntington, 338 Coronavirus, 65, 321 Corredores de aislamiento, 242 Correns, K., 50 Corynebacterium glutamicum, 177 Costa Rica, 30, 60, 227, 248, 345 Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de, 253 Crick, F., 28, 34, 89, 90 Crinipellis perniciosa, 103 Criopreservación, 129, 132, 227, 257 Cromatografía, 74, 75, 76, 311 Cromosomas, 41, 42, 43, 45, 47, 48, 50, 52, 53, 72, 89, 96, 100, 129, 131, 139, 153, 213, 235, 256, 326, 334, 335 Cromosomas, como agentes biológicos, 54 Cromosomas, mitosis y meiosis, 49 Cromosomas humanos, representación de los, 54 Cruz, Oswaldo, 315 Cuba, 30, 77, 120, 130, 187, 198, 203, 264, 266, 331, 357, 359, 385 Curtiembres, 81, 194, 201 D De Vries, H., 50 DeCode, 360 Dengue, 302, 313, 320, 330 Desarrollo sustentable, 181, 93, 226, 238 Dextrano, 61, 176, 178, 282 Diabetes, 47, 101, 324, 335, 350, 351, 354, 355, 361, 381, 383 Difteria, 301, 305, 313, 314 Dihibridismo, 50, 52 Dipel, 197, 241 Dolly, 37, 259, 260, 261 Dow, 241, 244, 247 Down, síndrome de, 48, 336, 337 Drosophila melanogaster, 37, 48, 50, 100, 377 Duchenne, enfermedad de, 377, 338, 375, 382, 385 Dunaliella, 72, 178 Dupont de Nemours, 180, 247 E Eagle, H., 131 Ébola, 69, 320 Ecosistemas, 213, 213, 218, 222, 223 Ecuador, 30 EFB, European Federation of Biotechnology, 29 Efluentes industriales, 62, 63, 80, 107, 186, 189, 198, 199, 201, 202, 253 Ehrlich, 33, 346 437 Biotecnología Electroforesis, 76, 77, 82, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 145, 258, 326, 328, 333 Electroporación, 158, 160, 162, 163, 236, 308 ELISA o enzyme linked immunosorbent assay, 300, 326, 327, 328, 330 Ely Lilly, 35, 152, 342, 351, 352, 358 Embrapa, Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias, 240, 243, 249, 259, 285 Embriogénesis, 125, 220 Embrioides, 127, 128 Enfermedades, en el hombre, 27, 31, 33, 47, 60, 65, 68, 69, 87, 101, 189, 218 Enfermedades, en los animales, 31, 33, 231, 251, 264, 265 Enfermedades cardíacas, 47, 269, 328, 383 Enfermedades emergentes, 319, 320, 366 Enfermedades genéticas, 138, 334, 335, 375, 378 Ensayos biológicos, 294, 345, 349 Ensayos clínicos, 81, 267, 308, 309, 310, 316, 320, 343, 349, 354, 362, 363, 365, 375, 377, 381 Ensayos de campo, 163, 209, 237, 238, 239, 243, 298 Ensayos de diagnóstico, 30, 37, 81, 134, 313, 320, 321, 323 Ensayos inmunológicos, 87, 209, 265 Ensayos predictivos, 338 Enzimas, 73, 78 Enzimas, clasificación, 79 Enzimas, como agentes biológicos, 80, 81 Enzimas, en la industria de alimentos, 271, 272, 273, 274, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 286 Enzimas, en las raciones, 253 Enzimas, importancia económica, 80, 190 Enzimas, producción de, 60, 61, 107, 116, 117, 155, 174, 177 Enzimas de restricción, 135, 136, 151, 154 EOR, enhanced oil recovery, 207 EPA, Environmental Protection Agency, 36, 248, 254, 298 Epítopes, determinantes antigénicos, 83, 84 Equivalencia sustancial, 296, 297 Ereky, K., 27, 34 Ergot del centeno, 65 Ergotamina o ácido lisérgico, 65 Eritromicina, 70, 348 