ENZIMAS EN LA INDÚSTRIA ALIMENTARIAAutores: MIGUEL ÁNGEL CERÓN GONZÁLEZ. CLAUDIA SALAMANCA. JOHAN CHRISTIAN MARTAN UNIVERSIDAD DEL VALLE CALI – COLOMBIA 2009 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Para consultas o comentarios, ponerse en contacto con: Miguel Ángel Cerón González e-mail:
[email protected] Las opiniones expresadas no son necesariamente opiniones de ReCiTeIA, de sus órganos o de sus funcionarios. Edición: 2009 © ReCiTeIA. Cali – Valle – Colombia e-mail:
[email protected] url: http://revistareciteia.es.tl/ ReCiTeIA - v.9 n.1 2 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Enzimas en la industria alimentaria Miguel Ángel Cerón González, Claudia Salamanca, Johan Christian Martan. Universidad del Valle RESUMEN Este trabajo presenta las enzimas como un amplio tema, de gran importancia en áreas como la ingeniería de los alimentos, la química, la biotecnología y la bioquímica. El presente trabajo abarca de manera global el conocimiento sobre enzimas, y se tocan temas entre los cuales se nombran: propiedades generales, nomenclatura, actividad enzimática, cinética de las reacciones enzimáticas, inmovilización, y utilización e importancia de las enzimas en la industria alimentaria. Se presenta información relevante en el tema, de manera que le brinde al lector información clara e interesante en el campo de las enzimas con el objetivo que le permita conocer ampliamente del tema o reforzar sus conocimientos en el mismo. Palabras claves: Enzimas / Industria alimentaria TABLA DE CONTENIDO INDICE GENERAL. Pag. RESUMEN. ..................................................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN. ............................................................................................................ 5 1. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS. .............................................. 6 2. NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS. ................................................................. 8 2.1 Enzimas Microbianas. ............................................................................... 10 3. PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS. ........................................... 14 4. EXTRACCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS. ............................................. 16 4.1 Extracción Enzimática. .................................................................................... 17 4.2 Purificación Enzimática. .................................................................................. 20 5. ESPECIFICIDAD ENZIMATICA. ............................................................................ 23 6. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. ........................... 25 6.1 Efecto del pH. ................................................................................................... 25 6.2 Efecto de la Temperatura. .................................................................................. 27 6.3 Efecto de la Concentración de Sustrato. ............................................................ 30 6.4 Efecto de la Actividad de Agua. ........................................................................ 31 6.5 Efecto de otros Agentes en la Actividad Enzimática. ........................................ 32 7. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. ............................................. 34 ReCiTeIA - v.9 n.1 3 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 8. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS. .......................................................................... 38 8.1 Efectos De La Inmovilización Sobre La Actividad Enzimática. ........................ 40 9. IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS. ............................ 40 10. UTILIZACIÓN DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA. ......... 42 10.1 Enzimas De Importancia En Alimentos. ................................................................ 44 11. ASPECTOS PARA POSIBLES INVESTIGACIONES. ............................................ 46 12. CONCLUSIONES. ....................................................................................................... 47 13. BIBLIOGRAFIA. .......................................................................................................... 48 INDICE DE TABLAS. 1. Tabla 1. Compuestos utilizados en tampones de extracción. ..................................... 20 2. Tabla 2. Características de algunos cofactores enzimáticos. ....................................... 33 3. Tabla 3. Ejemplos de los valores de las constantes catalíticas para varias enzimas algunas con más de un sustrato. ............................................................................................. ... 38 4. Tabla 4 Algunas de las aplicaciones de enzima en la industria de los alimentos. .... ... 44 ÍNDICE DE IMÁGENES. 1. Figura 1. Secreción co-tradicional de las proteínas bacterianas. ............................. .... 13 2. Figura 2. Secreción y procesamiento de enzimas en eucariotas. ............................. .... 14 3. Figura 3. Efecto del pH en la actividad enzimática. ................................................. ... 26 4. Figura 4. Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas. ......... ..... 28 5. Figura 5. Inactivación térmica de la polifenol oxidasa de la remolacha sometida a incubación a diferentes temperaturas. ....................................................................... ... 29 6. Figura 6. Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción de las enzimas. ...................................................................................................................... .. 30 7. Figura 7. Velocidad de reacción enzimática con respecto a la concentración de enzima.36 8. Figura. 8 .Métodos comunes de inmovilización de enzimas. ..................................... ... 39 ReCiTeIA - v.9 n.1 4 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Enzimas en la industria alimentaria INTRODUCCIÓN. Garcia, Quintero, López-Munguia (2004) explica que: Hoy en día la tecnología enzimática ocupa un lugar importante dentro de la biotecnología y específicamente dentro del sector alimentario. Alrededor de un 65% de las enzimas que se producen industrialmente están de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaria, aunque es conveniente señalar que solo las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan 25% del total de esta distribución, el 10% restante corresponde a aplicaciones en las áreas farmacéutica y analítica. Desde un enfoque histórico podemos retroceder hasta 1883, cuando Payen y Persoz observaron que un precipitado al alcohol de extracto de malta podía, una vez redisuelto, transformar al almidón en azúcar. Más tarde, en 1878, Kuhne adopto el término "enzima", del griego "en la levadura". Luís Pasteur distinguió dos tipos de actividades, "fermentos organizados" y "no organizados", que se referían a las enzimas asociadas a las células y a las extracelulares, respectivamente. Dentro de este periodo destacan los trabajos de Fischer sobre la complementariedad entre enzima y sustrato (1890) y de Víctor Henri y Leonor Michaelis (1900-1920) sobre cinética enzimática. Entre 1930 y 1940, Kunitz y Northrop confirmaron la naturaleza proteica de las enzimas, cristalizando las proteasas del sistema digestivo (afortunadamente sin requerimiento de cofactores o metales, lo que hubiese retardado aun mas el desarrollo). Badui, (2006) expone: Una enzima es una proteína que actúa como catalizador biológico, llevando a cabo reacciones bioquímicas a muy altas velocidades, no se consume durante la reacción y en general presenta un elevado grado de especificidad. ReCiTeIA - v.9 n.1 5 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA En el sector alimentario, el interés actual de la aplicación de enzimas en procesos de la tecnología enzimática se enfoca a la conservación de alimentos o de sus componentes (por ejemplo, vitaminas), como también en algunos cambios químicos que sufren los alimentos, cambios que pueden resultar beneficioso (maduración de frutas) o perjudiciales (oxidación de ácidos grasos y oscurecimiento enzimático), Así mismo el uso más eficiente de materias primas y el mejoramiento de la calidad sensorial de los alimentos (textura y sabor) se han utilizado enzimas para producir alimentos bajos en calorías y eliminar compuestos antinutricionales de ciertas materias primas. Debido a su naturaleza química, a las enzimas les afectan los mismos factores que alteran a las proteínas; por esta razón, para actuar en forma optima, cada una requiere de ciertas condiciones de temperatura, de pH, de fuerza iónica, etc.; condiciones en las que la estructura tridimensional es estable y la carga optima para interactuar con el sustrato. En la actualidad existen más de 2000 enzimas perfectamente caracterizadas y registradas, la mayor parte son enzimas responsables de su funcionamiento integral, todas ellas separables analíticamente y conocidas desde un punto de vista químico, fisicoquímico y cinético. (García et al 2004). 1. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS. Conn, (1996) explica: A principios del presente siglo, las reacciones catalizadas por enzimas eran ya tema de análisis matemáticos, pero no fue sino hasta la década de 1920 que la naturaleza proteínica de las enzimas se hizo evidente. Este resultado se debió a la cristalización de la enzima ureasa (que hidroliza la urea) por Sumner y varias enzimas hidrolizantes de proteínas por Northrop. Se demostró que las preparaciones de enzimas tenían una relación constante de actividad enzimática respecto a la masa de proteína a través de ReCiTeIA - v.9 n.1 6 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA cristalizaciones múltiples, dando pruebas firmes de que las moléculas de proteína, en vez de constituir un contaminante, son los catalizadores reales. Como el ejemplo de la ureasa, las enzimas y grupos de enzimas se nombran en general agregando el sufijo -asa al nombre o nombre abreviado del compuesto sobre el cual actúa la enzima. Las enzimas que causan la ruptura de la cadena polipeptidica al reaccionar con agua se conocen, como grupo, como proteinasas. Las peptidasas muestran una especificidad similar, pero facilitan la hidrolisis de los péptidos más eficazmente que la hidrolisis de las moléculas de proteína de mayor tamaño y que presentan un plegamiento compacto. Se considera que todas estas enzimas son miembros de un grupo más grande: el de las "hidrolasas", enzimas que rompen los enlaces por la incorporación de una molécula de agua. Aunque el sufijo -asa se utiliza ahora ampliamente, muchas de las enzimas más estudiadas y que se descubrieron primeramente no se nombran de esta forma. Equilibrio (a favor de los productos). 1. Dirección en la cual la reacción catalizada por la enzima puede analizarse fácilmente in vitro (del sustrato al producto). 2. bien, la dirección probable que sigue la reacción predominante in vivo (formación neta de los compuestos que son designados como productos). Los dos últimos puntos no solo dependen de la constante de equilibrio, sino también de las concentraciones relativas de los sustratos y los productos. Las enzimas aumentan la rapidez o velocidad de las reacciones químicas. En algunos casos, la rapidez de una reacción particular catalizada por enzimas es tan baja en ausencia de la enzima que no puede detectarse ante la gama de reacciones con las cuales compite. Como todos los catalizadores, una enzima funcionara a una concentración molar mucho menor que la del(los) reactivo(s) sobre el(los) cual(es) funciona. En estas condiciones, la enzima no altera el equilibrio de la reacción, y un mol de enzima facilita la conversión de muchos moles del reactivo en producto. ReCiTeIA - v.9 n.1 7 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Comparadas con la mayoría de los catalizadores, las enzimas son especialmente eficaces. Son eficientes, catalizan reacciones a altas velocidades a temperaturas moderadas y en condiciones benignas, haciendo que los extremos de pH, presión, etc. sean innecesarios. Las enzimas son también catalizadores particularmente específicos y suelen actuar sobre sólo una forma de un compuesto ópticamente active aun cuando este se encuentre en una mezcla de formas quirales. Muchas enzimas presentan también la capacidad de acoplar dos reacciones químicas que tienen reactivos y productos muy distintos. Esto permite que una reacción que no es energéticamente favorecida se acople a otra reacción que si lo es, de modo que se alcance un grado de conversión razonable en el caso de la primera reacción. Por ultimo, muchas enzimas son controladas en cuanto a su eficiencia catalítica por las concentraciones del sustrato o producto. También pueden ser controladas por compuestos metabólicamente importantes que no se asemejen ni a los sustratos ni a los productos de la enzima. Esta propiedad, que es de gran importancia para la regulación del metabolismo, se denomina "alosterismo”. 2. NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS. Badui, (2006) argumenta que: En general se ha nombrado a las enzimas de manera empírica y poco sistemática; ya que en algunos casos se ha tornado como raíz del nombre el del sustrato que reconoce la enzima y se le agrega el sufijo - asa. Por ejemplo, a una enzima que degrada proteínas se le llama proteinasa o proteasa. Algunas enzimas tienen nombres asignados antes de adoptar esta conversión, por ejemplo, tripsina, papaína, invertasa, diastasa. Posteriormente, hubo la necesidad de asignarles un nombre sistemático. Miembros de la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) y del IUB (International Union of Biochemistry) y posteriormente de la IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) idearon un sistema de identificación en el que a cada enzima se le asigna una serie de cuatro dígitos, al que se ha llamado numero de la EC (Enzyme Comission). El primer digito esta correlacionado con la reacción química que cataliza la enzima, de acuerdo al siguiente código: ReCiTeIA - v.9 n.1 8 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 1. Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxidorreducción. En este grupo se incluyen las deshidrogenasas, oxidasas, oxigenasas y peroxidasas. 2. Transferasas: Promueven la transferencia de distintos grupos químicos entre una molécula donadora y una aceptora. Dentro de las más estudiadas se incluye a las glicosil transferasas amino transferasas y fosfo transferasas. 3. Hidrolasas: Llevan a cabo la ruptura de enlaces covalentes con la introducción de una molécula de agua. Las enzimas hidrolíticas (que incluyen a las amilasas, esterasas, glicosidasas, lipasas y proteasas, entre otras) son las que se utilizan, con mayor frecuencia, como aditivos en la industria alimentaria. 4. Liasas: Rompen enlaces para la eliminación de un determinado grupo químico del sustrato y forman dobles ligaduras sin la introducción de moléculas agua. Entre ellas se encuentran: aldolasas, descarboxilasas, deshidratasas y pectina liasa. 5. Isomerasas: Catalizan el rearreglo espacial de grupos del sustrato sin modificar su composición química; y son: epimerasas y racemasas. 6. Ligasas: Promueven la unión covalente de dos moléculas acopladas con la ruptura de un enlace pirofosfato proveniente de ATP, UTP o CTP, como fuente de energía. El termino ligasa es sinónimo de sintetasa. El segundo digito de la nomenclatura corresponde a la subclase de enzima, por ejemplo, en el caso de las hidrolasas se refiere al tipo de enlace que hidroliza: el 3.1 de enlaces ester, el 3.2 de enlaces glucosídicos, el 3.4 de enlaces peptídicos, etc.. El tercer digito es una subdivisión y ofrece más información con respecto al sustrato que utiliza la enzima. Por lo tanto, si se tiene una hidrolasa de uniones ester (3.1), el tercer número indicara si se trata de un enlace ester carboxílico (3.1.1), tioéster (3.1.2), monofosfato (3.1.3), etc... Finalmente, el cuarto digito indica el número serial de la enzima en el grupo correspondiente. Los seis grupos de enzimas indicados corresponden a reacciones importantes en el metabolismo celular; no todas de igual importancia para la industria, el procesamiento o el deterioro de alimentos. Es claro que el grupo de enzimas mas importante, en términos de ReCiTeIA - v.9 n.1 9 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA su aplicación en la tecnología de alimentos, es el de las hidrolasas. En términos económicos y de volumen de enzimas producidas y aplicadas en la industria de la panificación y en el procesamiento de almidón sobresalen las amilasas; las proteasas sobresalen en varios procesos como son: la elaboración de cerveza, de pan, el ablandamiento de carne y la producción de hidrolizados proteínicos. Actualmente existe también una clasificación de enzimas por familias y basada en su estructura. 2.1 ENZIMAS MICROBIANAS. Gacesa y Hubble, (1990) explican: Que los microorganismos producen una enorme gama de enzimas potencialmente útiles, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular. Por otra parte, son capaces de desarrollarse fácil y rápidamente en su medio de cultivo y la tecnología al respecto, a gran escala, se encuentra hoy bien establecida. Las enzimas extracelulares poseen tres ventajas. 1. Dado que la molécula es segregada fuera de la célula, no se requieren técnicas de ruptura celular, técnicas que a veces son difíciles de aplicar a gran escala. 2. El número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de la mezcla. Contrariamente a todo ello, las enzimas intracelulares se han de separar a partir de una mezcla amplia de sustancias, que incluye otras proteínas y materiales contaminantes, tales como los ácidos nucléicos, por ejemplo. 3. Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura más compacta y son menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes intracelulares. En consecuencia, los microorganismos particularmente los que segregan enzimas son la materia prima preferente del enzimólogo industrial. Convencionalmente se define a las enzimas extracelulares como aquellas que han cruzado la membrana celular. Es importante establecer este concepto, porque los microorganismos poseen una variedad de estructuras del tipo de la pared celular y en muchos casos la enzima extracelular se encuentra asociada a ellas y no liberada al medio de cultivo. ReCiTeIA - v.9 n.1 10 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Davis y Tai (Citado en Gacesay Hubble, 1990) durante su síntesis en el interior de la célula bacteriana, ciertas proteínas son reconocidas como moléculas destinadas a la exportación mediante la presencia de un péptido serial N-Terminal. Estas enzimas extracelulares se sintetizan parcialmente en los ribosomas libres del citosol, antes de que el complejo (dirigido por el péptido serial) se asocie a la membrana celular. La biosíntesis de la enzima prosigue a continuación, mientras se produce la secreción de la cadena peptídica en crecimiento (secreción cotranslacional). El péptido N-Terminal es separado, durante el proceso de secreción, por medio de una proteinasa ligada a la membrana (Fig. 1). Walter et al (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) el proceso de secreción descrito para las bacterias es esencialmente idéntico para los hongos y otros eucariotas. Sin embargo, la cadena peptídica es introducida durante su síntesis en el lumen del retículo endoplasmático, en vez de ser dirigida hacia la membrana citoplasmática Desde dicho lumen, la enzima es procesada a través del aparato de Golgi (Fig. 2) y, finalmente, es exportada en vesículas hacia la membrana celular. Esta complejidad extra del proceso en las células eucariotas permite que las enzimas segregadas sean modificadas extensamente durante su paso a través del retículo endoplasmático y aparato de Golgi. Freedman y Hawkins (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) las modificaciones postranslacionales que pueden incluir glucosilaciones, separación de pequeños fragmentos peptídicos, introducción de puentes disulfuro y muchas otras posibilidades suelen tener una influencia importante sobre la estabilidad y propiedades de la enzima. Debe advertirse que, aunque éste es el mecanismo general que opera en los eucariotas, existen ejemplos de ciertos hongos que carecen de aparato de Golgi convencional, en esos organismos el mecanismo de secreción es desconocido. Las bacterias y los hongos están rodeados por paredes celulares integradas respectivamente por peptidoglucanos y por complejos de glucano/quitina en unión (1 -> 3). Cuando la enzima ha sido segregada, lo habitual es que pueda difundir libremente a través de la pared celular y, en el caso de los hongos y bacterias Gram positivas, llegar al medio externo. Alternativamente, algunas enzimas permanecen asociadas a estructuras de la membrana o la ReCiTeIA - v.9 n.1 11 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA pared celular. En las bacterias Gram negativas la secreción de enzimas es más compleja, debido a la presencia de una membrana externa; por esa causa las enzimas segregadas son retenidas a menudo en el espacio periplásmico (que está situado entre la pared celular y la membrana interna), en vez de ser liberadas al medio de cultivo. Esta membrana extra y la diferente localización de las proteínas ha restringido el uso de los microorganismos Gram negativos para la obtención de enzimas extracelulares; de hecho, la única enzima relevante producida por una bacteria Gram negativa es la pullulanasa, de la Klebsiella pulmoniae. Figura 1. Secreción co-tradicional de las proteínas bacterianas. ReCiTeIA - v.9 n.1 12 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Figura 2. de DeDuve (Citado en Gacesa y Hubble, 1990). Secreción y procesamiento de enzimas en eucariotas. En la parte derecha del diagrama se muestra el itinerario y los procesamientos correspondientes a la secreción de proteínas, desde su síntesis por los ribosomas ligados a membrana hasta su descarga exocitosica. En la parte izquierda se observa que una proteina integral de la membrana que ha sido sintetizada en el vehículo endoplasmico utiliza la misma vía para llegar a su destino. 3. PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS. Webb, (Citado en Gacesay Hubble , 1990 ) la edición ordinaria de la International Union of Biochemistry Handbook of Enzyme Nomenclature comprendía casi 2.500 reacciones diferentes catalizadas por enzimas, las cuales han ido apareciendo en la literatura científica. Esta cifra subestima el número total de enzimas descubiertas, ya que es frecuente la existencia de una multiplicidad de proteínas con propiedades ligeramente distintas catalizando una misma reacción. De estas 2000 enzimas «tipo», alrededor del 15 % son asequibles a través de los proveedores de productos bioquímicos, en cantidades que oscilan entre los microgramos y kilogramos; son suministradas, esencialmente, para propósitos de investigación. ReCiTeIA - v.9 n.1 13 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Godfrey y Reichelt (Citado en Gacesa y Hubble, 1990), sin embargo, solo unas 40-50 enzimas son fabricadas a escala industrial, es decir, en cantidades que van desde multikilogramos a toneladas anuales. Esta cincuentena de enzimas es producida a partir de microbios, plantas o animales y catalizan, en general, reacciones hidrolíticas simples. Gacesa y Hubble (1990) explica: La posibilidad de emplear las enzimas para procesos biosintéticos que requieran coenzimas todavía constituye un reto importante para la industria, aunque su logro será ampliamente compensado desde el punto de vista económico. La mayoría de las enzimas que son comercialmente importantes se produce a partir de un número limitado de microorganismos. Las especies mas útiles al respecto se han establecido, sobre todo, a partir de las ya conocidas; estas suelen ser las que se emplean en las industrias alimentarias o las que se encuentran, como contaminantes inofensivas, en los comestibles. Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (por ejemplo, lipasa pancreática y tripsina) debido a que estas pueden ser reemplazadas por otras similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos, aunque catalíticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicación. Los recientes avances en este campo han permitido la adaptación de las técnicas del ADN recombinante para posibilitar que ciertos genes de mamíferos sean clonados en las bacterias o levaduras idóneas, facilitando así la producción de enzimas originariamente de animales por medio de la tecnología convencional de la fermentación. Las plantas también han sido fuente tradicional de un cierto número de enzimas. A partir del látex producido por la papaya, higuera, piña y (en menor grado) otras especies, se ha aislado, sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la ventaja de que su látex es fácil de obtener, principalmente a partir de los frutos y utilizando mano de obra no calificada. Por regla general el látex se deja secar al sol y, si es necesario, puede incluso usarse como preparación enzimática cruda. ReCiTeIA - v.9 n.1 14 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA La cebada malteada constituye otra fuente principal de enzimas vegetales. La industria cervecera ha utilizado tradicionalmente este material crudo para extraer varias proteinasas y glucohidrolasas. En términos globales, la cebada malteada contribuye de manera relevante al mercado de enzimas. Por otra parte, se han llevado a cabo estudios sobre la producción de enzimas a partir de cultivos de células animales o vegetales. En la actualidad se encuentran bien establecidas las condiciones técnicas para el crecimiento de estas células en grandes cantidades. Sin embargo, desde el punto de vista económico parece poco probable que en el futuro inmediato lleguen a convertirse en una fuente importante de enzimas. El problema esencial es que el crecimiento de estas células es lento y por ello es difícil mantener su esterilidad. En general se considera que para que una enzima obtenida por cultivo celular sea viable económicamente debe tener un valor intrínseco mil veces superior al producto equivalente elaborado mediante la fermentación microbiana clásica. La consecuencia principal derivada de la problemática que plantea el uso de productos de origen vegetal o animal es que los microorganismos contaminan, siendo la fuente primaria de las enzimas industriales. 4. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS. Colowick y Kaplan,; Scopes, (Citado en Gacesa y Hubble , 1990 ) la extracción y la purificación de una enzima presentan al enzimologo frente a una paradoja. Normalmente, es necesario para aislar cada una de las enzimas un proceso de purificación diferente; sin embargo, existen relativamente un número escaso de técnicas que permiten la separación de proteínas. No obstante, mediante el uso secuencial de un número de estas técnicas y para la explotación de las utilidades implicadas en la metodología, ha sido posible aislar un número elevado de enzimas en estado puro o prácticamente puro. Uno de los objetivos de este capitulo es el ilustrar los principios esenciales de la purificación enzimática e indicar algunas consideraciones sobre el proceso para cuantificar el grado de pureza del producto final. En este punto es necesario preguntarse cuando existe una necesidad para la purificación completa de una enzima. Esto ha llegado a ser casi axiomático en bioquímica ya que si una enzima ReCiTeIA - v.9 n.1 15 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA presenta una elevada importancia entonces, de entrada, ella debería ser purificada hasta homogeneidad (Gacesay Hubble, 1990). Bonnerjea et al, (citado en Gacesa y Hubble, 1990) sin embargo, para muchos propósitos biotecnológicos esto no es necesario y una amplia variedad de procesos resultarían antieconómicos si la enzima fuese completamente pura. Para la mayoría de las aplicaciones probablemente es suficiente un menor grado de purificación aunque existan algunas actividades contaminantes que no afecten al sustrato(s), al producto(s) o a las enzima(s) involucradas en un proceso específico. Se ha ideado un número amplio de procesos de purificación para el aislamiento de proteínas y diversas enzimas se han purificado satisfactoriamente mediante el uso de más de un proceso. Los procedimientos de purificación enzimática, aunque a primera vista parecen complejos, pueden ser reducidos a una aplicación secuencial de un número mínimo de métodos simples. En primer lugar será considerada la extracción y purificación a nivel de laboratorio, y posteriormente se describirá el proceso a una escala superior. 