Eritropoyetina, 132, 356, 357, 358, 359, 369, 375 Erosión genética, 222 Escherichia coli, 68, 71, 136, 150, 155, 156, 157, 177, 179, 180, 265, 279, 306, 317, 351, 353 Escherichia coli 0157:H7, 320 España, 32, 190, 207, 208, 248, 250, 318 Espectrometría de masa, 77, 336 Espesantes, 177, 178, 282, 290 Estados Unidos, 19, 28, 35, 36, 37, 60, 70, 102, 152, 167, 172, 181, 182, 183, 187, 189, 190, 198, 203, 205, 219, 220, 228, 232, 239, 243, 246, 248, 252, 261, 263, 264, 267, 272, 276, 286, 290, 292, 296, 298, 308, 321, 334, 347, 361, 362, 363, 364, 365, 371, 372, 373, 377, 381, 383 Estreptomicina, 60, 70, 132, 348 EST, expressed sequence tags, 146, 147, 154 Etanol, 64, 72, 107, 109, 110, 111, 116, 120, 174, 175, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 189, 190, 253, 272, 276, 282 Ética, 268, 269, 373, 384 Etiquetado, 248, 286, 298, 299 Eubacterias, 57, 58, 59, 60, 70, 71 Eucalipto, 103, 126, 174, 195, 220 Exones, 96, 98, 99 Explantos, 121, 122, 123, 125 Expresión génica, 93, 94, 98, 99, 101, 149, 162, 236, 308, 328, 377 Extracción de ADN, 144, 135, 154 F Factor activador de plasminógeno, 36, 55, 167, 354, 132, 166, 167 Factor IX humano, 261, 355 Factor(es) de crecimiento, 131, 176, 354, 357, 359, 380 438 Índice temático FAO, Food and Agriculture Organization, 217, 228, 239, 254, 287, 297 FAPESP, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, 103 Farmacogenética, 324, 361, 362 Farmacogenómica, 359 Far-Manguinhos, 364 FASS, Federation of Animal Science Societies, 255 FDA, Food and Drug Administration, 35, 36, 248, 254, 264, 298, 365, 371, 373, 377 Fenotipo, 51, 52, 53, 101 Fermentación alcohólica, 33, 110, 273, 274, 275, 277, 278 Fermentación, véase también procesos fermentativos, 107 Fermentación láctica, 110, 280 Fermentador, véase biorreactor, 107, 112, 117, 118, 119, 306 Feromona, 198 Fibrosis quística, 36, 267, 336, 337, 338, 357, 375 Ficina, 179, 279 Ficocoloides, 62, 63 Fiebre amarilla, 301, 305, 313, 314 Fiebres hemorrágicas, 320 Fingerprint, 36, 139, 326, 333, 345 FISH, fluorescence in situ hibridization, 326 Fitasa, 197, 244, 253, 254, 255 Fitoterápicos, 344 Flavorizantes, 282, 286 Fleming, 34, 346 Florey, H., 34, 346, 347 Floricultura, 131, 220, 221 Flujo génico, 240, 241, 242 Fluorescencia, 45, 86, 136, 138, 145, 146, 147, 159, 198, 203, 210, 269, 325, 326, 328, 329 Francia, 32, 34, 35, 102, 167, 182, 187, 219, 224, 265, 315, 323, 374 Frankenfood, 292 Frutilla, 36, 124, 224, 226 Frutos de mar o mariscos, 216, 251, 263, 264, 295, 298 Fundação Ataulfo de Paiva, 314 Fusarium graminearum, 281 G Ganado, 34, 35, 70, 105, 196, 202, 214, 231, 251, 253, 265 Ganado de corte, 252, 257 Ganado de leche, 251, 252 Ganado, mejoramiento genético del, 255 Gen BRCA, 165, 329, 335, 338 Gen RAS, 369 Genentech, 35, 152, 358 Genéricos, 341, 343, 363, 364 Genes, 89 Genes, transferencia de, 150, 153, 160, 162, 163, 223, 235, 276, 286 Genes reporteros, 159 Genómica, 68, 100, 101, 102, 153, 154, 156, 157, 173, 235, 276, 321, 349, 359, 