4.1 EXTRACCION ENZIMATICA. Gacesa y Hubble, (1990) expone: En primer lugar y como mas importante o principal se debe obtener un extracto adecuado del tejido que contiene la enzima. En el caso de muchas enzimas hidroliticas sencillas de origen microbiano, la proteína se libera en el medio de cultivo y se separa de las células mediante centrifugación siendo esta la única etapa necesaria. Esta técnica es particularmente adecuada para trabajos con bacterias Gram-positivas tales como el Bacillus subtilis (pro-ductor de la proteasa, subtilisina) y en menor grado para organismos gram-negativos como la Klebsiella pneumoniae (productora de la a-1-6 glucosidasa, pululanasa). Sin embargo, la presencia de una membrana externa en organismos Gramnegativos puede conducir a complicaciones y quizás solamente se libere parcialmente la enzima en el medio. En algunos microorganismos eucarioticos, como en el caso de la levadura Kluyveromyces marxianus, la enzima puede localizarse en la parte externa de la membrana celular pero no se libera en el medio de crecimiento. Frecuentemente, la liberación de la enzima implica ReCiTeIA - v.9 n.1 16 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA una destrucción parcial o total de la célula. Por ejemplo, la inulinasa (enzima semejante a la invertasa que degrada a B2 -»1 polifructosanos, p.e. inulina) de K. marxianus puede liberarse desde la superficie de la levadura por autolisis de las células a 50 °C durante 14 horas. Para la obtención de enzimas intracelulares a partir de microorganismos se pueden producir problemas mayores que los descritos anteriormente. Las técnicas de lisis celular como es el caso de la disrupción mecánica (Presión celular, molido con alúmina), sonicación tratamiento con detergentes y choque osmótico son entre otros los que se han utilizado como más adecuados para liberar las enzimas intracelulares. Sin embargo, el extracto enzimático, contiene, en estos casos, muchos otros componentes celulares y estos serán reconocidos cuando se determinen en las etapas posteriores de la purificación. En particular, las células bacterianas lisadas liberan cantidades superiores de ácidos nucleicos, por ello una de las primeras etapas en los procesos de purificación están encaminados a la eliminación de este contaminante. Las técnicas que se usan para la extracción de enzimas a partir de tejidos de animales son, en conjunto, similares a las empleadas para la obtención de enzimas intracelulares de microorganismos eucariontes (p.e levaduras). La homogenización del tejido seleccionado en una solución tampón adecuada es la técnica más ampliamente utilizada. Como segundo paso se utiliza, a menudo, la centrifugación diferencial para seleccionar la subfracción celular o el orgánulo apropiado. El aislamiento de un orgánulo específico puede que por si mismo proporcione una purificación considerable de la enzima, aunque a gran escala esto no pueda realizarse de manera práctica. La extracción de enzimas a partir de tejidos vegetales presenta un nuevo conjunto de problemas y el numero comparativamente pequeño que han sido aisladas es en parte un reflejo de las dificultades que se van a presentar. Las paredes celulares vegetales son un reto importante para el enzimólogo. Las fuerzas necesarias para destruir esta barrera celular son tan elevadas como para provocar generalmente, durante los procesos, la desnaturalización de las enzimas deseadas. Además, muchos vegetales contienen compuestos fenólicos que son oxidados enzimáticamente (polifenol oxidasas) por la ReCiTeIA - v.9 n.1 17 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA presencia de oxigeno molecular formando productos que pueden inactivar rápidamente un numero elevado de enzimas. Sin embargo, existen diversos ejemplos de enzimas útiles que han sido obtenidas a partir de plantas por métodos sencillos mediante procesos biotecnológicos, las proteasas bromelaina (pina) y papaina (papaya). El pH, la fuerza iónica y la composición del medio que se utiliza para la extracción de una enzima son de gran importancia en este proceso y en las etapas posteriores de la purificación. Existe una clasificación de reactivos (Tabla 1) que se han usado en los tampones de extracción ya que minimizan la desnaturalización y la degradación de enzimas, mediante una serie de experiencias piloto se puede llegar a la elección de una combinación apropiada de estos compuestos. Al conseguir un medio de extracción satisfactorio se ha alcanzado una meta, aunque puede ser que otra combinación diferente de compuestos fuera mas adecuada. TABLA 1 Compuestos utilizados en tampones de extracción. Tomado de (Gacesay Hubble, 1990). ReCiTeIA - v.9 n.1 18 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 4.2 PURIFICACION ENZIMATICA. Gacesa y Hubble, (1990) expone que: Es probable que la enzima que uno desea se encuentre presente en el medio de extracción solamente en una proporción mínima frente al total de proteínas (generalmente, 0,01 -1 %). Por ello, en las primeras etapas de la purificación enzimática deberían encaminarse a la eliminación de gran parte de sus proteínas contaminantes, tanto como sea posible y de la forma más fácil. Idealmente, podría efectuarse sacando partido de alguna faceta particular de la estabilidad de la enzima bajo condiciones adversas. Fraccionamiento. Puede ser muy efectivo el calentar la muestra o ajustar a valores extremos el pH. Por ejemplo, la aspartato aminotransferasa puede aislarse a partir de corazón de cerdo mediante calentamiento breve (20 minutos) del medio de extracción a 72 °C en presencia del substrato 2-oxoglutarato y del inhibidor competitivo, el succinato Es importante el señalar que cuando el succinato y el 2-oxoglutarato se eliminan durante esta etapa, se pierde la mayor parte de la enzima. Se conoce la razón del incremento de la estabilidad a nivel molecular. Una molécula de succinato es capaz de formar puentes salinos con dos residuos de arginina, introduciendo un enlace cruzado efectivo, en el caso de 2oxoglutarato este induce la formación reversible de un enlace covalente entre el coenzima, piridoxal fosfato, y la enzima. Por otro lado, la hialuronidasa, una enzima de interés farmacéutico, se extrae de forma adecuada a partir de testículos de buey utilizando una mezcla de acido acético/acido clorhídrico a pH de 2,1. Una gran parte de las proteínas contaminantes, incluyendo a la B-glucuronidasa, son desnaturalizadas y precipitadas mediante la aplicación de esta metodología. El fraccionamiento con sulfato amónico es una etapa extremadamente efectiva en la purificación proteica. La técnica tiene la ventaja adicional que reduce el volumen de material, lo cual es normalmente un punto importan-te a considerar a este nivel. En ReCiTeIA - v.9 n.1 19 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA principio, el método depende de la capacidad que presentan las concentraciones elevadas de sulfato amónico para captar las moléculas de agua presentes y así evitan de manera efectiva la solvatación de las proteínas. En unas condiciones específicas cada proteína podría precipitar en un rango de concentración característico y estrecho de sulfato amónico. El pH del medio, la temperatura y la concentración proteica son importantes, debiéndose mantener con las menores variaciones posibles entre las diferentes muestras si se desea obtener una buena reproductividad. Si una concentración de sulfato amónico a un cierto valor de pH no es satisfactoria, entonces se puede repetir la experiencia a un nuevo pH y en estas condiciones podría producirse casi con seguridad resultados adecuados. El método tiene dos inconvenientes notables. El sulfato amónico contiene trazas de metales pesados que pueden ser suficientes para inactivar a una enzima; este problema puede evitarse con facilidad mediante el uso de sulfato amónico de gran pureza (grado Analar). La otra desventaja es que la preparación enzimática contiene una concentración elevada de sulfato amónico y normalmente esta sal debe eliminarse mediante diálisis, ultrafiltración o columnas de desalado antes de continuar con la siguiente etapa de la purificación. Una alternativa al fraccionamiento con sulfato amónico es la utilización de solventes orgánicos, particularmente acetona o alcoholes, para fraccionar proteínas. Los solventes deberían ser usados solamente a temperaturas bajas (< 0 °C), de otra manera la mayoría de las enzimas se desnaturalizarían rápidamente. Además, la acetona y los alcoholes son altamente inflamables y su aplicación ha ocasionado en los laboratorios diversos accidentes fatales, por ello una temperatura más baja que el punto de ignición del solvente es conveniente para la seguridad. En general, el uso de solventes ha disminuido en los últimos años, aunque existen algunos fraccionamientos particularmente adecuados basados en esta metodología, el fraccionamiento de Cohn para proteínas sanguíneas utilizando etanol. Para enzimas intracelulares de origen bacteriano, es bastante aconsejable eliminar los ácidos nucleicos en esta etapa. Estos compuestos pueden ser precipitados con sulfato de ReCiTeIA - v.9 n.1 20 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA protamina o, alternativamente, por la unión a una columna de intercambio anionico (p.e. DEAE-celulosa), quedando la enzima libre en la solución. El cambio más apreciable después de la eliminación de los ácidos nucleicos es una reducción considerable en la viscosidad del extracto. 