378, 385 GenPharm International, 36 Genzyme Transgenics Corporation, 358 Giárdia, 62 Girasol, 174, 189, 214, 216, 220, 226, 252, 255, 290 Glaxo, 312, 313, 342, 360, 370 Glicerol, 31, 63, 64, 72, 109, 174, 176, 180, 189, 190 Glifosato, 240, 241 Gluconacetobacter diazotrophicus, 103, 120, 175 Glucosa-isomerasa, 283, 284, 286 Glucosa-oxidasa, 286 Glufosinato, 240 Golden rice, 284, 291 Gorgonzola, 64, 72, 114, 281 GRAS, generally recognized as safe, 285, 286 Greenpeace, 292 Griffith, F., 34 Gripe aviar, 312, 318 Gripe española, 34, 318, 320, 322 GURT, genetic use restriction technologies, 245 H Haemophilus influenzae, 37, 307, 314 Haplotipos, 332, 333, 360 Heber Biotec, 359, 362 Hemofilia, 36, 337, 338, 355, 375 439 Biotecnología Hepatitis, 269, 330 Hepatitis A, 305, 356 Hepatitis B, 36, 64, 68, 301, 306, 307, 308, 310, 314, 320, 356, 364, 370 Herbaspirillum seropedicae, 103 Herbicidas, véase agroquímicos, 234, 239, 240 Herpes, 308, 310 Hibridización, 137, 233, 235 Hibridización de sondas, 138, 139, 147, 159, 233 Hibridomas, 35, 85, 132, 325, 366 Hidrógeno, 63, 90, 91, 137, 181, 187 Hoffmann-LaRoche, 144, 360 Holanda, 220, 267, 317 Honduras, 248 Hongos, 32, 57, 62, 63, 64, 65, 67, 72, 121, 155 Hongos, características generales, 63 Hongos, como agentes biológicos, 64 Hormonas vegetales, 64, 124, 125, 127, 128 Houwink, E. H., 29 HTS, high throughput screening, 345 Huevos, 251, 254, 255, 256, 262, 267, 268, 273, 295, 299, 311 Humulina, 35 Humulus lupulus, 277 I IASA, Investigación Aplicada S.A., 266 ICI, Imperial Chemical Industries, 116 Ignite, 240 ILSI, International Life Science Institute, 297 INBIO, Instituto Nacional de Biodiversidad, 345 India, 30, 34, 182, 213, 222, 234, 242, 246, 312, 345 Indicadores de polución, 62, 65, 204, 206 Industria de papel y celulosa, 194, 219, 253 Influenza o gripe, 306, 307, 308, 310, 311, 312, 313, 314, 318, 319 Ingeniería de tejidos, 55, 379 Ingeniería genética, véase también ADNrecombinante, 28, 29, 35, 64, 71, 87, 130, 142, 149, 155, 162, 173, 184, 197, 219, 234, 235, 272, 284, 290, 306, 325, 369, 380 Inglaterra, 23, 33, 35, 171, 239, 315, 360 Injertos de piel, 55 Injertos en vegetales, 274 Inmunobiológicos, 313 Inmunoensayos, 209 Inmunoterapia, 365, 366 Instituto Butantan, 313, 314, 319, 359 Instituto Pasteur, 33, 35 Insulina, 28, 35, 71, 155, 165, 167, 267, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 358, 364, 379. INTA, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, 221, 249, 346 Interferones, 132, 354, 357, 359 Interleuquinas, 356, 369 International Hapmap Project, 360 International Human Genome Sequencing Consortium, 100 Introgresión génica, 234, 237 Intrones, 96, 97, 98, 99, 142 Irán, 233, 240 Israel, 23, 60, 172, 178 Italia, 261, 274 J Japón, 167, 187, 239, 321, 362, 363 Jarabe con alto contenido de fructosa, 35, 282, 283, 284 Jeffrey, A., 35, 139, 333 Jenner, E., 33, 301, 315 Johannesburgo, Conferencia de, 193 Johnson & Johnson, 152, 342, 349, 368 K Kanamicina, 150, 151 Kitasato, S., 