5. ESPECIFICIDAD ENZIMÁTICA. (Quintero, 1987) Explica: Una de las características mis sobresalientes de la catálisis enzimática es el alto grado de especificidad de la enzima por el o los sustratos de la reacción. Esta especificidad se limita a una sola molécula o a un rango muy restringido de sustancias químicamente relacionadas con ella. Los diferentes grupos de enzimas variado mucho su grado de especificidad según sean el o los sustratos de la reacción, Algunos, como el de las deshidrogenasas, comprenden enzimas de las mas especificas ya que, en términos generales, solo aceptan un sustrato como donador de hidr6gcnos y otro como receptor. (Badui, 2006) Plantea: Las enzimas tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas de manera muy específica; es decir, su intervalo de acción se limita a un determinado tipo de compuesto que debe reunir ciertas características estructurales para que pueda ser utilizado como sustrato. Su especificidad, propiedad que las hace muy diferentes a muchos catalizadores no biológicos, se puede abordar de diferentes maneras. La especificidad estereoquímica, se puede explicar a partir de la especificidad de las glucosidasas. La maltosa (O-α-Dglucopiranosil-(1-4)-O-α-D-glucopiranósido) y la celobiosa (0-β-D-glucopiranosil-(l-4)O-β-D-glucopiranósido) son disacáridos compuestos por dos moléculas de glucosa, poseen el enlace glucosídico con configuración α y β con respecto al C1, respectivamente, lo que ocasiona una orientación de los grupos glucosúricos diferente. Esto ocasiona que la celobiosa no pueda ser hidrolizada por una α-glucosidasa, así como la maltosa no puede ser sustrato de una β-glucosidasa. La estereoespecificidad de una enzima define también ReCiTeIA - v.9 n.1 21 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA que esta pueda reconocer una forma óptica específica del sustrato (L-aminoácidos o Dazucares). Por otro lado, también las enzimas tienen regioespecificidad al reconocer un determinado grupo químico solo en determinada posición de una molécula. Sin embargo, existen enzimas con baja especificidad, que se presenta por ejemplo cuando las enzimas atacan un determinado tipo de enlace químico sin importar la naturaleza del sus-trato; tal es el caso de las lipasas que hidrolizan enlaces éster entre ácidos y alcoholes en una gran variedad de compuestos orgánicos, o en algunas proteasas que pueden hidrolizar enlaces peptídicos entre cualquier aminoácido. Existe también la llamada químioselectividad o especificidad de grupo que se presenta cuando las enzimas actúan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo químico especifico al lado de este; el ejemplo de la tripsina es adecuado ya que esta enzima hidroliza los enlaces peptídicos en los que el grupo carboxilo del enlace esta dado por lisina o arginina; igualmente, las proteasas vegetales (papaína y ficina) hidrolizan las uniones adyacentes a aminoácidos básicos, leucina o glicina; por su parte, la pepsina actúa sobre los enlaces que contienen aminoácidos aromáticos o ácidos dicarboxílicos. (Madriñan, 1988) Plantea: Las enzimas se distinguen de los catalizadores no biológicos por su especificidad. Las enzimas presentan distintos grados de especificidad: 1. Especificidad Estereoquímica. Muchas enzimas muestran preferencia por determinado Isómero óptico o geométrico. 2. Especificidad Baja. La enzima no discrimina el sustrato y Únicamente especificidad hacia el enlace que ataca. 3. Especificidad de Grupo. La enzima es específica para determinado enlace químico adyacente a un grupo específico. 4. Especificidad Absoluta. La enzima puede atacar solo un sustrato y catalizar una sola reacción. La mayoría de las enzimas pertenecen a esta categoría. presenta ReCiTeIA - v.9 n.1 22 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 6. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Badui, (2006) Expone: La velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio, entre los más importantes. 6.1 Efecto del pH. La actividad de las enzimas depende fuertemente de la concentración de iones hidronio del medio, ya que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína, incluyendo a los del sitio activo, del sustrato (en caso de ser ionizable), o del complejo enzima-sustrato; de hecho el pH influye en la estructura tridimensional de la proteína y a su vez, sobre la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. La mayoría de las enzimas presentan un rango de pH relativamente estrecho en el que presentan una actividad óptima, desactivándose en pHs extremos (figura 3); aunque existen excepciones, como la catalasa bovina o la a-amilasa que presenta un rango de actividad optima muy amplio. En la tabla 1 se muestran los valores de pH óptimo para algunas enzimas. Para su aplicación en alimentos, hay que considerar que el pH de la mayoría de los alimentos varia entre 3.0 y 7.0, solo las frutas y sus derivados tienen un pH mas acido que llega a ser de 2.2. Por obvias razones, se seleccionan enzimas que funcionen bien al pH del alimento, pues este es difícilmente modificable. ReCiTeIA - v.9 n.1 23 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Figura 3. Efecto del pH en la actividad enzimática: (a), pH optimo; (b), intervalo de estabilidad de la enzima; (c), intervalo de inactivación reversible, y (d), inactivación irreversible. Tabla 1. pH de actividad optima de algunas enzimas ENZIMA Pepsina (bovina) Catalasa (higado de bovino) Renina (ternero) Catepsinas (higado) Poligalacturonasa (tomate) β-amilasa (camote) Ficina (higo) Polifenoloxidasa (durazno) Lipoxigenasa 2 (soya) α-amilasa (saliva humana) α-quimotripsina (bovina) Lipoxigenasa 1 (soya) pH OPTIMO 2.0 3-10 3.5 3.5-5 4.0 5.0 5.6 6.0 7.0 7.0 8.0 9.0 ReCiTeIA - v.9 n.1 24 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA En ocasiones, es posible inhibir la actividad enzimática endógena, si el alimento lo permite, mediante la reducción del pH adicionando ácidos disponibles como aditivos (por ejemplo, adición de acido cítrico al aguacate). El pH óptimo se debe determinar experimentalmente, y se deben considerar otras variables operacionales como la temperatura, el sustrato y la capacidad amortiguadora de la solución tampón utilizada. Si la enzima se encuentra en un pH muy alejado del óptimo, se alterara su estructura secundaria y terciaria como consecuencia de la protonación o desprotonación de los residuos de aspártico, glutámico, lisina, arginina e histidina, principalmente. La consecuencia será el desplegamiento o desnaturalización permanente o irreversible de la proteína. Si el ambiente en el que se encuentra la enzima no esta a un pH extremo, esta puede replegarse y regresar a su conformación y actividad original, es decir, se puede re naturalizar. 6.2 Efecto de la Temperatura. Como sucede con cualquier otra reacción química, la velocidad de las reacciones enzimáticas se incrementan con la temperatura, al aumentar la energía cinética de las moléculas, pero solo en el intervalo en que la enzima es estable y retiene su capacidad catalítica; en casos extremos, cuando el incremento es muy grande, se favorece la desnaturalización y consecuentemente la proteína pierde su capacidad catalítica. Existen varios factores que, además de la estabilidad conformacional, también afectan la actividad enzimática al aumentar la temperatura, y son: la solubilidad de gases (oxigeno), el pH de la solución amortiguadora, la afinidad de la enzima por el sustrato, por activadores o inhibidores; así como la presencia de reacciones de competencia. Por esta razón, cada enzima tiene un intervalo optimo de temperatura en el cual se logra la mayor actividad, para la mayoría esta entre 30 y 45°C, y se inactiva a mas de 60°C, a esta temperatura la energía introducida en el sistema sobrepasa la energía de las fuerzas que mantienen la estructura activa de la enzima (figura 4). ReCiTeIA - v.9 n.1 25 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Figura 4. Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas. El término Q10 se utiliza para medir el efecto de la temperatura en la velocidad de reacciones químicas; se expresa como una relación entre dos velocidades a dos temperaturas con una diferencia de 10°C entre ellas: En el caso de enzimas, en rangos entre 20 y 40 °C se obtienen valores de Q10 cercanos a 2, lo que indica que la velocidad de reacción se duplica por cada 10 °C de aumento en la temperatura, dentro del intervalo en el que la enzima es estable. En la industria alimentaria se utilizan comúnmente los tratamientos térmicos como método de conservación, con los que no solo se eliminan los microorganismos, sino también se desactivan las enzimas que llegan a causar cambios indeseables, como se ejemplifica en la figura 5., ya que aun en alimentos congelados pueden llevarse a cabo reacciones enzimáticas, aunque a una velocidad muy baja. El objetivo específico del proceso de escaldado es eliminar la actividad de enzimas endógenas que oxidan alimentos de origen vegetal. ReCiTeIA - v.9 n.1 26 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Figura 5. Inactivación térmica de la polifenol oxidasa de la remolacha sometida a incubación a diferentes temperaturas. Cabe mencionar que actualmente se dispone de enzimas obtenidas de microorganismos extremo-filos aislados de regiones de la Tierra que se encuentran a muy altas temperaturas y presiones como las chimeneas marinas, los volcanes o los geisers. Estas enzimas funcionan de manera óptima a temperaturas muy altas, incluso arriba de los 100 °C que aunque no son frecuentes en el procesamiento de alimentos, son importantes para la biotecnología moderna. Este es el caso de la ADN polimerasa obtenida de Thermus aquaticus, esencial para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); o de lipasas obtenidas de Thermotoga spp. Las enzimas termófilas extremas tienen un potencial de aplicación en el campo alimentario si consideramos que se necesitan enzimas que resistan condiciones drásticas de operación, por ejemplo, en el procesamiento de almidón o que operen a temperaturas que limiten los riesgos de contaminación microbiana. Es importante recordar que los procesos químicos se desarrollan generalmente a altas temperaturas. 