366 Kits para diagnóstico, 265, 324, 330, 331 Kluyveromyces, 179, 279 Knock out, animales, 165, 267, 377 Knudson, 121 Kohler, 35, 95 Koji, 114 Kyoto, acuerdos de, 193, 203 440 Índice temático L Laboratorio Pablo Cassará, 319, 359 Laboratorios Santa Elena, 266 Lactamasas, 347, 348 Lactasa o -galactosidasa, 78, 79, 159, 178, 228, 283, 286 Lácteos, productos, 31, 60, 61, 81, 271, 280, 286, 298 Lactobacillus, 70, 110, 176, 279 Lactoferrina, 166, 267 Laminaria, 62 Lana, 125, 251, 255, 262, 263 Laverlam, 266 Lecanora esculenta, 65 Legionarios, enfermedad de, 320 Leifsonia xyli, 103 Leishmania, 62, 102 Leptospira interrogans, 103 Leucemia, 48, 269, 374, 381 Levadura, 33, 37, 58, 63, 64, 71, 72, 107, 109, 110, 125, 132, 153, 156, 165, 179, 182, 183, 185, 190, 210, 253, 272, 274, 276, 277, 279, 282, 285, 307, 351, 354, 355 Leyes de Mendel, 33, 50, 53, 225, 231 LibertyLink, 240 Ligasas, 79, 136, 151 Lignina, 174, 190, 194, 195, 206, 219, 255 Linfocitos, 82, 84, 85, 132, 133, 302, 303, 305, 325, 332, 373, 374 Lino, 71, 220 Lipasas, 79, 80, 179, 272, 286 Lípidos, 41, 44, 73, 77, 109, 204, 342 Liposomas, 163, 370, 373 Lisina, 61, 132, 176, 177, 244 Listeria, 265 Lithospermum erythrorhizon, 129 Lupino, 226, 255 Lupus, 366 Lyme, enfermedad de, 60, 306, 320, 356 M Maíz, 32, 34, 70, 114, 171, 172, 173, 174, 180, 181, 182, 183, 189, 190, 196, 198, 213, 216, 219, 226, 232 Maíz híbrido, 34, 231, 232, 247 Maíz transgénico, 67, 163, 234, 242, 243, 252, 254, 255, 282, 289, 292, 293, 297 Malaria, 37, 306, 308, 310, 313, 330 Malezas, 238, 239, 240, 241, 244 Mandioca, 174, 184, 196, 215, 216, 226, 227, 284, 290, 294 Manejo integrado de plagas, 197, 198 Manipulación genética, 28, 81, 107, 129, 131, 149 Marcadores ABO y Rh, 53, 331 Marcadores de selección, 157, 158, 160, 163, 164, 219, 229, 235, 285, 289, 294 Marcadores HLA, 332, 333 Marcadores moleculares, 162, 219, 235, 236, 244, 258, 276, 285, 381 Marek, enfermedad de, 265 Mark & Spencer, 292 Mascotas, 37, 251, 265, 269 Medicamentos, 341 Medicamentos “me too drugs”, 349 Medicamentos personalizados, 359 Medios de cultivo, 112, 114, 116, 119, 121, 122, 124, 125, 127, 129 Mejoramiento genético, 130, 184, 214, 222, 247, 255, 256, 284, 285 Memoria inmunológica, 302, 303, 304 Mendel, G., 33, 48 Mengele, J., 334 Meningitis, 301, 307, 314 MEOR, microrganism enhanced oil recovery, 207 Mercado de aminoácidos, 177 Mercado de enzimas, 178 Mercado de medicamentos, 341 Mercado de semillas, 223, 246 Merck, 312, 342, 345, 347, 349, 368, 370 Meristemas, cultivo de, 46, 124, 126, 127, 129, 130 Metabolismo, 41, 43, 107, 108, 110, 111, 112, 205, 210, 335, 336, 349, 350 Metabolitos, 64, 72, 111, 113, 127, 128, 130, 174, 175 Metabolómica, 101 Metales, 32, 45, 78, 198, 199, 201, 204, 207, 209 441 Biotecnología Metano, véase también biogás, 34, 61, 63, 70, 185, 186, 187, 189, 198, 202, 203, 205 Metanol, 189, 253 Methylophilus methylotropus, 253 Metionina, 91, 92, 132, 177, 244, 255, 290 México, 30, 32, 34, 102, 120, 187, 203, 208, 227, 228, 242, 243, 248, 249, 266, 298, 315, 319, 346, 357, 380 Micorrizas, 65, 197 Micotoxinas, 241, 255 Microinyección, 164, 165 Microorganismos, características y diversidad, 57 Microorganismos, como agentes biológicos, 69 Microorganismos, seguridad, 68, 305 Microorganismos, técnicas de cultivo, 67 Microorganismos genéticamente modificados, construcción de, 69, 112, 205, 287, 289, 351 Micropropagación, 121, 123, 124, 127, 219, 220 Milstein, C., 35, 319 Mitsui Petrochemical Ind., 129 Mohos, 58, 64 Monitoreo, 63, 65, 118, 186, 193, 210, 239, 274, 310, 324, 328 Monohibridismo, 50, 51 Monsanto, 37, 240, 241, 244, 247, 291 Moratoria, 28, 152, 243, 248 Morgan, T. H., 33, 50, 53 Mullis, K., 35, 144 Muromonab CD3, 366 Mycobacterium, 60, 68, 330 Mycoplasma, 103, 148 N Natamicina, o pimaricina, 282 Neurospora crassa, 155 Night pearls, peces, 269 NIH, National Institutes of Health, 35, 152, 346 Nisina, 282 Nistatina, 70 Nitto Denko Corp., 129 Normas de seguridad, en el trabajo, 112, 152 Novartis, 291, 294, 312, 342, 346, 349, 360, 368 Novo-Nordisk, 352, 358 Novozyme, 180 Nuremberg, código de, 309 O OCDE, Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico, 29, 36, 297 Oligonucleótidos, síntesis de, 139, 141, 144, 147, 156, 328 OMC, Organización Mundial de Comercio, 364 OMS, Organización Mundial de la Salud; también como WHO, World Health Organization, 69, 254, 207, 283, 293, 297, 301, 315, 362 Operón, 94, 95, 96 Organismos genéticamente modificados, 69, 149, 173, 205, 206, 210, 223, 229, 237, 249, 254, 266, 287, 299, 351 Organismos transgénicos, 31, 36, 37, 149, 162, 164, 165, 166, 167, 229, 261, 262 Orphan Drug Act, 363 Orquídeas, 126, 220, 221 OTA, Office of Technology Assessment, 29 Ovejas, 37, 59, 84, 214, 231, 253, 255, 257, 258, 260, 261, 263, 267, 279, 354 P Paecilomyces, 202 Pan, 31, 32, 64, 72, 80, 81, 216, 272, 277, 285 Panax ginseng, 129 Panificación, 64, 114, 271, 272, 273, 286, 290 Papa, 32, 38, 65, 72, 121, 124, 130, 174, 196, 198, 214, 215, 216, 224, 226, 227, 229, 234, 235, 242, 243, 245, 254, 284, 290, 292, 294, 296, 297 Papaína, 179 442 Índice temático Papaya, 179, 226, 239, 243, 289 Paperas, 301, 305, 311, 313, 314 Papilomavirus, 370 Paracoccidioides brasiliensis, 103 Paraguay, 30, 102, 246, 248, 266 Parkinson, enfermedad de, 362, 382, 383 PASNI, Programa de Autosuficiencia Nacional de Inmunobiológicos, 313 Pasta Kraft, 195 Pasteur, L., 33, 46, 277 Patentes, 35, 36, 180, 245, 247, 291, 341, 344, 349, 352, 359, 363, 364, 385 PCR, polymerase chain reaction, 35, 70, 139, 142, 143, 144, 156, 157, 300 Peces, 196, 200, 251, 261, 263, 264, 298, 326, 327, 328, 330, 332, 333 Pectinasas, 80, 274, 282, 360 Penicilina, 34, 64, 72, 132, 346, 347 Penicillium, 64, 72, 281, 346, 347 Pepsina, 179, 279 Percepción pública, 173, 247, 292, 299, 295 Perú, 30, 120, 208, 228, 242 Peste, 305, 321 Pesticidas, 60, 70, 176, 197, 198, 210, 232 Petróleo, 31, 35, 70, 171, 172, 173, 178, 181, 182, 183, 194, 198, 204, 206, 207, 218, 234, 247, 