6.3 Efecto de la Concentración de Sustrato. Una enzima funciona de manera más eficiente cuando la concentración de sustrato esta en exceso en: relación con la concentración de enzima. Esto se debe a que las colisiones ReCiTeIA - v.9 n.1 27 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA "exitosas" con el reactivo son más frecuentes, asegurando así que la mayor cantidad de enzima se encuentre activa. En estas condiciones, el producto se obtiene a la máxima velocidad posible para la cantidad de enzima presente. En caso de que la concentración de sustrato sea menor, la velocidad de reacción disminuye generalmente de acuerdo con un comportamiento como el que se muestra en la figura 6 Este aspecto es muy importante en la caracterización cinética de una enzima, como se verá más adelante. Por otra parte, la acción de una enzima a nivel industrial debe ser óptima tanto en términos de costo como de eficiencia catalítica, por lo que la reacción se debe llevar a cabo en la medida de lo posible a la máxima velocidad. Figura 6. Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción de las enzimas. 6.4. Efecto de la Actividad del Agua. Los alimentos se deshidratan para evitar el crecimiento microbiano; sin embargo, aun en estas condiciones perdura la acción de muchas enzimas. Las verduras y las frutas deshidratadas están sujetas a reacciones de deterioro cuando no se inactivan sus enzimas ReCiTeIA - v.9 n.1 28 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA con un tratamiento de escaldado. Algunas enzimas llegan a actuar con un mínimo de agua, como ocurre con las lipasas que contienen los aceites puros. En ambos casos, la amplia disponibilidad del sustrato hace que las reacciones se logren aun en condiciones de baja actividad del agua (Aa). De hecho, existe evidencia, obtenida por resonancia magnética nuclear (RMN), de que enzimas globulares fijan de 0.2 a 0.3 g de agua en los grupos polares de la superficie, a partir de la cual pueden empezar a funcionar como catalizadores. En otros casos, podría ser necesaria la aplicación de enzimas en medios con bajo contenido de agua, para la síntesis de compuestos en medios orgánicos, condición frecuente en procesos de química orgánica. En este sentido, se ha demostrado ampliamente que las enzimas hidrolíticas pueden catalizar la biosíntesis de esteres, amidas, péptidos y carbohidratos en medios con bajo Aa al invertir las condiciones de equilibrio definidas para un medio acuoso. Para alcanzar valores de Aa bajos, la enzima liofilizada se puede equilibrar en un ambiente con menor Aa, como podría ser en disolventes orgánicos no miscibles con el agua (por ejemplo, n-butanol, hexano, ciclohexano, etc.), o reemplazar agua con disolventes miscibles como el glicerol. Contrariamente a lo que se podría pensar, algunas enzimas son más estables en disolventes orgánicos, sobre todo no polares, que en solución acuosa, este es el caso de la lisozima, la subtilisina y las lipasas. Algunas de las aplicaciones más importantes de enzimas en medios no acuosos incluyen la producción de aspartamo; la reestructuración de triacilgliceroles, por reacciones de transesterificación, para la obtención de lípidos con mejores características industriales (fusión, solubilidad) y nutricionales (con ácidos grasos insaturados). También en medio orgánico es posible sintetizar alquilglucosidos u otros agentes tensoactivos para mejorar las propiedades espumantes y emulsificantes en los alimentos o para facilitar la incorporación de aditivos insolubles, como algunos saborizantes, colores o agentes antioxidantes. 6.5 Efecto de Otros Agentes en la Actividad Enzimática. ReCiTeIA - v.9 n.1 29 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Por su naturaleza química, las enzimas se ven afectadas por todos los factores que influyen en las propiedades físicas y químicas de las proteínas. En el caso de la fuerza iónica, esta altera su estructura tridimensional, lo que trae consigo modificaciones del sitio active Por otra parte, los iones de metales pesados, como mercurio, plata y plomo, generalmente inhiben la acción enzimática, mientras que varios cationes y aniones actúan como activadores; tal es el caso de los cationes de calcio, magnesio, cobre, cobalto, sodio, níquel, potasio, manganeso, hierro y cine, así como aniones de cloro, bromo, yodo. Para cada enzima, deberá analizarse la necesidad de alguna de estas especies, o bien, el daño que pudieran ocasionar. El efecto activador se debe a que: En ocasiones forman parte del sitio activo, se requieren para la interacción de la enzima con el sustrato o ayudan a mantener la conformación tridimensional, interactuando con alguna región de la enzima. Algunas enzimas requieren de otros cofactores para poder presentar la actividad catalítica. En la tabla 2 se presentan algunos ejemplos de enzimas y sus correspondientes cofactores. Se trata por lo general de enzimas clave en el metabolismo debido a su importancia en reacciones de síntesis y de oxidoreducción. La necesidad de producir y regenerar los cofactores ha sido una limitante en la aplicación industrial de este tipo de enzimas. Tabla 2. Características de algunos cofactores enzimáticos. Por otro lado, muchos productos de origen animal y vegetal contienen proteínas capaces de inhibir la actividad catalítica de algunas enzimas; su función biológica está relacionada con mecanismos reguladores para evitar la activación prematura de proenzimas o como ReCiTeIA - v.9 n.1 30 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA defensa contra las enzimas que emplean insectos o microorganismos como elemento de ataque. Entre los inhibidores más conocidos están los que evitan la acción de las proteasas, que se encuentran en las leguminosas y cereales. En la soya existen dos tipos de inhibidores de naturaleza proteínica, conocidos como "de Kunitz" (21 kDa), específico para tripsina, y "de Bowman-Birk" (8.3 kDa) que inhibe tanto tripsina como quimotripsina. En otras leguminosas se producen preferentemente inhibidores del tipo Bowman-Birk. Ambos tipos de proteínas son termoresistentes, debido a que poseen hasta 7 puentes disulfuro. Dado que estos inhibidores causan un detrimento en la calidad nutricional, se deben inactivar, lo que se logra con el cocimiento por un tiempo aproximado de 1 hora a las temperaturas normales de cocción. Existen otros inhibidores de proteasas, como el ovomucoide (específico para tripsina) y el ovoinhibidor de la clara del huevo, que tiene un espectro de inhibición mayor, pues inhiben tripsina, quimotripsina y subtilisina. Los cereales contienen inhibidores de amilasas, cuya función es también proteger al grano contra los depredadores, impidiendo la degradación del almidón. Además, se han identificado inhibidores de invertasa, lipasas y de algunas enzimas pépticas. 7. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. Badui, (2006) expone que: Existen varios modelos que explican el funcionamiento de una enzima como catalizador, siendo uno de los más aceptados el desarrollado por Michaelis y Menten en 1913 (figura 6). Este modelo considera que cuando el reactivo o sustrato (S) esta en contacto con la enzima (E), rápidamente se combinan para formar un complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente, de este complejo se liberan tanto el producto como la enzima, dejándola disponible para combinarse con una nueva molécula de sustrato. Lo anterior se representa en la siguiente ecuación general para una reacción en la que participa un solo sustrato: ReCiTeIA - v.9 n.1 31 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Según lo indica el sentido de las flechas, tanto la formación del complejo enzima-sustrato como su consumo para liberar al producto, pueden ser procesos reversibles. Los coeficientes k1, k-1, k2 y k-2 representan las constantes de velocidad para cada reacción. La formación del complejo es generalmente rápida, mientras que su descomposición en producto y enzima libre es un paso lento, (k2 < k1), mientras que k2 es generalmente mucho mayor que k-2. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, una reacción catalizada enzimáticamente puede proceder en cualquier dirección. Por ejemplo, y como se ha señalado ya, algunas reacciones enzimáticas que proceden en dirección hacia la hidrólisis en un medio acuoso, pueden proceder en sentido inverso en un medio con baja disponibilidad de agua. Durante los primeros instantes de la reacción, la velocidad de formación de producto (AP/At) se define como velocidad inicial, v„ y es, de acuerdo con la (Ec.3), proporcionarte la concentración del complejo ES. La concentración de enzima total (ET), en cualquier momento es igual a [E] + [ES] (enzima libre + enzima en forma de complejo (Ec. 4)). Cuando [S]»[E] la enzima está totalmente saturada, esto es, se encuentra formando el complejo con el sustrato (Ec. 5), por lo que se encuentra a su máxima velocidad (Vmax), como se expresa en la Ec. 6. Vn = k2 [ES] [E]T = [E] + [ES] Si [S]»[E], entonces [E]T = [ES] Vn = k2 [E]T = Vmax Ec. 5 Ec. 6 Ec. 3 Ec. 4 Es importante recordar que existe una relación entre la concentración de los reactivos con la velocidad de reacción, lo que define el orden de una reacción química. Se ha mencionado que en el caso de una reacción enzimática la concentración de sustrato se debe mantener muy alta con relación a la concentración de enzima, de tal forma que se trate de una reacción de orden cero (figura 6). Así, la velocidad de reacción, a pH y ReCiTeIA - v.9 n.1 32 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA temperatura constantes, será independiente de la concentración de sustrato y dependerá solamente de la concentración de la enzima, como lo muestra la figura 7 y la Ec. 6. Figura 7. Velocidad de reacción enzimática con respecto a la concentración de enzima. La línea punteada es la relación teórica (Ec.6), y la línea solida la relación observada. Por otra parte, en la figura 6 se observa que en concentraciones bajas de sustrato, la velocidad Vi en los inicios de la reacción es proporcional a la concentración de sustrato y, por lo tanto, se establece un sistema de primer orden; a medida que se incrementa [S], la velocidad se vuelve de orden fraccionario y posteriormente de orden cero; en este ultimo caso Vi es independiente de la concentración del sustrato, la enzima alcanza su saturación y se obtiene la máxima velocidad, como ya se menciono anteriormente. A la relación entre k1 k-1 y k2 se le conoce con el nombre de constante de MichaelisMenten o Km. Ec. 7 La Km, junto con k2, también conocida como constante catalítica (fccat) o numero de recambio, son específicas para cada enzima y la relación fccat/Km determina la eficiencia catalítica de la enzima para un determinado sustrato (Tabla 3). ReCiTeIA - v.9 n.1 33 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA La ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 8) representa una hipérbola (Figura 6) y describe la variación del orden de reacción en función de la concentración del sustrato: en condiciones de saturación, la Ec.8 se transforma en Vi = Vmax que representa una ecuación de velocidad de orden ce-ro. Por otra parte, cuando [S]0«Km, entonces la ecuación de Michaelis se puede simplificar a Vi = Vmax ([S](/Km), que puede simplificarse como v = k' [S], donde k' equivale a una constante de primer orden, como se señala en la misma figura 6. En general: Ec. 8 Aparentemente en la igualdad de Michaelis-Menten no existe ningún termino que incluya la concentración de la enzima [E]T; sin embargo, esta se encuentra implícita en Vmax ya que es igual a k2[E]T, como se preciso en la Ec. 6. De la Ec. 8 se puede deducir una relación importante, ya que cuando Vi = 1/2 Vmax, se obtiene que Km = [S]; es decir, la relación de constantes de velocidad definida en la Ec.7, es igual a la concentración del sustrato a la cual la velocidad observada en la reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de Km no es absoluto, depende del pH, la temperatura y del tipo de sustrato, mas no de su concentración. La Km es un índice de la afinidad que tiene una enzima por un determinado sustrato: los valores bajos indican que la enzima requiere de bajas concentraciones de sustrato para alcanzar la saturación; por el contrario, los valores altos representan enzimas con poca afinidad hacia el sustrato, ya que es necesaria una elevada concentración de este para que se saturen. Por ejemplo, en la tabla 3 se observa que la quimotripsina hidroliza varios sustratos con diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad que tenga hacia cada uno de ellos, se observa que la N-benzoiltirosinamida es el mejor sustrato para esta enzima y que el tamaño del grupo unido a la tirosina determina la afinidad de la enzima hacia cada sustrato, lo que se refleja en el valor de Km. ReCiTeIA - v.9 n.1 34 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Tabla 3. Ejemplos de los valores de las constantes catalíticas para varias enzimas algunas con más de un sustrato. 8. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS. Goldstein y Katchalski-Katzir, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990). Considerando las propiedades de las enzimas es también importante examinar las implicaciones de cualquier modificación hecha en la estructura enzimática. Desde el punto de vista de un proceso puede ser deseable «inmovilizar» la enzima para permitir su retención en un reactor Esta inmovilización esta dirigida a inducir cambios en el medio ambiente de la enzima y por lo tanto provoca cambios en las propiedades observadas. El tipo y la magnitud de estos cambios dependen de la enzima y del método de inmovilización utilizado. Gacesa y Hubble, (1990) describen que: En 1972 la proliferación en la metodología de inmovilización condujo a un intento de racionalizar la clasificación de los sistemas de enzimas inmovilizadas. Los principales grupos descritos están representados en la Fig. 8. Las técnicas para la inmovilización de enzimas están ahora bien establecidas y hay una literatura muy extensa que describe este tema. Aquí se suministra una breve descripción de los principales tipos de inmovilización. ReCiTeIA - v.9 n.1 35 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Figura. 8 .Métodos comunes de inmovilización de enzimas. Las enzimas pueden ser adsorbidas sobre la superficie de un soporte. Este proceso resulta de interacciones físicas más que químicas (e.g. efectos de carga e interacciones hidrofobicas) y la flexibilidad de este tipo de inmovilización reduce al mínimo las posibilidades de distorsión estructural de la enzima. Se considera que la adsorción es análoga a lo que ocurre en las enzimas unidas a membranas in vivo. La naturaleza de las interacciones es tal que la adsorción es generalmente un proceso reversible y cambios en las condiciones del proceso, e.g. pH y fuerza iónica, pueden causar deserción. A pesar de este inconveniente la adsorción ha sido utilizada para algunos procesos industriales (e.g. la glucosa isomerasa en DEAE-celulosa se ha utilizado comercialmente). La unión covalente de enzimas solubles a un soporte insoluble es el método mas común para la inmovilización de enzimas habiéndose utilizado una amplia gama de técnicas y soportes para este propósito. Aunque parte de la actividad pueda perderse durante el proceso de acoplamiento es improbable la lixiviación de la enzima a partir del soporte en preparaciones unidas covalentemente, asegurando una mayor estabilidad del material catalítico. Messing, 1985; Woodward, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) aunque han sido estudiados otros métodos de inmovilización (e.g. membranas ultrafiltrantes), la adsorción y la unión covalente representan las principales metodologías. Revisiones mas detalladas de los métodos de inmovilización han sido presentadas por otros autores. 8.1 Efectos de la inmovilización sobre la actividad enzimática. Goldstein, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990), Cuando una enzima es inmovilizada la actividad de la preparación es siempre diferente a la de la forma natural. Las razones para ello ReCiTeIA - v.9 n.1 36 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA son muchas pero es posible identificar las tres principales influencias, a saber, efectos conformacionales, de partición y difusionales. Gacesa y Hubble, (1990) describen: La inmovilización puede causar perturbaciones estructurales en la proteína, reduciendo la eficacia catalítica de la enzima. Además, la inmovilización puede limitar el acceso del reactivo al centro activo de la enzima, reduciendo nuevamente la actividad. Ambos fenómenos pueden ser descritos como efectos conformacionales. Los efectos de partición ocurren cuando las concentraciones de reactivo o de otros compuestos relacionados con la actividad de la enzima pueden ser diferentes en la superficie del soporte matriz de las observadas en el grueso de la solución. Estos efectos pueden surgir por interacciones electrostáticas o hidrofobicas, y dependiendo de el(los) componente(s) implicado(s), los efectos de partición pueden intensificar o rebajar la velocidad de la reacción observada. 9. IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS. Garcia et al, (2004) explica que: Las enzimas intervienen en prácticamente todas las áreas involucradas en la tecnología de alimentos, por lo que el enzimologo debe aprender a caracterizar y aplicar enzimas exógenas, a activar o inhibir, dependiendo del alimento, enzimas endógenas, a aprovechar su termoestabilidad para asociar su desactivación con tratamientos térmicos y emplearlas como parámetros de control de calidad o simplemente, aprovecharlas como herramienta analítica.. Es conveniente señalar algunas características y limitaciones relativas a la aplicación de enzimas en alimentos: La experiencia ha demostrado que se requieren de 5 a 10 años para la realización industrial de un desarrollo enzimático novedoso. ReCiTeIA - v.9 n.1 37 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA La evolución de este sector ha sido lenta y caracterizada frecuentemente por sustituciones más que por verdaderas innovaciones: hidrolisis de almidón, inversión de sacarosa, sustitución de quimosina por "cuajos microbianos", etc.. Son escasos los procesos que realmente pueden llamarse enzimáticos (producción de glucosa y de jarabes de fructosa), ya que en la mayor parte de los casos las enzimas fungen un papel de aditivos con funciones como disminuir la viscosidad, mejorar la filtración, evitar la turbidez, clarificar, mejorar la digestibilidad, mejorar la textura, evitar la cristalización y mejorar las características organolépticas, entre otras. Por razones fundamentalmente toxicológicas, un gran número de enzimas industriales son producidas por un número reducido de microorganismos (los reconocidos generalmente como seguros por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos). Por razones de índole energética (no requiere cofactores), las reacciones enzimáticas industriales son en su mayoría de hidrólisis. Las reacciones de síntesis siguen siendo no viables fuera de la célula, ante la dificultad de producir y regenerar cofactores económicamente, aunque existen varios desarrollos a nivel piloto. Por otro lado y aprovechando el conocimiento sobre las propiedades catalíticas de las enzimas, así como su relación con la temperatura y el pH, encontraremos con frecuencia casos en la enzimología alimentaría en los que se promueve o se reprime la acción de enzimas propias del alimento. Finalmente, un mercado en plena expansión lo representan los reactivos analíticos. En efecto, mediante el uso de una enzima o el acoplamiento de dos o más de ellos es posible cuantificar mas de 30 sustancias , algunas de ellas de importancia en el control de calidad de alimentos; por ejemplo los ácidos ascórbico, láctico cítrico, succínico, almidón, colesterol, lactosa, lecitina, maltosa, sorbitol, rafinosa, glucosa, fructosa etc. ReCiTeIA - v.9 n.1 38 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 10. UTILIZACIÓN DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA. Badui, (2006) describe que: De las miles de enzimas conocidas, solo algunas decenas se producen a escala industrial, para emplearse en la manufacture tanto de alimentos como de materias primas. Cada día aumenta el numero de reacciones industriales que se efectúan por rutas enzimáticas, principalmente debido a la posibilidad que existe hoy en dia de expresar cualquier gene en microorganismos modificados genéticamente. El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: a) son muy especificas en su manera de actuar, por lo que no propician reacciones secundarias indeseables; b) funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drásticas que puedan alterar la naturaleza del alimento, ni de equipo muy costoso; c) actúan en muy bajas concentraciones, entre 10"8 y 10"6 M; d) su velocidad puede ser controlada al ajustar el pH, la temperatura y la concentración de enzima, y e) son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de transformación desea-do.41 En algunos casos es deseable operar a las enzimas en ambientes extremos, como en el caso de la hidrólisis del almidón, que se gelatiniza a 110-120°C o en síntesis orgánica en presencia de solventes y en ambientes de baja disponibilidad de agua. Una limitante importante para el uso de enzimas es que algunas de ellas son muy caras por su baja disponibilidad, sin embargo, es conveniente hacer un balance de los costos y las ventajas que trae consigo llevar a cabo una determinada reacción con enzimas, para definir la viabilidad. Cabe indicar que en este sentido hay muchas innovaciones tecnológicas que están logrando hacer mas económicos estos catalizadores, como es el caso de la ingeniería genética que permite transformar microorganismos y plantas para aumentar la síntesis de enzimas o bien, la reutilización de estas cuando se encuentran inmovilizadas en un soporte, lo que constituye un biocatalizador. Al igual que cualquier otro aditivo alimenticio, las enzimas deben cumplir con determinadas especificaciones de calidad, sobre todo en cuanto a su toxicidad, o a la del microorganismo que la produce, en caso de que sea de origen microbiano.35 Debido a que las enzimas que se emplean en la industria, no son puras (resulta muy costosa su purificación completa), es preciso tomar en consideración todos los materiales adicionales ReCiTeIA - v.9 n.1 39 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA que pudieran contener; por esta razón, una preparación enzimatica comercial es en realidad una mezcla de proteínas, entre las que se encuentra la que presenta la actividad deseada. Una de las ventajas que ofrece la obtención de enzimas por fermentación es que muchos microorganismos las producen extracelularmente, es decir, las segregan de la célula, lo que hace que su recuperación sea sencilla. Sin embargo, en otros casos las enzimas son intracelulares y es precise romper las células para su extracción. En ambos casos el extracto crudo se disuelve en un amortiguador acuoso y las enzimas se precipitan por la adición de disolventes orgánicos, como etanol o acetona, c con sales como sulfate de amonio; los precipitados se recuperan por filtración o centrifugación y se secan al vació o se liofilizan. La recuperación de las enzimas se debe llevar a cabo en condiciones tales que no provoquen perdida de la actividad catalítica. Cuando se desea obtener enzimas mas puras se recurre a métodos cromatograficos mediante los cuales las proteínas se separan de acuerdo con su carga, tamaño, interacciones hidrofobicas e incluso su especificidad. Dado que la presencia de la enzima no necesariamente implica que este activa (puede estar presente en forma desnaturalizada), los productos enzimáticos se comercializan de acuerdo con si: potencia catalítica; generalmente se estandarizan a una cierta actividad y se les añaden agentes estabilizantes (propilenglicol, sorbitol, glicerol). También se les pueden adicionar cloruro de sodio o benzoatos para evitar el crecimiento microbiano y conservarlos en el almacenamiento. 10.1 ENZIMAS DE IMPORTANCIA EN ALIMENTOS. Badui, (2006) menciona: Algunos de los aspectos más relevantes de las enzimas cuyas actividades son importantes en la conservación y procesamiento de alimentos o en la producción de materias primas. Se revisaran a las enzimas que hidrolizan carbohidratos, enzimas que hidrolizan proteínas, a las que hidrolizan lípidos y otras reacciones ReCiTeIA - v.9 n.1 40 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA enzimáticas que son importantes en sistemas alimenticios. En el cuadro 5.10 se presenta un resumen de las aplicaciones mas importantes de enzimas en alimentos. Tabla 4. Algunas de las aplicaciones de enzima en la industria de los alimentos. ReCiTeIA - v.9 n.1 41 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Tomado de Badui, (2006). 11. ASPECTOS PARA POSIBLES INVESTIGACIONES. La manipulación genética del ADN tiene un aspecto muy importante en la producción de enzimas a través de microorganismos. Ya la clonación consiste en obtener el gen que codifica para la proteína de interés. Ahora una vez el gen clonado puede ser sometido a modificaciones en su secuencia con el fin de aumentar la termo estabilidad, mejorar la eficiencia catalítica o modificar la especificidad enzimática. Teniendo en cuenta estos aspectos la modificación genética puede traer varios avances a la ingeniería de alimentos en donde manipulando enzimas como la proteasa alcalina, Amilasa, Lipasa, pueden traer grandes avances hacia los alimentos. ReCiTeIA - v.9 n.1 42 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 12. CONCLUSIONES. 1. Las enzimas son catalizadores de origen biológico que cumplen muchos requisitos para impulsar nuevas industrias químicas. 2. Los procesos enzimáticos tienen múltiples aplicaciones, como fabricación de alimentos, los progresos que están realizando actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar el desarrollo cada vez mayor del uso de las enzimas. 3. La utilización de enzimas en los alimentos presentan una serie de ventajas, además de las de índole económico y tecnológico. 4. Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de acción que se desee obtener. 5. Las fuentes de enzimas pueden ser de origen vegetal, animal o microbiano. 6. se puede manipular genéticamente, la biosíntesis de enzimas para optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas normas. 7. La producción de enzimas a gran escala tiene su principal aplicación en la industria de la fermentación. ReCiTeIA - v.9 n.1 43 CERÓN ET AL ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 13. BIBLIOGRAFIA. (1) Badui, S. (2006), Química de los Alimentos. Pearson,(4 Ed). Mexico, (pp. 301-362). (2) Gacesa, P. & Hubble, J. (1990). Tecnología de las Enzimas. Acribia S.A . España. (pp 15 – 115). (3) Garcia, M.& Qintero, R & Lopez- Mungria , A. (2004). Biotecnología Alimentaría. Limusa S.A. . México D:F. (4) Madriñan. C. (1988) .Química de Alimentos. Facultad de Ingeniería – Universidad del Valle. Colombia. (pp 301-341). (5) Quintero. A. (1987). Tecnología Enzimática Aplicación en Alimentos y Medicina. Universidad Nacional Autónoma de México. México.(pp 17-27). (6) Conn E, & Stumpf P. K. . (1996) Bioquímica fundamental México Limusa S. A., (4ª ed.) México. ReCiTeIA - v.9 n.1 44