281 Petunia, 35, 221, 377 Pfizer, 36, 342, 347, 349 PHA y PHB, véase bioplásticos, 180 Phanerochaete chrysosporium, 195 Pharming BV, 267 Phyton Inc., 129 Phytophtora infestans, 65 Picchia pastoris, 155, 306 Pickles, 60, 61, 271 Pigmentos, 63, 111, 221, 275 Pino, 174, 194 Pioneer, 232, 241 Pisum sativum, 49 PLA, véase bioplásticos, 176, 180 Plantas alimenticias, 216, 222 Plantas comerciales, 218 Plantas “élite”, 237, 276 Plantas genéticamente modificadas, o transgénicas, 159, 161, 204, 223, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 245, 254, 255, 298, 299 Plantas industriales, 220 Plantas medicinales, 221, 222, 344 Plantas transgénicas, construcción de, 234 Plásmido BR322, 159 Plásmido Ti, 160, 161, 162, 236 Plásmidos, 41, 57, 89, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 308, 348, 353 Plásmidos pSC101 y pSC102, 150, 151 Plasmodium, 62, 330 Plásticos biodegradables, véase también bioplásticos, 30, 60, 128, 180, 213, 234 Pleurotus, 65 Poliacrilamida, 77, 82, 136 Poliomielitis, 148, 301, 305, 310, 311, 314, 316, 317 Poliovirus, 65, 316, 317, 321 Pollos, 254, 256, 258, 261, 265, 292 Poroto, 64, 196, 214, 215, 216, 226, 228, 243, 246, 284, 285 Porphyra, 62 Portugal, 248 PPL Therapeutics Ltd., 261, 267, 379 Práctica forense, 102, 144, 334 Prácticas agrícolas, 60, 222, 225, 231 Principio precautorio, 238, 298 Pro-álcool, Programa Nacional del Alcohol, 35, 183 Proceso Weizmann, 171 Proteasas, 34, 36, 79, 80, 179, 253, 286 Proteínas, 73 Proteínas, estructura, 74 Proteínas, síntesis biológica de, 41, 94, 95, 96, 97 Proteínas, técnicas de laboratorio, 67 Proteínas recombinantes, 19, 134, 162, 165, 267, 311, 353, 369 Proteínas recombinantes de interés médico, 355 Proteínas terapéuticas, 102, 165, 167, 353, 354, 358, 364 Proteómica, 77, 101 Proyecto Genoma Humano (HGP), 100, 101 443 Biotecnología Proyecto Internacional HapMap, 360 Pseudomonas, 70, 155, 177, 207 Psilobicina, 65 Purpurina, 129 Q Queso, 31, 32, 36, 64, 70, 72, 80, 114, 263, 278, 279, 280, 281, 282, 286 Química fina, 128, 174, 191 Quimosina, 155, 279, 286 Quorn, 281 R Rabia, 33, 269, 305, 307, 311, 313, 314 Raciones, 31, 81, 177, 179, 189, 196, 197, 202, 219, 224, 248, 252, 253, 254, 263, 281, 298, 299 Ralstonia eutropha, 180 Ranks Hovis McDougall, 281 Rastreo, 154, 300, 323, 328, 336 Recombivax-HB, 36 Recuperación de cobre, 207 Recuperación de petróleo, 31, 178, 207 Recuperación de recursos naturales, 207 Recuperación de un producto de fermentación, 119, 177, 178 Regulación de la expresión génica, 37, 98, 149, 377 Regulación génica, en eucariontes, 96 Regulación génica, en procariontes, 98, 353 Reino Unido, 116, 167, 253, 254, 263, 264, 272, 290, 315 Remicade, 358, 368 Renina, 79, 179, 279, 286 República Checa, 44, 248 Residuos gaseosos, 202 Resistencia a insectos, 223, 239, 245, 256, 289 Resistencia a virus, 239, 243 Respiración, 44, 109, 110 Retrovirus, 65, 95, 163, 379 Revolución Verde, 34, 217, 232, 234 RFLP, restriction fragment length polymorphisms, 137, 138 Rhizobium, 120, 196 Rhizopus, 64, 176 Rhöm, 33 Rhône-Poulenc, 352 Ribosomas, 41, 42, 43, 44, 71, 93, 94, 97, 98, 157, 348, 377 Ribozimas, 376 Río de Janeiro, Conferencia de, 193 Rituxan, 358, 368 Rodeo, 240 Roquefort, 64, 72, 114, 281 Roundup Ready, 240, 244, 291 RSU, residuos sólidos urbanos, 199 Rubéola, 301, 305, 311, 313, 314 Rubia akane, 129 Rusia, 203, 227, 316, 384 S Sabin, A., 305, 317 Saccharomyces cerevisiae, 37, 63, 72, 110, 155, 156, 179, 253, 274, 277, 278, 306 Sainsbury, 290 Salix alba, 342 Salk, J., 305, 310, 317 Salmón, 263, 264, 265, 266, 289, 308 Salmonella, 60, 68, 265 Sanofi, 312, 313, 342 SAR, severe acute respiratory sindrome, 320 Sarampión, 68, 301, 305, 311, 313, 314 Sarin, gas, 81, 268 Sauerkraut o repollo fermentado, 70 Schering, 152, 358 Schistosoma mansoni, 68, 102 SCID, severe combined imunodeficiency, 373, 374, 375 SCP, single cell protein, véase también proteína unicelular, 116, 253, 281 Secuenciación, 37, 101, 102, 103, 120, 144, 146, 207, 219, 335, 360 Secuencias génicas promotoras, 94, 96, 97, 159, 162, 163, 164, 210, 258, 296, 300, 376 Secuencias génicas reguladoras, 96, 97 Seda, 33, 140, 231, 263 Seguridad alimentaria, 38, 285, 287, 292, 293, 296, 297, 298 Shiitake, 65 Shikonina, 129 444 Índice temático Silaje, 31, 61, 70, 252 Sitio de restricción, 137, 138, 140, 141, 150 SKY, spectral karyotyping, 326 SNP, single nucleotide polymorphisms, 101, 360, 361 Soja, 31, 32, 64, 67, 113, 174, 177, 180, 182, 189, 196, 197, 215, 216, 218, 219, 220, 223, 226, 234, 239, 271, 289, 290 Soja transgénica, 215, 216, 218, 219, 226, 234, 239, 240, 242, 244, 245, 248, 252, 254, 271, 289, 290, 291, 295, 297 Somatropina u hormona de crecimiento, 28, 37, 35, 71, 153, 155, 165, 166, 262, 263, 264, 267, 355, 357, 358, 359, 364 Sondas, 115, 118 Sondas de ADN, 138, 139, 140, 141, 146, 147, 154, 159, 326, 328 Southern blot, 158 Spirulina, 72 Staphylococcus aureus, 268, 349 Starters, 285 Streptococcus, 70, 110, 279 Streptomyces, 60, 70, 155, 179 STS, sequence tagged site, 154 Sudáfrica, 34, 234, 246, 276, 378 Sulfobolus, 209 Supermouse, 164, 165 Sutton, 50 Syngenta, 241, 247, 248 T Tambo farmacéutico argentino, 167, 267, 357 Taxol, 129, 344 Taxos cuspidata, 129 Tay-Sachs, enfermedad de, 336, 337 TCE, tricloroeteno, 205 Tecnología antisense, 290, 377 Tecpar (Instituto de Tecnología del Paraná), 314 Teoría cromosómica de la herencia, 48, 231 Termitas, 70, 202 Tétano, 301, 305, 313, 314 Tetraciclina, 70, 150, 151, 348, 350 The Wellcome Trust, 335, 360 Thermus aquaticus, 70, 142 Thiobacillus, 207 Thuricida, 241 Tilapia, 263, 264 Tipificación de agentes patogénicos, 265 Tipificación de tejidos, 331 Tolerancia a herbicida, 223, 234, 239, 242, 243, 244, 245, 256, 289 Tomate, 80, 124, 214, 215, 216, 226, 235, 243, 289, 290 Tomate FlavSavr, 37, 289, 290, 377 Torula, 253 Tour de France, 375 Toxina Bt, 197, 241, 242, 246, 255 Toxinas, 60, 61, 62, 63, 69, 111, 112, 196, 197 Toxinas, en alimentos, 290 Toxoplasma, 62, 68 TPS, technology protection systems, 245 Transcriptasa reversa, 93, 141, 142, 153, 329 Transcriptómica, 101 Transfección, 158, 163, 165, 166 Transferencia nuclear, 47, 259, 382, 383, 384 Transgenes, 71 Transgénesis y biodiversidad, 223 Transgénesis y mejoramiento animal, 263 Transgénesis y mejoramiento vegetal, 247 Transgénesis y nuevos alimentos, 295 Transposones, 156 Trasplantes, 70, 267, 332, 366, 378, 379, 380, 381 Trastuzumab o Herceptin, 358, 367, 368 Trazabilidad, 248, 299 Treponema pallidum, 60 Trichomonas, 62 Trigo, 32, 34, 65, 72, 174, 213, 214, 215, 216, 224, 226, 228, 232, 235, 242, 246, 284, 290, 295 Trypanosoma, 62, 103 Tuberculosis, 60, 68, 259, 301, 305, 308, 313, 314, 320, 330, 348 445 Biotecnología U Unión Europea, 38, 183, 189, 220, 221, 248, 254, 292, 294, 298, 363, 364, 365 Universidad de California, 36, 149, 152 Universidad de Stanford, 36, 149, 152 Uruguay, 24, 25, 30, 102, 120, 187, 203, 246, 248, 266, 331 USDA, United States Department of Agriculture, 248, 298, 346 V Vacas, 165, 166, 214, 253, 258, 261, 262, 263, 267, 268, 315, 351, 354, 357 Vacunas, 31, 33, 55, 60, 61, 62, 64, 102, 112, 132, 155, 176, 245, 265, 266, 269, 346, 354, 356, 365, 370, 371, 385 Vacunas, diferentes tipos, 304 Vacunas, producción de, 134, 265, 301, 302, 308, 310, 311, 312, 313, 314, 359 Vacunas conjugadas, 306, 307 Vacunas de subunidades, 306, 320 Vacunas recombinantes, 102, 306 Vacunas terapéuticas, 315, 370, 371 Vallée, 266 Vavilov, N. I, 224, 225, 227 Vectobac, 241 Vector, 37, 65, 153, 154, 156, 157, 158, 160, 162, 163, 164, 236, 307, 308, 320, 370, 373, 374 VECTRO, Instituto para preparaciones virales, 316 VEGF, vascular endothelial growth factor, 359, 360 Venezuela, 30, 331 Venter, C., 37, 38, 148 Vides, 121, 274, 276 Vigor híbrido o heterosis, 231, 247 VIH, 35, 36, 65, 66, 68, 141, 323, 362, 376 VIH/sida, 320, 330, 364, 375, 377 Vinagre, 32, 60, 61, 114, 115, 274 Vinaza, 120, 182, 183, 185, 186, 201, 202 Vinificación, 273, 274, 275, 276, 286 Vino, 32, 50, 72, 114, 115, 183, 185, 273, 274, 275, 276 Virchow, R., 33, 46 Viruela, 33, 268, 301, 313, 314, 315, 316, 321 Virus, características generales, 65 Virus, plantas libres de, 124 Virus entomopatogénicos, 193 Vitamina A o ß-caroteno, 61, 63, 72, 176, 178, 217, 244, 282, 283, 284, 289, 290, 291 Vitamina B12 o cianocobalamina, 176, 178 Vitamina B2 o riboflavina, 125, 173, 176, 178 Vitaminas, 31, 60, 61, 63, 64, 72, 78, 124, 125, 131, 132, Vitaminas, producción de, 176, 178 Vitis, 274 Vitravene, 377 VNTR, variable number of tandem repeats, 139, 141, 333 Von Behring, E., 366 Von Tschermak, E., 50 W Watson, J., 28, 34, 89, 90 Weizmann, C., 33, 171, 172 Western Blot, 138, 300, 325, 330 World Trade Center, 321, 334 Wyeth, 312, 358, 366 X Xantano, 61, 176, 177, 207, 282 Xanthomonas campestris, 103, 177 Xenopus, 150, 151 Xenotransplantes, 267, 379 Xilanasa, 195 Xylella fastidiosa, 37, 103 Y YAC, yeast artificial chromosomes, 153 Yogures, 31, 70, 278, 285 Z Zar Nicolás II, 334 Zeneca, 290, 342, 349, 368 446